馬騰 陳德強(qiáng) 王衛(wèi)國

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院, 山東 濟(jì)南 250355

2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨科, 山東 濟(jì)南 250355

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)作為一種全身性骨代謝疾病，以單位骨量減少為特征，伴隨骨微觀結(jié)構(gòu)的退化，參與因素復(fù)雜多樣[1]。國內(nèi)調(diào)查研究[2]顯示全國范圍內(nèi)OP的總患病率約為6.6%～19.3%，且隨著我國老齡化趨勢漸顯，預(yù)計(jì)未來30年國內(nèi)OP患者人數(shù)將高達(dá)2.12億。我國關(guān)于慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)的流行病學(xué)調(diào)查表明，患病人群的比例隨著年齡區(qū)間增長而急劇上升[3]。骨質(zhì)疏松與慢性心衰是有著密切關(guān)系的兩類慢性疾病，一項(xiàng)納入165例觀察對(duì)象的對(duì)比研究[4]發(fā)現(xiàn)，老年慢性心衰患者更易出現(xiàn)骨質(zhì)疏松,且其心衰級(jí)別與骨密度呈負(fù)相關(guān)。

骨質(zhì)疏松癥與慢性心衰之間既存在諸如年齡、營養(yǎng)狀況和體力活動(dòng)等高重合度的影響因素[5]，也存在氧化應(yīng)激反應(yīng)(oxidative stress，OS)、甲狀旁腺素(parathyroid hormone，PTH)異常等相同的病理機(jī)制[6-9]。骨鈣素、骨橋蛋白等骨源性因素亦能夠參與心血管系統(tǒng)的能量代謝，對(duì)心血管病變的程度有著多向調(diào)節(jié)作用[10]。應(yīng)用生物信息學(xué)整合骨質(zhì)疏松癥及慢性心衰的基因數(shù)據(jù)，不僅能較為科學(xué)的從分子層面闡述二者間的作用機(jī)制，而且也能夠?yàn)樗幬锿瑫r(shí)干預(yù)這兩種疾病提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 骨質(zhì)疏松癥-慢性心力衰竭的相關(guān)靶點(diǎn)篩選

分別在三大人類疾病數(shù)據(jù)庫(GeneCards、TTD、OMIM)中篩選骨質(zhì)疏松癥與慢性心力衰竭的相關(guān)靶點(diǎn)[11-13]。其中GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)所得Relevance Score值的高低與該靶點(diǎn)-疾病聯(lián)系的密切程度呈正相關(guān)，為提高準(zhǔn)確性，僅選擇GeneCards數(shù)據(jù)庫中score值排名前300的靶基因；僅篩取TTD數(shù)據(jù)庫中(http://db.idrblab.net/ttd/)藥物狀態(tài)為驗(yàn)證成功或正處臨床試驗(yàn)的靶基因；在OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/)的Gene Map高級(jí)搜索中篩選疾病相關(guān)靶基因。隨后將兩組基因分別通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)轉(zhuǎn)換成Uniprot ID篩選已認(rèn)證靶點(diǎn)同時(shí)合并去重，獲得已明確認(rèn)證的疾病靶點(diǎn)。

1.2 骨質(zhì)疏松癥-慢性心力衰竭靶點(diǎn)映射與PPI分析

將兩組靶點(diǎn)映射以篩取交集靶點(diǎn)，并將其上傳至STRING v11.0平臺(tái)(https://string-db.org)構(gòu)建蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)模型[14]。將PPI網(wǎng)絡(luò)TSV格式導(dǎo)進(jìn)Cytoscape3.7.2平臺(tái)后，運(yùn)用平臺(tái)自帶工具欄(tools)中的網(wǎng)絡(luò)分析儀(network analyzer)，在非定向網(wǎng)絡(luò)條件下，按照節(jié)點(diǎn)連接度(degree)高低排列靶點(diǎn)大小及色彩度，按照綜合得分值(combined score)排列連線的粗細(xì)及色彩度，隨后在數(shù)據(jù)面板(table panel)中選取degree值≥11的靶點(diǎn)制作核心靶點(diǎn)圖。

1.3 骨質(zhì)疏松癥-慢性心力衰竭的KEGG通路分析

Metascape數(shù)據(jù)庫(http://metascape.org/gp/index.html)是一個(gè)集基因注釋、分析于一體的數(shù)據(jù)資源平臺(tái)，且每月更新其數(shù)據(jù)以確保時(shí)效性[15]。將兩組疾病靶點(diǎn)分別上傳至該平臺(tái)并設(shè)置P<0.01、富集因子(enrichment factor)>1.5，以進(jìn)行兩組疾病的KEGG通路分析。按P值升序排列分別篩取兩病的前35條KEGG通路以取交集，提取分析結(jié)果并利用Cytoscape3.7.2平臺(tái)將數(shù)據(jù)可視化并構(gòu)建骨質(zhì)疏松癥-慢性心力衰竭交互通路圖。

2 結(jié)果

2.1 骨質(zhì)疏松癥-慢性心力衰竭的靶點(diǎn)篩選結(jié)果

從GeneCards、TTD、OMIM數(shù)據(jù)庫分別獲得骨質(zhì)疏松癥相關(guān)靶點(diǎn)300、29、42個(gè)，慢性心力衰竭相關(guān)靶點(diǎn)300、11、487個(gè)；經(jīng)過Uniprot ID轉(zhuǎn)換篩選后分別獲得骨質(zhì)疏松癥有效靶點(diǎn)281、19、16個(gè)，慢性心力衰竭有效靶點(diǎn)292、7、240個(gè)。合并去重后共獲得295個(gè)骨質(zhì)疏松癥有效靶基因，509個(gè)慢性心力衰竭相關(guān)靶基因。

2.2 骨質(zhì)疏松癥-慢性心力衰竭靶點(diǎn)映射與PPI分析結(jié)果

映射骨質(zhì)疏松癥與慢性心力衰竭相關(guān)靶點(diǎn)，得到82個(gè)交集靶點(diǎn)并生成韋恩圖(圖1)。經(jīng)STRING v11.0平臺(tái)在0.9高信度下生成相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)(圖2)，82個(gè)靶點(diǎn)之間有264條相互作用關(guān)系。以篩選節(jié)點(diǎn)連接度(degree)≥11篩選到核心靶點(diǎn)18個(gè)(圖3)，所獲核心靶點(diǎn)均直接或間接影響慢性心力衰竭與骨質(zhì)疏松。

圖1 CHF與OP映射交集靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 交集靶點(diǎn)互相作用PPI網(wǎng)絡(luò)圖(0.9高信度)

圖3 核心靶點(diǎn)圖(核心靶點(diǎn)大小為degree值大小)

2.3 骨質(zhì)疏松癥-慢性心力衰竭的KEGG通路分析結(jié)果

經(jīng)Metascape數(shù)據(jù)庫分別獲得骨質(zhì)疏松癥和慢性心力衰竭KEGG信號(hào)通路167、187條，以P值升序排列分別篩取前35條KEGG通路，共篩選出交互通路23條，同時(shí)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2平臺(tái)構(gòu)建骨質(zhì)疏松癥-慢性心力衰竭交互通路圖(圖4、表1)。

表1 骨質(zhì)疏松癥與慢性心力衰竭的23條交互通路

圖4 骨質(zhì)疏松癥與慢性心力衰竭的交互通路

3 討論

通過對(duì)近年來臨床資料的分析，發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥和慢性心衰這兩類疾病相互關(guān)聯(lián)、相互影響[16]。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)尋找兩病龐大基因網(wǎng)絡(luò)中的交集部分，通過映射得出骨質(zhì)疏松癥與慢性心衰的核心交集靶點(diǎn)為VEGFA、STAT3、IL6、TNF、ESR1、IL10等；通過KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松癥與慢性心衰之間涉及多條共同信號(hào)通路，包括PI3K-Akt信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、血液剪切力與動(dòng)脈粥樣硬化通路和糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路等。

VEGFA作為一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，在心臟發(fā)育、血管生成、調(diào)節(jié)血管通透性等方面均起到重要作用，VEGFA的下調(diào)表達(dá)被認(rèn)為是引起心血管疾病的因素之一[17]；國外有研究[18]表明，VEGFA在骨骼血液供應(yīng)中承擔(dān)重要作用，VEGFA下調(diào)是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的原因之一。STAT3參與心力衰竭過程的機(jī)制十分廣泛，心肌細(xì)胞凋亡、心肌能量代謝、炎癥細(xì)胞因子、腎素-血管緊張素系統(tǒng)等均受到STAT3的調(diào)節(jié)[19]；在骨修復(fù)、骨重塑等過程中，STAT3同樣有著重要價(jià)值，Nicolaidou等[20]發(fā)現(xiàn)通過上調(diào)STAT3的局部表達(dá)，可以對(duì)成骨細(xì)胞的形成起到正向作用。IL6、TNF、IL10等炎癥細(xì)胞因子所參與的炎癥反應(yīng)是骨質(zhì)疏松癥和慢性心衰的共有病理機(jī)制之一。早期的國外研究[21-22]已經(jīng)表明，IL6和TNF-α等炎性標(biāo)志物的水平與慢性心衰患者的NYHA分級(jí)直接相關(guān)，IL10則可以通過對(duì)炎癥因子的抑制作用而調(diào)護(hù)心衰患者的心肌組織[23]；同樣，TNF和IL6憑借其多效性在骨重塑過程中體現(xiàn)重要作用[24]，其中TNF-α可以從多種途徑促進(jìn)破骨細(xì)胞形成，還會(huì)通過抑制骨保護(hù)素(OPG)的合成而降低骨量[25]，IL6能夠激發(fā)破骨細(xì)胞增殖作用，還可以通過作用于RANK-RANKL功能軸來阻礙OPG的表達(dá)，進(jìn)而推動(dòng)骨質(zhì)疏松的形成[26]，IL10則被證明能夠減緩破骨細(xì)胞活性而成為小鼠骨質(zhì)疏松程度的正向因素[27]。Fatima等[28]發(fā)現(xiàn)ESR1對(duì)脂肪組織中的VEGFA有積極調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而推動(dòng)血管生成、減緩炎性反應(yīng)；雌激素(estrogen)與其受體ESR1結(jié)合后的通過多機(jī)制、多途徑參與調(diào)節(jié)骨代謝、提高骨密度的作用也被廣泛證實(shí)[29]。

PI3K-Akt信號(hào)通路被認(rèn)為是成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間功能關(guān)系的核心通路，對(duì)骨組織的相對(duì)穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著重要作用[30]。強(qiáng)勝林等[31]通過對(duì)補(bǔ)腎固本方研究發(fā)現(xiàn)抑制PI3K/AKT/m TOR信號(hào)通路激活，可以保護(hù)小梁結(jié)構(gòu)作用，下調(diào)破骨細(xì)胞分化；楊嘉豪等[32]在對(duì)溫陽消飲方的研究中表明，調(diào)控PI3K-Akt信號(hào)通路可以減緩相關(guān)細(xì)胞凋亡，對(duì)心功能的提升及心肌損傷的緩控都有正面作用。FoxO同樣屬于促炎因子相關(guān)通路一種，參與包括骨質(zhì)疏松及慢性心衰的炎癥調(diào)節(jié)。孫振雙[33]發(fā)現(xiàn)通過藥物抗氧化應(yīng)激作用下調(diào)FoxO的轉(zhuǎn)錄水平，可以刺激成骨能力，并一定程度上減緩骨代謝率；易登良等[34]關(guān)于硫氫化鈉(NaHS)的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通過對(duì)FoxO1信號(hào)通路施加影響，可以實(shí)現(xiàn)調(diào)控細(xì)胞自噬、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等過程進(jìn)而保護(hù)心肌的目的。國內(nèi)外均有研究[35-36]表明，HIF-1通路活性程度與破骨細(xì)胞水平呈正相關(guān)，而慢性心衰炎性反應(yīng)所致局部長期低氧狀態(tài)，亦可以使HIF-1通路水平上調(diào)，加重心臟損傷度。MAPK信號(hào)通路在心肌細(xì)胞的多種生理病理過程中被廣泛涉及，通過調(diào)節(jié)MAPK通路傳導(dǎo)能夠改善心肌纖維化，從而對(duì)慢性心衰的調(diào)治具有重要意義[37]；MAPK信號(hào)通路與間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)等具有成骨分化功能的細(xì)胞關(guān)系密切，有研究[38]顯示膠原蛋白肽(collagen peptide)可以由該通路介導(dǎo)，上調(diào)成骨細(xì)胞和MSCs的分化水平。綜上所述，骨質(zhì)疏松癥和慢性心衰與諸多信號(hào)通路相互關(guān)聯(lián)、相互影響。

本研究依據(jù)生物信息學(xué)找到骨質(zhì)疏松癥與慢性心力衰竭的關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)及信號(hào)通路，并通過基因可視化，能夠更加清晰的表達(dá)兩者的相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，還可以為藥物同時(shí)調(diào)控這兩種疾病提示潛在靶點(diǎn)。當(dāng)然，這種基因靶點(diǎn)的信息整合受限于生物信息技術(shù)的發(fā)展水平及疾病數(shù)據(jù)庫的時(shí)效性，同時(shí)對(duì)于基因表達(dá)量及激活程度等也需隨數(shù)據(jù)的完善而進(jìn)一步開展研究。