黃永湘 李強 李寶林* 陶永亮

1.儋州市人民醫(yī)院骨科，海南 儋州 571700

2.海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科，海南 海口 570216

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是女性絕經(jīng)后常見的原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥[1]，對患者身心健康造成極大影響[2-3]。紅景天苷是中藥紅景天的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、促進血管形成的作用，可抑制低氧環(huán)境誘導(dǎo)的成骨細胞凋亡[4]，并可減輕去卵巢導(dǎo)致的PMOP大鼠骨吸收，提高骨密度，改善其骨丟失癥狀[5]，但其作用機制目前并未闡釋清楚。炎癥在PMOP患者發(fā)病過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，PMOP患者血清中促炎因子水平顯著升高，抑制炎癥是治療PMOP的一個有效手段[6]。PI3K/Akt是調(diào)控機體炎癥的主要信號通路，并參與介導(dǎo)PMOP的發(fā)生發(fā)展，抑制PI3K/Akt通路激活，可抑制血管形成，進而加重PMOP的骨丟失癥狀，因而PI3K/Akt通路是PMOP的的一個治療靶點。但激活PI3K/Akt信號、抑制炎癥發(fā)生發(fā)展是否是紅景天苷治療PMOP的藥理機制目前并不清楚。為此，本研究將通過建立PMOP大鼠模型進一步開展相關(guān)探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：64只SD雌性大鼠購自廣州相觀生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK(粵)2018-0043，SPF清潔級，體重(240±20)g。所有大鼠均在海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)動物實驗室動物房中飼養(yǎng)，溫度為22 ℃～25 ℃，相對濕度為50 %～60 %，大鼠自由進食、飲水，12 h/12 h間斷照明，定期添加飼料及飲用水，經(jīng)常更換墊料，清潔鼠籠，使動物房環(huán)境清潔、安靜、通風(fēng)良好。

1.1.2主要試劑及儀器:紅景天苷購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，貨號JOT-10012；LY294002購自美國MCE公司，貨號HY-10108；大鼠IL-6及TNF-α ELISA試劑盒、、羊抗兔二抗兔源抗GAPDH、PI3K、p-PI3K、AKT及p-AKT一抗購自美國Abcam公司，貨號為ab100772、ab100785、ab150077、ab181602、ab151549、ab138364、ab179463、ab38449；BCA試劑盒、HE染色試劑盒、RIPA裂解液購自上海碧云天公司，貨號為P0011、C0105、P0013K等。CM3050 S切片機購自德國徠卡公司；SMZ745光學(xué)顯微鏡購自日本尼康公司；F30400-60灰化爐購自賽默飛世爾科技公司；MX-0580-骨科生物力學(xué)測試儀購自江蘇摩信工業(yè)系統(tǒng)有限公司；XElx800酶標(biāo)儀購自美國 Perkin Elmer 公司；1659001蛋白電泳儀及Trans-Blot Turbo轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司；Centrifuge 5424R低溫高速離心機購自德國Eppendorf股份公司；GIS-500凝膠成像儀購自Miulab公司等。

1.2 方法

1.2.1動物模型制備及分組給藥：參考文獻[9]，以腹腔注射2.5 %戊巴比妥鈉溶液的方法麻醉SD大鼠，劑量為45 mg/kg，將麻醉后的大鼠俯臥固定于鼠板，消毒、備皮后，經(jīng)背部正中切開口腹腔，分離移除雙側(cè)卵巢，接著止血、縫合后消毒，術(shù)后肌肉注射青霉素預(yù)防感染，每天一次，連續(xù)3 d。3個月后，檢測骨組織形態(tài)學(xué)變化，出現(xiàn)骨小梁稀疏斷裂、數(shù)目明顯減少，有較多空隙、不能連接成網(wǎng)等病理損傷，表明模型制備成功。共建模52只，成功48只，隨機分為模型組、LY294002(PI3K/Akt通路抑制劑)組、紅景天苷組、紅景天苷+LY294002組，每組12只，另取12只僅做切口后縫合處理，設(shè)為假手術(shù)組。紅景天苷組大鼠以25 mg /kg[10]的劑量肌肉注射紅景天苷，同時以0.3 mg/kg[11]的劑量尾靜脈注射生理鹽水；LY294002組大鼠以0.3 mg/kg的劑量尾靜脈注射LY294002，同時以25 mg /kg的劑量肌肉注射生理鹽水；紅景天苷+LY294002組大鼠以25 mg /kg的劑量肌肉注射紅景天苷，同時以0.3 mg/kg的劑量尾靜脈注射LY294002；假手術(shù)組與模型組大鼠以0.3 mg/kg的劑量進行尾靜脈注射生理鹽水，同時以25 mg /kg的劑量進行肌肉注射生理鹽水，每天一次，持續(xù)21 d。

1.2.2大鼠骨組織形態(tài)學(xué)檢測和標(biāo)本收集：給藥結(jié)束24 h后，以5 mL注射器從尾靜脈取血2 mL，靜置10 min，離心得到血清，于-80 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆?；麻醉后處死大鼠，取出大鼠兩?cè)股骨，去除附著組織，以生理鹽水漂洗干凈，將右側(cè)股骨備用；將左側(cè)股骨截斷后，以刮匙刮取斷面處骨組織約0.5 g于液氮中儲存?zhèn)溆?。然后? %多聚甲醛溶液固定左側(cè)股骨遠端組織，并將其依次置于梯度乙醇(從低濃度到高濃度)中脫水，再經(jīng)二甲苯透明、石蠟包埋后進行切片，得到不脫鈣骨組織常規(guī)病理切片，選取完好典型的切片，做脫蠟、高濃度到低濃度乙醇浸泡處理，參照試劑盒說明書的操作步驟進行HE染色，再一次做脫水、透明處理后封片，采用普通光學(xué)顯微鏡觀察骨組織形態(tài)，任選5個視野采集圖像。

1.2.3大鼠右側(cè)股骨骨生物力學(xué)檢測：通過骨科生物力學(xué)測試儀測定右側(cè)股骨骨生物力學(xué)，將股骨水平放置在測試儀的兩個支撐點上，跨度為20 mm，下壓探頭至股骨中段直至其斷裂，加載速率為10 mm/min，同時避開股骨上微小的裂縫，以儀器自帶的軟件記錄并分析數(shù)據(jù)，得出骨生物力學(xué)指標(biāo)彈性模量、最大載荷、屈服載荷的數(shù)值。

1.2.4大鼠骨礦鹽含量檢測：將之前取得的股骨置于烤箱烘烤至恒重，稱量得出干重，然后轉(zhuǎn)移至灰化爐中灰化36 h，溫度為650 ℃，取出灰分稱量得到灰分重量，骨礦鹽含量=灰分重量/干重。

1.2.5大鼠TNF-α、IL-6水平檢測：將儲存?zhèn)溆玫难逄崆胺胖迷? ℃冰箱解凍，以大鼠ELISA試劑盒檢測其中IL-6和TNF-α水平，具體步驟參照說明書進行。

1.2.6大鼠骨組織PI3K/Akt通路蛋白表達檢測：將儲存?zhèn)溆玫墓墙M織經(jīng)剪碎后置于蛋白裂解液中，冰水浴中勻漿，獲得勻漿液，離心提取總蛋白并測定其濃度，具體步驟參照BCA試劑盒說明書。加入蛋白上樣緩沖液，煮沸5 min，進行變性，取含相同質(zhì)量的各組總蛋白樣品液上樣，110 V恒壓電泳，分離蛋白，110 V恒壓濕轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)移全部蛋白至PVDF膜，使用5 %脫脂奶粉室溫孵育2 h，做封閉處理，然后根據(jù)分子量截取目的蛋白條帶，置于小盒中并做好標(biāo)記，以稀釋比均為1∶1 500的兔源抗鼠GAPDH、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT一抗在4 ℃下孵育過夜，TBST溶液漂洗3次，將條帶置于稀釋比為1∶2 000的羊抗兔二抗溶液中，在搖床上室溫孵育2 h，TBST溶液漂洗3次，經(jīng)增強化學(xué)發(fā)光法顯色，以凝膠成像系統(tǒng)拍照，采集蛋白條帶的圖像并以Quantity One軟件進行分析，得出蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠骨組織形態(tài)學(xué)變化

對照組大鼠骨組織形態(tài)正常，模型組大鼠骨組織呈現(xiàn)骨小梁稀疏斷裂、數(shù)目明顯減少，有較多空隙、不能連接成網(wǎng)等病理損傷。與模型組相比，紅景天苷組大鼠骨組織病理損傷減輕，LY294002組大鼠骨組織病理損傷加重。與LY294002組相比，紅景天苷+LY294002組大鼠骨組織病理損傷減輕。與紅景天苷組相比，紅景天苷+LY294002組大鼠骨組織病理損傷加重。見圖1。

圖1 HE染色檢測各組大鼠骨組織形態(tài)學(xué)

2.2 各組大鼠骨生物力學(xué)比較

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠股骨彈性模量、最大載荷、屈服載荷顯著降低(P<0.05)。與模型組相比，紅景天苷組大鼠股骨彈性模量、最大載荷、屈服載荷升高(P<0.05)，LY294002組大鼠股骨彈性模量、最大載荷、屈服載荷降低(P<0.05)。與LY294002組相比，紅景天苷+LY294002組大鼠股骨彈性模量、最大載荷、屈服載荷升高(P<0.05)。與紅景天苷組相比，紅景天苷+LY294002組大鼠股骨彈性模量、最大載荷、屈服載荷降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠骨生物力學(xué)指標(biāo)

2.3 各組大鼠骨礦鹽含量比較

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠骨礦鹽含量顯著降低(P<0.05)。與模型組相比，紅景天苷組大鼠骨礦鹽含量升高(P<0.05)，LY294002組大鼠骨礦鹽含量降低(P<0.05)。與LY294002組相比，紅景天苷+LY294002組大鼠骨礦鹽含量升高(P<0.05)。與紅景天苷組相比，紅景天苷+LY294002組大鼠骨礦鹽含量降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠骨礦鹽含量

2.4 各組大鼠血清IL-6、TNF-α水平比較

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清中IL-6、TNF-α水平顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，紅景天苷組大鼠血清中IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05)，LY294002組大鼠血清中IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05)。與LY294002組相比，紅景天苷+LY294002組大鼠血清中IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05)。與紅景天苷組相比，紅景天苷+LY294002組大鼠血清中IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠血清IL-6、TNF-α水平

2.5 各組大鼠骨組織PI3K/Akt通路蛋白表達比較

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠骨組織中PI3K/Akt通路蛋白p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt顯著降低(P<0.05)。與模型組相比，紅景天苷組大鼠骨組織中PI3K/Akt通路蛋白p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt升高(P<0.05)，LY294002組大鼠骨組織中PI3K/Akt通路蛋白p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt降低(P<0.05)。與LY294002組相比，紅景天苷+LY294002組大鼠骨組織中PI3K/Akt通路蛋白p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt升高(P<0.05)。與紅景天苷組相比，紅景天苷+LY294002組大鼠骨組織中PI3K/Akt通路蛋白p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt(P<0.05)。見圖2、表4。

圖2 各組大鼠骨組織中PI3K/Akt通路蛋白免疫印跡檢測結(jié)果

表4 各組大鼠骨組織中PI3K/Akt通路蛋白相對表達

3 討論

中國PMOP的發(fā)病率逐年遞增，嚴(yán)重危險婦女的身心健康，給患者家庭及社會造成極大負擔(dān)，因而對PMOP的防治具有重要的臨床意義[13-14]。本研究通過摘除卵巢建立PMOP大鼠模型，結(jié)果顯示，建模大鼠骨組織呈現(xiàn)骨小梁稀疏斷裂、數(shù)目明顯減少，有較多空隙、不能連接成網(wǎng)等病理損傷，血清IL-6及TNF-α水平顯著升高，股骨彈性模量、最大載荷、屈服載荷、骨礦鹽含量均顯著降低，表明去除大鼠卵巢可促使炎性因子TNF-α、IL-6[15]大量合成釋放，引起炎癥反應(yīng)，使骨礦化降低，破壞骨生物力學(xué)，損傷骨組織，揭示模型建立成功。

臨床防治PMOP的常用藥物為雌激素及孕激素，兩者單獨或聯(lián)合使用能恢復(fù)骨代謝平衡，提高骨密度，改善骨質(zhì)疏松癥狀，但長期使用可能導(dǎo)致子宮內(nèi)膜增生、乳腺癌、肺栓塞、冠心病等副作用，因而尋找較為安全的中藥是治療PMOP的新思路[16]。中醫(yī)理論認(rèn)為，女性進入絕經(jīng)期后，脾腎虧虛功能漸衰，進而導(dǎo)致骨量丟失，防治PMOP應(yīng)以益氣健脾、補腎壯骨為主[10]。紅景天是補益脾腎藥中上品，可理氣補腎，補諸不足，其活性成分紅景天苷能顯著促進人成骨樣MG-63細胞增殖及成骨分化，并可促進骨形成，抑制骨吸收，緩解糖尿病性骨質(zhì)疏松大鼠牙槽骨丟失，對包括PMOP在內(nèi)的各種骨質(zhì)疏松均有較好的療效[5,17-18]，但其藥理機制目前還未研究清楚。PI3K/Akt通路可調(diào)控細胞代謝、凋亡及分化、炎癥、血管形成等多種生理病理過程，對骨代謝平衡也具有關(guān)鍵的調(diào)控作用，激活PI3K/AKT信號可誘導(dǎo)成骨細胞表達VEGF，促使血管生成，并可促進成骨前體細胞增殖及成骨分化，增強骨形成，提高骨密度，進而改善骨質(zhì)疏松癥狀[19-20]，因此推測紅景天苷可能通過調(diào)控PI3K/Akt通路改善PMOP的臨床癥狀。本研究結(jié)果表明，紅景天苷可激活PI3K/Akt信號，減輕PMOP大鼠骨組織病理損傷，降低血清炎癥因子水平，提高骨礦鹽含量，改善骨生物力學(xué)。以PI3K/Akt通路抑制劑LY294002及紅景天苷聯(lián)合處理PMOP大鼠后，結(jié)果顯示，大鼠骨組織病理損傷比單獨應(yīng)用紅景天苷重，但比單獨應(yīng)用LY294002輕；血清IL-6及TNF-α水平比單獨應(yīng)用紅景天苷高，但比單獨應(yīng)用LY294002低；骨生物力學(xué)指標(biāo)彈性模量、最大載荷及屈服載荷、骨礦鹽含量比單獨應(yīng)用紅景天苷低，但比單獨應(yīng)用LY294002高，表明紅景天苷對PMOP大鼠骨組織病理損傷、炎癥、骨礦化水平低及骨生物力學(xué)低等臨床癥狀的改善作用，可被PI3K/Akt通路抑制劑阻斷。揭示激活PI3K/Akt通路，進而抑制炎癥反應(yīng)，可能是紅景天苷改善PMOP臨床癥狀的藥理機制之一。

綜上所述，紅景天苷可能通過上調(diào)PI3K/Akt通路活化，阻止炎癥發(fā)生發(fā)展，促使骨礦化，提高骨生物力學(xué)，減輕PMOP大鼠骨組織損傷，改善其臨床癥狀，對PMOP的臨床治療具有一定的參考價值。紅景天苷及PI3K/Akt信號不僅可調(diào)控炎癥的發(fā)生發(fā)展，也可介導(dǎo)血管新生、成骨分化等過程，但本研究未對此進行詳細探討，且對其藥物毒副作用等情況也未進行相關(guān)評價，存在一定不足。因而，關(guān)于紅景天苷防治PMOP準(zhǔn)確完整的藥理機制和對其毒副作用的探討還有待后續(xù)深入研究。