溫明韜 梁學(xué)振 李嘉程 李剛,2 許波*

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355

2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院顯微骨科，山東 濟(jì)南 250014

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是指骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致骨痛及并發(fā)脆性骨折的一種全身性代謝性骨病。據(jù)統(tǒng)計，全球40 %的絕經(jīng)后婦女和30 %的男性都會發(fā)生OP[1]。在人口老齡化程度不斷加劇的背景下，OP的發(fā)病率逐年上升，我國50歲以下人群的OP發(fā)病率為15 %～50 %，60歲以上老年人為56%[2]，總患病率為6.6 %～19.3 %，平均為13 %[3]。OP導(dǎo)致的疼痛及繼發(fā)的脆性骨折嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量，已經(jīng)成為了嚴(yán)重影響中老年人健康的慢性病之一。近年來眾多學(xué)者從分子生物學(xué)角度研究中醫(yī)藥治療OP的療效并取得了顯著進(jìn)展，進(jìn)一步證明了中醫(yī)藥在OP治療過程中的積極作用。

《黃帝內(nèi)經(jīng)》記載：“骨者，腎之合也；髓者，精之所生也”。骨的正常生長發(fā)育與腎精的充盈密切相關(guān)，因此在臨床中對于虛癥骨病多采用補(bǔ)腎益精的治療準(zhǔn)則。六味地黃丸出自宋代錢乙《小兒藥證直訣》，具有補(bǔ)腎滋陰的作用，被認(rèn)為是肝腎陰虛證骨質(zhì)疏松癥的代表藥物[4]。

本研究旨在基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法下，通過數(shù)據(jù)分析及生物信息學(xué)理論的指導(dǎo)，篩選六味地黃丸治療OP的化學(xué)有效成分及疾病相關(guān)靶點(diǎn)，并對治療過程中的高相關(guān)性靶點(diǎn)富集分析，采用分子對接技術(shù)擬合藥物有效成分與靶點(diǎn)蛋白分子間的結(jié)合活性，探討六味地黃丸抗骨質(zhì)疏松癥的潛在有效成分及分子作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 藥物成分的獲取和篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理分析平臺[5](TCMSP，http://tcmspw.com/)，分別獲得六味地黃丸組方中熟地黃、山藥、山茱萸、茯苓、澤瀉、牡丹皮的化學(xué)有效成分。根據(jù)毒藥物動力學(xué)參數(shù)(ADME)[6]對上述成分進(jìn)行篩選，定義篩選條件為藥物口服利用度≥ 30 %、藥物相似度≥ 0.18[7-8]，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)完善數(shù)據(jù)。

1.2 藥物成分靶點(diǎn)預(yù)測及疾病靶點(diǎn)的獲取

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫中藥物有效成分靶點(diǎn)預(yù)測，獲得上述1.1中獲得的藥物化學(xué)有效成分的作用靶點(diǎn)。完成Uniprot標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換后，獲得化學(xué)有效成分的預(yù)測靶點(diǎn)，使用網(wǎng)絡(luò)可視化軟件Cytoscape對活性成分及其作用靶點(diǎn)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和網(wǎng)絡(luò)特征分析，以明確六味地黃丸中活性成分與靶點(diǎn)的作用關(guān)系。

以“Osteoporosis”作為搜索詞在DisGeNET(http：//www.disgenet.org/)、CTD(http://ctdbase.org/)、GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(http://www．omim．org/)、PharmGKB(https://www.pharmgkb.org/)、GAD(https://geneticassociationdb.nih.gov/)、KEGG(https://www.kegg.jp/)等與疾病靶點(diǎn)相關(guān)的數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索及篩選，綜合數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)并保留唯一值，獲得已知的OP疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析

將關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING[9](http:/string-db.org/)蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫中，物種定義為“Homo sapiens”，置信值設(shè)定為≥ 0.7，進(jìn)行關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)分析，并將所得的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件，分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)值，篩選度值(DC值)前十位的靶點(diǎn)作為網(wǎng)絡(luò)中的重要靶點(diǎn)。

1.4 Pathway富集分析

將1.3中獲取的關(guān)鍵靶點(diǎn)上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫[10](database for annotation, visualization and integrated discovery，DAVID)進(jìn)行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析，條件值設(shè)置為P<0.05。選取富集分析排名前10的通路繪制氣泡圖。

1.5 關(guān)鍵靶點(diǎn)與藥物成分的分子對接驗證

選擇PPI網(wǎng)絡(luò)中度值前十位的靶點(diǎn)蛋白，并反向?qū)ふ疫@些靶點(diǎn)蛋白在蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中對應(yīng)的化學(xué)活性成分，驗證這些關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白與化學(xué)有效成分的結(jié)合活性。

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得化學(xué)活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并使用Chem 3 D軟件完成力學(xué)優(yōu)化。檢索RESB PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.Rcsb.org/)獲取靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)文件，物種定義為“Homo sapiens”，優(yōu)先選擇具有原始配體小分子且小分子結(jié)構(gòu)與對接化學(xué)活性成分有較高相似度的蛋白。通過Pymol軟件對檢索獲得的靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行去水、加氫等修飾操作后導(dǎo)入Autodock軟件中計算總電荷數(shù)，輸出為pdbqt格式。利用AutoDock Vina軟件對接模式圖，根據(jù)格點(diǎn)參數(shù)文件，使用autogrid4查看模式圖內(nèi)容，選擇“Genetic algorithm”計算方法，通過Autodock Vina運(yùn)行分子對接，依據(jù)對接結(jié)合能的數(shù)值確定全局最優(yōu)結(jié)合構(gòu)象，利用PyMOL將對接結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 六味地黃丸藥物潛在活性成分

通過1.1中的數(shù)據(jù)庫平臺，經(jīng)檢索及條件篩選，共獲得六味地黃丸組方中的化學(xué)有效成分69個。其中，熟地黃2個，山茱萸20個，山藥16個，牡丹皮11個，茯苓15個，澤瀉10個。

2.2 六味地黃丸藥物活性成分靶點(diǎn)預(yù)測

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫中的靶點(diǎn)預(yù)測功能，經(jīng)過數(shù)據(jù)篩選及去除重復(fù)值處理后，獲得六味地黃丸組方中的化學(xué)有效成分的預(yù)測靶點(diǎn)共128個。利用Cytoscape軟件完成六味地黃丸組方的化學(xué)有效成分及預(yù)測靶點(diǎn)的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。其中，活性成分及作用靶點(diǎn)共存在682個相互作用關(guān)系、203個作用靶標(biāo)。

圖1 六味地黃丸組方活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 骨質(zhì)疏松癥疾病作用靶點(diǎn)

通過1.3中的疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫，將各個數(shù)據(jù)庫所獲靶點(diǎn)取并集后篩重處理，共獲得OP疾病靶點(diǎn)1 476個。通過“藥物-疾病”靶點(diǎn)韋恩圖(圖2)，可獲得兩者交集靶點(diǎn)共81個。

圖2 藥物預(yù)測靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的韋恩圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

六味地黃丸組方治療OP的PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)中共有節(jié)點(diǎn)81個，互作關(guān)系916條，度值(DC值)排名前十位的靶點(diǎn)蛋白分別為IL6、TP53、VEGFA、TNF、JUN、MAPK1、EGF、EGFR、ESR1、CAT，將其定義為該P(yáng)PI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖中的核心靶點(diǎn)(表1)。

圖3 六味地黃丸治療OP的PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

表1 六味地黃丸治療OP的關(guān)鍵靶點(diǎn)(節(jié)點(diǎn)度值排序前10位)

2.5 Pathway富集分析結(jié)果

本研究通過DAVID數(shù)據(jù)庫完成上述PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)的富集分析，提示整體的治療過程存在眾多信號通路的復(fù)合作用，并參與調(diào)控多方面的生物學(xué)進(jìn)程。GO功能富集分析結(jié)果顯示，六味地黃丸對于OP的治療過程的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要富集于雌激素的調(diào)節(jié)反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、藥物代謝、細(xì)胞的抗氧化及抗衰老、細(xì)胞的增殖凋亡等生物學(xué)反應(yīng)。KEGG信號通路富集分析顯示，相關(guān)靶點(diǎn)在TNF、藥物代謝過程、HIF-1、VEGF、FOXO、雌激素調(diào)節(jié)、Toll樣受體等信號通路上顯著富集(圖4)。

圖4 GO功能富集及KEGG通路富集分析

2.6 分子對接結(jié)果

選取PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)，并根據(jù)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)反向?qū)ふ蚁嚓P(guān)成分進(jìn)行分子對接。當(dāng)配體與受體結(jié)合能量越低時，其結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定，相互作用的可能性越大。分子對接結(jié)果驗證表明，有效化學(xué)活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合能均小于-5 kcal/moL(表2)，提示化合物與受體的結(jié)合活性穩(wěn)定。利用Pymol軟件可視化前五位靶點(diǎn)蛋白與活血有效成分的蛋白對接模式圖(圖5)。

表2 活性成分與潛在靶點(diǎn)對接結(jié)果

圖5 網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵靶點(diǎn)分別與其結(jié)合能最低成分生成的對接模式圖

3 討論

隨著我國人口老齡化程度的日益嚴(yán)重，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率呈逐年上升態(tài)勢。且隨著病情的進(jìn)展，骨組織的密度及強(qiáng)度不斷下降，患者出現(xiàn)腰背部甚至全身性骨痛，骨折風(fēng)險增加。中醫(yī)學(xué)一般將骨質(zhì)疏松癥歸于“骨痿”“骨枯”等范疇，主要是由于腎精虧損，髓消骨枯而導(dǎo)致的全身骨量丟失的慢性退行性疾病。中醫(yī)藥治療OP的臨床用藥充分考慮了患者的個性情況，重視患者中醫(yī)證候的演變過程。六味地黃丸在治療肝腎陰虛證OP的過程中發(fā)揮了良好的治療作用。但由于中藥中化學(xué)活性成分眾多且缺乏分子水平研究，其治療過程的作用機(jī)制并不明確。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、生物信息學(xué)與分子對接技術(shù)，通過進(jìn)一步分析六味地黃丸治療OP的活性成分、潛在作用靶點(diǎn)與作用通路研究其分子作用機(jī)制。

研究過程表明，六味地黃丸治療OP可能通過槲皮素、谷甾醇、β-谷固醇、豆甾醇、山奈酚、丁子香萜等多種化學(xué)活性成分，作用于IL6、TP53、VEGFA、TNF、JUN、MAPK1、EGF、EGFR、ESR1、CAT等關(guān)鍵靶點(diǎn)，進(jìn)而調(diào)控雌激素的調(diào)節(jié)反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、血管新生反應(yīng)、細(xì)胞的抗氧化及抗衰老、細(xì)胞的增殖凋亡等生物過程，通過調(diào)控TNF、藥物代謝過程、HIF-1、VEGF、FOXO、雌激素調(diào)節(jié)、Toll樣受體等信號通路發(fā)揮多成分、多靶點(diǎn)、多網(wǎng)絡(luò)的抗骨質(zhì)疏松癥的藥理作用。

“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中高度值的有效成分包括槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等多種化學(xué)活性成分。槲皮素屬于天然黃酮醇類成分，其通過RANKL的活化抑制作用影響OPG/RANK/RANKL機(jī)制，從而抑制破骨細(xì)胞生成，減少骨吸收，穩(wěn)定骨量的動態(tài)平衡[11-12]。β-谷甾醇廣泛存在于多種中藥成分中，具有抗炎、抗氧化、抗雄激素等生理功能，有較好的清除自由基作用，是一種良好的抗氧化劑[13]。林明珠等[14]發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇可通過抑制IL-6、TNF-α和VEGF表達(dá)抑制小鼠移植瘤的增殖。腫瘤壞死因子α(TNF-α)與白介素-6(IL-6)可以誘導(dǎo)RANKL表達(dá)，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，而山奈酚可以抑制TNF-α與白介素-6的分泌，抑制破骨促進(jìn)成骨。關(guān)鍵成分的主要藥理作用與OP的骨重建失衡機(jī)制相對一致。

GO生物過程富集結(jié)果反映了治療過程與細(xì)胞周期過程、炎癥反應(yīng)與雌激素的反應(yīng)調(diào)節(jié)過程有較高的相關(guān)性。其中，雌激素水平與成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞活動密切相關(guān)。在雌二醇反應(yīng)中，當(dāng)雌激素不足時，NF-κB受體活化劑κB配體(RANKL)激活，抑制破骨細(xì)胞凋亡并加速破骨過程。而成骨細(xì)胞通過與雌激素的結(jié)合可以增加其活性，增強(qiáng)成骨過程。相關(guān)研究[15]表明，雌激素水平下降后成骨作用出現(xiàn)明顯下降，而破骨作用未發(fā)生明顯變化，發(fā)生了骨代謝的平衡破壞，導(dǎo)致骨量丟失。雌激素也可以抑制IL6及TNF-α等相關(guān)炎性因子的分泌，從而促進(jìn)成骨、抑制破骨[16]。

KEGG信號通路富集分析結(jié)果中，六味地黃丸組方通過調(diào)控TNF信號通路、HIF-1信號通路、VEGF信號通路等發(fā)揮抗炎、抗氧化、血管內(nèi)皮功能調(diào)節(jié)等生物學(xué)作用，以改善骨質(zhì)疏松癥疾病進(jìn)程中體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。TNF信號通路中的TNF因子作為炎癥急性期反應(yīng)的細(xì)胞因子之一，參與了全身的炎癥反應(yīng)過程，并可以誘導(dǎo)白介素的產(chǎn)生。通過抑制TNF結(jié)合受體降低基質(zhì)金屬蛋白酶，可以抑制軟骨細(xì)胞凋亡及軟骨骨破壞等病理反應(yīng)[17-18]。低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)信號通路是經(jīng)典的多功能信號通路，在骨的形成與吸收方面發(fā)揮了重要作用，可以通過成骨成血管偶聯(lián)調(diào)控骨與血管的再生過程[19]。在細(xì)胞缺氧環(huán)境下，可以廣泛的參與到能量代謝、血管形成和細(xì)胞周期等生物過程中，并且可以有效加強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨成血管分化能力[20]。鐘航等[21]研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制HIF-1信號通路可以遏制絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的進(jìn)一步發(fā)展。VEGF信號通路中的血管內(nèi)皮生長因子(VEFGA)在參與調(diào)控血管通透性、血管內(nèi)皮細(xì)胞的代謝等方面具有重要地位。VEGF作為促血管形成細(xì)胞因子，在骨與軟骨系統(tǒng)中參與調(diào)控骨組織的分化、基質(zhì)生成和細(xì)胞因子的表達(dá)，能夠很好反映成骨活動的狀態(tài)[22]。

分子對接結(jié)果顯示，PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)與其對應(yīng)的化學(xué)有效成分的對接能量均小于-5 kcal/moL，說明六味地黃丸組方中的化學(xué)活性成分與OP的疾病相關(guān)靶點(diǎn)產(chǎn)生較好的蛋白結(jié)合活性。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接的方法學(xué)，通過對六味地黃丸組方成分的藥代動力學(xué)參數(shù)評價和生物學(xué)功能通路富集分析，進(jìn)一步闡明了六味地黃丸通過調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡過程、藥物代謝、雌激素反應(yīng)調(diào)節(jié)與細(xì)胞抗缺氧、抗衰老等生物學(xué)過程，參與治療OP過程的分子機(jī)制。并通過分子對接初步驗證了化學(xué)活性成分與OP疾病靶點(diǎn)的相互作用模式，為后續(xù)的研究奠定了思路基礎(chǔ)。