許潔 劉杰 汪長東

重慶醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，腫瘤與分子醫(yī)學(xué)中心，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，重慶 400016

骨是經(jīng)歷不斷成骨細胞構(gòu)建和破骨細胞降解的組織。炎癥會擾亂骨骼的新陳代謝并促進骨丟失，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、炎癥性腸病和其他疾病等[1]。炎癥性疾病對骨骼產(chǎn)生影響，增加骨折風(fēng)險。炎癥反應(yīng)使得細胞因子被激活，如干擾素、白介素、趨化因子等，這些炎癥性細胞因子激活骨骼降解并抑制骨骼生成。C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)是Pentraxin家族的一種古老且高度保守的蛋白。血漿CRP主要在肝臟中產(chǎn)生，由肝細胞對諸如白介素IL-1β和IL-6炎癥性細胞因子的響應(yīng)而合成[2]。臨床實踐中，CRP是典型的急性期反應(yīng)標志物，半衰期短。但CRP如何影響骨組織，至今仍不清楚。細胞原纖毛與骨發(fā)育聯(lián)系密切。原纖毛是從細胞表面突出的基于微管的小型細胞器。它們充當觸角，通過位于原纖毛膜上的各種表面受體來感應(yīng)細胞外信號，如生長因子和激素，通過正向轉(zhuǎn)運蛋白Kinesin-Ⅱ?qū)⑿盘枏脑w毛的底部轉(zhuǎn)運到原纖毛的頂部，或者逆向轉(zhuǎn)運蛋白Dynein將信號從原纖毛頂部轉(zhuǎn)運到原纖毛底部[3]。原纖毛缺陷會導(dǎo)致纖毛疾病，如窒息性窘迫呼吸綜合癥和短肋骨多趾綜合癥Ⅲ，提示纖毛在骨骼發(fā)育中起著不可或缺的作用[4-5]。CRP體外是否影響成骨細胞增殖和分化以及是否通過原纖毛尚未報道。據(jù)此，筆者研究CRP對成骨細胞增殖、分化作用，進而發(fā)現(xiàn)炎癥環(huán)境是否對成骨增殖和分化有影響以及如何影響，為CRP應(yīng)用于檢測炎癥誘發(fā)的骨丟失疾病診斷提供理論依據(jù)，為治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 顱骨細胞獲取

1.1.1顱骨細胞分離、培養(yǎng)：動物操作按照重慶醫(yī)科大學(xué)IACUC批準的規(guī)程進行。3～4 d的Sprague-Dawley(SD)乳鼠通過二氧化碳安樂死。在無菌臺中取出乳鼠的顱蓋骨，去除骨膜及周圍結(jié)締組織，PBS沖洗4～5次并剪成細小碎塊。并將I型膠原酶(2 mg/mL，EMD，Darmstadt，Germany)和胰蛋白酶(0.25%，Corning，Manassas，VA)按1∶1混合，全程在37 ℃恒溫水浴鍋上消化1～2 h。1 000 r/min離心5 min，棄上清液保留沉淀。用PBS洗2次，然后離心分離并鋪板于含10%胎牛血清(FBS)，100 U/mL青霉素和1 mg/mL鏈霉素的α-MEM中。將細胞置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后觀察細胞貼壁狀態(tài)，更換培養(yǎng)液，棄去未貼壁的細胞及殘留的骨組織碎塊，以后每3 d觀察細胞狀態(tài)，更換培養(yǎng)基一次。待細胞布滿視野80%，鏡下觀察細胞形態(tài)并拍照。

1.1.2茜素紅染色：OS培養(yǎng)基誘導(dǎo)成骨分化21 d。OS培養(yǎng)基是由α-MEM(Gibco)其中包含10%FBS，10 mmol/L β-甘油磷酸(Sigma，St Louis，MO)，50 μg/mL抗壞血酸(Sigma)和10-8mol/L地塞米松(Sigma)組成的。在用OS培養(yǎng)基誘導(dǎo)21 d，去除培養(yǎng)基，PBS漂洗貼壁細胞3次，將細胞用5%多聚甲醛固定10 min。PBS漂洗3次，室溫下用40 mmol/L茜素紅S溶液(pH 4.4)染色，并用去離子水沖洗兩次。細胞用10 mmol/L磷酸鈉(pH 7.0)中的等量10%(w/v)的cetylpyridinium chloride(sigma)脫色15 min。然后將等體積的所需溶液轉(zhuǎn)移至96孔板，562 nm測定吸光度。

1.2 免疫熒光

細胞爬片(American)用酒精消毒烤干放置于24孔板上，將細胞以4×104細胞/孔的密度接種，CRP(5 mg/mL)處理細胞3 d。PBS洗滌3次，4%甲醇固定10 min，PBS洗滌3次。為避免非特異性結(jié)合，5%BSA孵育60 min。Ki-67抗體(1∶200，Santa cruze)，α-微管蛋白抗體(1∶1 000，T6793，Sigma)和γ-微管蛋白抗體(1∶1 000，T3320，Sigma)4 ℃孵育過夜。lexa Fluor 568偶聯(lián)的抗兔抗體(1∶1 000，A-11011，Invitrogen)和Alexa Fluor 647偶聯(lián)的抗小鼠抗體(1∶1 000，A-21235，Invitrogen)作為二抗室溫孵育1 h。DAPI的抗褪色染液(1∶1 000，Sigma)復(fù)染細胞核，使用Leica DM4000顯微鏡觀察細胞并照像。

1.3 蛋白質(zhì)印跡

收集CRP處理3 d后細胞的總蛋白，BCA蛋白測定試劑盒(Pierce，Rochford，IL)測量蛋白濃度。10%SDS-PAGE凝膠分離。25 mmol/L Tris，192 mmol/L甘氨酸和20%甲醇的緩沖液中，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%的牛奶封閉，一抗在4 ℃孵育過夜，乙酰化的α-微管蛋白抗體(1∶1 000，T6793，Sigma)和γ-微管蛋白抗體(1∶1 000，T3320，Sigma)檢測原纖毛，OPN(1∶200，225952-1-AP，Proteintech)和ALP(1∶1 000，Cat A5111，Selleckchem)檢測成骨分化，GAPDH(1∶1 000，YT5052，ImmunoWay)作為對照，然后與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的山羊抗兔IgG抗體(1∶10 000，A-11034，Novex，Carlsbad，CA)或辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG抗體(1∶5 000，#7074，Cell Signaling Technology)室溫孵育1 h?？梢暬褂肳estern Bright ECL HRP(Advansta，San Jose，CA，USA)進行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準誤差表示。對兩組進行比較的Studentt檢驗分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。使用GraphPad Prism程序(GraphPad Software，Inc，San Diego，USA)進行分析。

2 結(jié)果

2.1 成功分離并培養(yǎng)原代ROB

取出生3～4 d的SD大鼠乳鼠顱骨組織提取原代ROB，α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下，剛分離的ROB呈圓球形漂浮在培養(yǎng)基內(nèi)。24 h后，成骨細胞貼壁，細胞展開(圖1A)，3 d后細胞布滿視野，貼壁的細胞呈梭形、三角形和多邊形(圖1B)。傳代后細胞逐漸展開，體積增大。細胞5 d能鋪滿培養(yǎng)皿底，最后重疊生長，呈鋪路石狀(圖1C)。14 d后成骨鈣化結(jié)節(jié)在一定區(qū)域內(nèi)堆集成灶，與茜素紅S溶液反應(yīng)可見橙紅色鈣化結(jié)節(jié)，著色中間深周圍淺，多個鈣化結(jié)節(jié)可相互融合。比例尺為100 μm(圖1D)。

圖1 成功分離并培養(yǎng)原代ROB

2.2 CRP抑制成骨細胞增殖

用或不用CRP(5 mg/mL)將ROB細胞處理3 d。用DAPI復(fù)染細胞核，Ki-67抗體與ROB胞漿上的Ki-67抗原結(jié)合，表現(xiàn)為胞漿內(nèi)散在分布的綠色熒光。比例尺為100 μm(圖2A)；用Image J對上述兩組細胞Ki67相對熒光表達水平進行定量分析，對照組與處理組相比Ki-67的平均表達量分別是7.124±0.580、2.360±0.148(P<0.001，n=3)。處理組熒光水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，n=3；圖2B)。這些數(shù)據(jù)表明，CRP抑制ROB細胞的增殖。

圖2 CRP抑制成骨細胞增殖

2.3 CRP抑制成骨細胞分化

單純用OS培養(yǎng)基或與5 mg/mL的CRP作用21 d后對ROB進行茜素紅染色。結(jié)果顯示，經(jīng)過21 d成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，CRP處理組細胞鈣結(jié)節(jié)沉積明顯少于對照組未用CRP組的細胞鈣結(jié)節(jié)(圖3A)；顯微光鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)。比例尺為100 μm(圖3B)；基于3A圖的茜素紅染色的定量礦化水平，對照組茜素紅定量為4.06±0.17，處理組茜素紅定量為2.54±0.26，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，n=3；圖3C)；用或不用5 mg/mL的CRP處理3 d后，對ROB中OPN和ALP表達的蛋白質(zhì)印跡分析(圖3D)；基于3 d免疫印跡中OPN和ALP蛋白水平的定量分析。OPN和ALP的蛋白質(zhì)水平被標準化為GAPDH。蛋白免疫印跡顯示，對照組的OPN蛋白定量為67.77±3.39，處理組的OPN蛋白定量為44.93±2.25，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，n=3；圖3E)；蛋白免疫印跡顯示，對照組的ALP蛋白定量為151.65±7.58，處理組的ALP蛋白定量為103.77±5.19，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，n=3；圖3E)。這些數(shù)據(jù)表明，5 mg/mL濃度的CRP抑制ROB成骨分化。

圖3 CRP抑制成骨細胞分化

2.4 CRP激活成骨細胞原纖毛

對用或不用CRP處理的ROB中原纖毛長度進行免疫熒光分析。原纖毛用乙酰化α-微管蛋白(纖毛軸突，綠色)和γ-微管蛋白(基體，紅色)抗體染色。該圖顯示了基體和軸突的高倍圖像。DAPI染色用作復(fù)染(藍色)。比例尺為20 μm(圖4 A)；對細胞原纖毛長度進行定量分析。結(jié)果顯示，處理組原纖毛長度長于對照組原纖毛長度，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，n=3；圖4B)；用或不用CRP處理ROB，對原纖毛代表蛋白進行免疫熒光分析。比例尺為100 μm(圖4C)；用Image J對圖4C視野上的纖毛表達量進行定量分析。處理組熒光強度強于對照組，相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，n=3；圖4D)；對原纖毛代表蛋白進行蛋白質(zhì)印跡分析(圖4E)；基于圖4D免疫印跡結(jié)果的定量分析。纖毛蛋白水平用GAPDH標準化。蛋白免疫印跡顯示，處理組乙?；?微管蛋白和γ-微管蛋白表達高于對照組，相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，n=3；圖4F)；這些數(shù)據(jù)表明，5 mg/mL濃度的CRP異常激活了ROB原纖毛。

圖4 CRP激活成骨細胞原纖毛

3 討論

炎癥是局部和全身性骨質(zhì)流失的主要且高度被忽視的原因，最終可能導(dǎo)致殘疾和死亡。本研究結(jié)果表明，炎癥因子CRP可以抑制成骨細胞增殖和成骨分化從而導(dǎo)致骨丟失，這是通過增加細胞原纖毛表達介導(dǎo)的。炎癥的特征是產(chǎn)生炎癥因子，其可以激活骨分解并抑制骨生成[6]。CRP是炎癥和組織損傷的敏感的全身性標志物，文獻表明，炎性疾病與全身性骨質(zhì)疏松癥和骨折率增加有關(guān)[7]。本研究在SD乳鼠ROB細胞中檢查了CRP在骨組織中的作用，發(fā)現(xiàn)CRP抑制SD乳鼠ROB增殖和成骨分化。

參照Fang等[8]、Yoshida等[9]、Jimenez等[10]的研究，本實驗提取出生3～4 d SD乳鼠顱骨原代細胞ROB，用5 mg/mL濃度的CRP處理ROB。結(jié)果顯示，與對照組比，CRP處理的ROB在3 d時免疫熒光檢測Ki-67熒光強度明顯降低，表明CRP抑制成骨細胞增殖，與Chen等[7]的結(jié)果相符。與本研究結(jié)果一致的是，Jimenez等[11]確定了CRP顯著增強了髓樣衍生細胞抑制CD3/CD28刺激的T細胞增殖的能力。重要的是，CRP還使新鮮分離的原代人中性粒細胞能夠抑制自體T細胞的增殖，加劇小鼠急性腎損傷。同樣，Tang等[12]發(fā)現(xiàn)，在急性腎臟損傷(AKI)缺血/再灌注小鼠模型中CRP含量明顯增加且抑制腎小管上皮細胞(TEC)再生，在人TEC系(HK-2)中添加CRP也同樣抑制G1/S依賴的TEC增殖再生。但是，不管在體內(nèi)或體外，關(guān)于CRP對成骨細胞增殖的影響的數(shù)據(jù)很少，CRP對骨組織的影響研究不明朗。這項研究結(jié)果進一步表明，CRP可能是炎癥引發(fā)的骨丟失的重要因素，CRP抑制成骨細胞增殖。

就成骨分化而言，茜素紅染色實驗是檢測成骨細胞分化成熟的最重要指標。骨橋蛋白(OPN)是在骨形成過程中礦化過程的后期產(chǎn)生的，是成骨分化過程的關(guān)鍵蛋白。堿性磷酸酶是一種膜結(jié)合酶，用于水解焦磷酸鹽，為細胞提供必需的無機磷酸鹽(Pi)。本研究結(jié)果顯示5 mg/mL的CRP處理組均出現(xiàn)了比對照組明顯減少的礦化結(jié)節(jié)數(shù)以及OPN和ALP含量的降低。實驗結(jié)果證實CRP顯著減弱成骨細胞的礦化能力。與本研究觀點相符的是，Liang等[13]在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中發(fā)現(xiàn)，來氟米特可以誘導(dǎo)AHR-ARNT相互作用，從而抑制CRPL關(guān)節(jié)炎大鼠的肝CRP產(chǎn)生并減輕骨侵蝕。同樣，Liang等[13]向CRP H CIA大鼠關(guān)節(jié)內(nèi)注射PBS，IgG對照或抗CRP抗體。發(fā)現(xiàn)與IgG或PBS相比，抗CRP抗體可減輕CRP H大鼠的骨質(zhì)侵蝕和骨吸收，并防止骨質(zhì)流失，充分說明CIA大鼠通過CRP導(dǎo)致骨侵蝕[13]。有研究直接指出，CRP可以誘發(fā)關(guān)節(jié)炎兔的炎癥延長，并直接促進破骨細胞的形成，引起骨丟失[14]。這些研究表明，CRP和骨丟失之間有著密切的聯(lián)系，盡管CRP的因果作用仍然不確定。

眾所周知，原纖毛的結(jié)構(gòu)影響物質(zhì)交換。原纖毛長度變化預(yù)示原纖毛功能改變[15]。本研究的一個新的重要發(fā)現(xiàn)是CRP通過增加細胞原纖毛的表達來引起骨丟失，原纖毛是骨組織損傷的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，ROB被CRP處理后，細胞原纖毛比以往的成骨細胞增長甚至變多，提示炎癥可能導(dǎo)致成骨細胞原纖毛發(fā)生變化，從而導(dǎo)致骨丟失。Zhou等[16]發(fā)現(xiàn)經(jīng)由Wnt10b/β-catenin信號傳導(dǎo)的成骨促進作用取決于成骨細胞中原纖毛的功能完整性。Moore等[17]發(fā)現(xiàn)骨膜祖細胞促進成年小鼠負荷誘導(dǎo)的骨形成，并需要原纖毛感知機械刺激。另一方面，Baek等[18]通過研究脂多糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的神經(jīng)炎癥發(fā)現(xiàn)原纖毛調(diào)控了炎癥介質(zhì)的表達。同樣，Wann等[19]發(fā)現(xiàn)在炎癥因子白細胞介素-1(IL-1)作用下原纖毛的增長，測試原纖毛參與介導(dǎo)下游炎癥反應(yīng)，結(jié)果表明原纖毛調(diào)節(jié)炎癥因子反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)表明，原纖毛參與了炎癥與骨丟失的調(diào)節(jié)，而本研究發(fā)現(xiàn)CRP通過激發(fā)細胞原纖毛表達破壞骨生成過程。

大多數(shù)慢性炎性疾病的原因尚不清楚，因此必須使用專門針對炎性過程的治療策略。如上所述，促炎細胞因子不僅在炎癥的最終途徑中起作用，而且還影響成骨細胞的活性，導(dǎo)致全身性骨丟失。因此，減少和理想地消除炎癥仍然是重要的治療目標。本研究應(yīng)用酶消化法獲得SD大鼠乳鼠顱骨細胞，傳代2次后用于后續(xù)實驗，主要研究了5 mg/mL的CRP對SD大鼠乳鼠顱骨細胞ROB的增殖、成骨分化和基質(zhì)礦化的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在5 mg/mL濃度下CRP對細胞增殖能力，成骨分化抑制。同時，CRP使細胞原纖毛蛋白含量急劇增多，細胞原纖毛數(shù)量增加，長度變長，CRP促進了細胞原纖毛的表達。總之，本研究結(jié)果表明，CRP可能不僅是炎癥標志物，還是導(dǎo)致骨丟失的致病介質(zhì)。CRP通過促進細胞原纖毛的表達來抑制成骨細胞增殖和成骨分化，因此CRP或可成為檢測骨丟失的指標之一，成骨細胞原纖毛可能為炎癥引起的一系列骨病提供潛在的治療靶點。