袁秋虹 羅駿 李娟敏 彭琪媛 鄧偉民
1.廣東藥科大學(xué),廣東 廣州 510010
2.南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院,廣東 廣州 510010
3.廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣東 廣州 510010
4.南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院,廣東 廣州 510010
5.前海人壽廣州總醫(yī)院,廣東 廣州 511300
骨質(zhì)疏松癥 ( osteoporosis,OP) 是常見的骨骼疾病,是一種以骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)損壞以致骨脆性增加易發(fā)骨折為特征的全身性骨病[1]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis, PMO)的發(fā)生與婦女絕經(jīng)后體內(nèi)雌激素水平驟降密切相關(guān),臨床中常用雌激素替代療法防治PMO,但長期應(yīng)用雌激素替代療法會(huì)有子宮內(nèi)膜增生、陰道出血等不良反應(yīng),甚至?xí)黾幼訉m內(nèi)膜癌的患病風(fēng)險(xiǎn),因此人們對(duì)長期應(yīng)用雌激素替代療法防治PMO存在較大顧慮。補(bǔ)腎壯骨顆粒臨床中常用于治療骨質(zhì)疏松癥及更年期綜合征,多年臨床觀察及前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)腎壯骨顆粒對(duì)PMO亦有良好療效,但臨床中一直沒有補(bǔ)腎壯骨顆粒對(duì)子宮內(nèi)膜不良作用的明確報(bào)告。因此,本實(shí)驗(yàn)主要研究補(bǔ)腎壯骨顆粒治療PMO期間對(duì)子宮內(nèi)膜及其雌激素受體α( anti-estrogen receptor alpha antibody, ERα)、雌激素受體β( anti-estrogen receptor beta antibody, ERβ)、G蛋白偶聯(lián)雌激素受體30(anti-G-protein coupled receptor 30, GPCR30)表達(dá)量的影響。
補(bǔ)腎壯骨顆粒(顆粒劑,10 g/包,中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥劑科);鹽酸雷洛昔芬片(易維特,60 mg/片,美國禮來公司);戊酸雌二醇片(補(bǔ)佳樂,1 mg/片,德國先靈公司);anti-estrogen receptor alpha antibody(ERα,英國Abcam公司,ab75635),anti-estrogen receptor beta antibody(ERβ,英國Abcam公司,ab3576),anti-G-protein coupled receptor 30(GPCR30,英國Abcam公司,ab39742);蘇木精伊紅(HE)染色液(leagene,DH0006);美國GE雙能X線骨密度儀[通用電氣(中國)有限公司,Prodigy];全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像儀(廣州光儀生物科技有限公司,BIO-OI600);透反射型系統(tǒng)金相顯微鏡(日本OLYMPUS,BX-51)。
1.2.1動(dòng)物分組及造模:選取6月齡SPF級(jí)SD雌性大鼠60只,體重250~300 g,由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào):SCXK(粵)2016-0041。SD大鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房,投喂SPF級(jí)大鼠飼料及滅菌水,自由攝食。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(sham-operated group,SOG)、模型組(model group,MG)、雷洛昔芬組(raloxifene group,RG)、戊酸雌二醇組(estradiol valerate group,EVG)、中藥組(Chinese medicine group,CMG),每組12只。對(duì)MG、RG、EVG、CMG 4組大鼠實(shí)施雙側(cè)卵巢切除以建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型。具體步驟如下:將10 %水合氯醛以3 ml/kg的劑量行腹腔注射麻醉,腰背備皮,在髂脊直上2 cm與脊柱旁開1 cm交點(diǎn)處縱行開一長約1 cm切口,暴露卵巢,結(jié)扎卵巢下端輸卵管,完整切除卵巢,逐層縫合切口,以5 % 碘附消毒切口;SOG大鼠不切除卵巢,僅去除卵巢附近與卵巢同體積的脂肪組織,其余操作與MG、RG、EVG、CMG 4組保持一致。術(shù)后立即肌肉注射40 kU/(kg·d)青霉素,持續(xù)3 d,防止感染。
1.2.2干預(yù)及取材:造模14 d后,各組大鼠恢復(fù)情況良好,開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)。RG、EVG、CMG的干預(yù)藥品實(shí)驗(yàn)用藥劑量,為臨床用藥劑量通過人與動(dòng)物體表面積比值換算出的等效用藥劑量,RG雷洛昔芬4.29 mg/(kg·d) ,EVG戊酸雌二醇0.071 mg/(kg·d) ,CMG補(bǔ)腎壯骨顆粒2.5 g/(kg·d) ,灌胃量10 ml/kg,SOG和MG灌服等體積生理鹽水,各組灌胃頻率均為1次/d。用藥干預(yù)3個(gè)月后,通過隨機(jī)數(shù)字表法抽取各組半數(shù)大鼠,行10 %水合氯醛麻醉后,活體測(cè)量股骨及全身骨密度。經(jīng)腹主動(dòng)脈采血后將大鼠處死,取出子宮分離多余脂肪,將一側(cè)子宮置于液氮中速凍并放入-80 ℃超低溫冰箱凍存,待后續(xù)檢測(cè);將另一側(cè)子宮用10 %中性甲醇固定,24 h后脫水石蠟包埋。余下半數(shù)大鼠繼續(xù)用藥干預(yù)3個(gè)月(總共6個(gè)月)。
1.2.3檢測(cè)指標(biāo)及方法
1.2.3.1股骨及全身骨密度:將大鼠在麻醉狀態(tài)下行俯臥位固定,舒展脊柱及四肢,進(jìn)行全身骨掃描檢測(cè),記錄股骨及全身骨密度。
1.2.3.2子宮內(nèi)膜厚度及直徑長度:通過HE染色觀察組織結(jié)構(gòu),將子宮石蠟組織塊切片,厚度4 μm,切片二甲苯脫蠟,100 %、90 %、80 %、70 %各濃度乙醇復(fù)水,蘇木精染液染核,伊紅染液染質(zhì),脫水、透明、封片后,顯微鏡下觀察切片形態(tài),并用Cellscan切片成像系統(tǒng)測(cè)量各子宮內(nèi)膜和直徑的最大值、最小值及另兩對(duì)稱點(diǎn),求得平均值即為子宮內(nèi)膜厚度及直徑。
1.2.3.3子宮組織ERα、ERβ、GPCR30蛋白相對(duì)表達(dá)量:通過Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá),取20 mg子宮組織在200 μL含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液(中)冰上充分勻漿裂解,離心取上清,既得總蛋白提取液;測(cè)定總蛋白溶液濃度,以含總蛋白30 μg為上樣量,量取各組上樣體積,按比加入相應(yīng)體積的5×上樣緩沖液,混勻沸水浴5 min;制膠上樣電泳,濃縮膠設(shè)置電壓80 V,分離膠120 V;轉(zhuǎn)膜封閉,5 %脫脂牛奶室溫封閉2 h,一抗孵育,4 ℃過夜,洗膜,二抗孵育,室溫1 h,洗膜;ECL化學(xué)發(fā)光,全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像儀檢測(cè),應(yīng)用圖像處理軟件Image J 7.0 對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析。
MG的股骨及全身骨密度在切除卵巢3個(gè)月后明顯低于SOG,比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;用藥干預(yù)3個(gè)月后,RG、EVG、CMG股骨及全身骨密度低于SOG,其中RG、EVG與SOG的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;RG、EVG、CMG股骨及全身骨密度高于MG,其中RG、CMG與MG的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;用藥干預(yù)6個(gè)月后,RG、EVG、CMG股骨及全身骨密度仍低于SOG,但比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,RG、EVG、CMG股骨及全身骨密度高于MG,比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。
表1 各組大鼠骨密度的結(jié)果
觀察各組大鼠子宮組織HE染色切片,可知用藥3個(gè)月SOG子宮平滑肌層厚度均勻,層次分明內(nèi)環(huán)肌外縱肌界限清晰,肌細(xì)胞排列規(guī)律,肌層血管散在分布,子宮內(nèi)膜厚度適中,間質(zhì)疏松;MG子宮平滑肌層厚薄不一,層次不分明,內(nèi)環(huán)肌外縱肌局部相互交錯(cuò)界限不清晰,肌細(xì)胞排列紊亂,子宮壁呈皺縮狀,肌層血管局部增生擴(kuò)張充血,子宮內(nèi)膜厚度明顯小于SOG,間質(zhì)緊密;RG肌層血管數(shù)量較多內(nèi)膜較薄間質(zhì)較緊密;EVG肌層血管數(shù)量較多內(nèi)膜較??;CMG內(nèi)膜較薄間質(zhì)較緊密。用藥6個(gè)月,各組子宮肌層血管狀態(tài)與用藥3個(gè)月相似,無明顯變化,但子宮內(nèi)膜厚度及直徑出現(xiàn)了不同程度的增長,以EVG最為明顯。
測(cè)量后可知MG子宮內(nèi)膜厚度及直徑在切除卵巢3個(gè)月后明顯小于SOG,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;用藥干預(yù)3個(gè)月后,RG、EVG、CMG子宮內(nèi)膜厚度及直徑小于SOG,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;RG、EVG、CMG子宮內(nèi)膜厚度及直徑大于MG,其中RG、EVG與MG的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用藥干預(yù)6個(gè)月后,RG、CMG子宮內(nèi)膜厚度及直徑仍小于SOG,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;EVG子宮內(nèi)膜厚度及直徑大于SOG,直徑與SOG的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,RG、EVG子宮內(nèi)膜厚度及直徑大于MG,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,CMG子宮內(nèi)膜厚度及直徑大于MG ,直徑與MG的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1~圖4、表2。
表2 各組大鼠子宮內(nèi)膜及直徑的結(jié)果
圖1 用藥3個(gè)月各組大鼠子宮組織HE染色切片圖 (40×)
圖2 用藥3個(gè)月各組大鼠子宮組織HE染色切片圖 (100×)
圖3 用藥6個(gè)月各組大鼠子宮組織HE染色切片圖 (40×)
圖4 用藥6個(gè)月各組大鼠子宮組織HE染色切片圖 (100×)
用藥3個(gè)月后,MG的ERα/β-actin、ERβ/β-actin小于SOG,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,RG、EVG、CMG的ERα/β-actin、ERβ/β-actin大于MG,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,RG、EVG、CMG的GPCR30/β-actin與MG雖有不同程度的差異但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;用藥6個(gè)月,MG的ERα/β-actin、ERβ/β-actin均小于SOG,RG、EVG、CMG的ERα/β-actin、ERβ/β-actin均大于MG,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,MG的GPCR30/β-actin較SOG高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,RG的GPCR30/β-actin大于MG,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,EVG、CMG的GPCR30/β-actin小于MG,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。
表3 各組ERα、ERβ、GPCR30蛋白相對(duì)表達(dá)量
圖5 各組蛋白免疫印跡圖
戊酸雌二醇和雷洛昔芬是臨床應(yīng)用雌激素替代療法防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的常用藥物。戊酸雌二醇是長效雌激素制劑,可緩解去勢(shì)所致雌激素缺乏引起的癥狀,減少絕經(jīng)期骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生,促進(jìn)子宮內(nèi)膜增生、修復(fù)[2]。雷洛昔芬是選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑,對(duì)雌激素作用組織選擇性表現(xiàn)激動(dòng)或拮抗作用,在骨骼表現(xiàn)為激動(dòng)作用,減少骨骼重吸收,降低骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物水平,增加骨密度,對(duì)子宮內(nèi)膜無增生作用[8]。補(bǔ)腎壯骨顆粒是由鄧偉民教授研制的中藥復(fù)方制劑,具有補(bǔ)腎健脾壯骨作用,多年臨床及實(shí)驗(yàn)研究顯示補(bǔ)腎壯骨顆粒對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥有明顯治療作用。由本研究亦可看出補(bǔ)腎壯骨顆粒用藥3個(gè)月后,中藥組的骨密度雖然低于正常的SOG,但顯著高于去勢(shì)的MG,用藥6個(gè)月后,中藥組的骨密度雖然仍低于SOG但差異已無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);分析CMG、RG、EVG的股骨及全身骨密度可知,用藥3、6個(gè)月CMG與RG、EVG的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)),說明補(bǔ)腎壯骨顆粒治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的療效與戊酸雌二醇、雷洛昔芬沒有明顯差異;分析各組子宮內(nèi)膜厚度可知,去勢(shì)后子宮內(nèi)膜厚度會(huì)顯著降低,用藥3個(gè)月,CMG、RG、EVG內(nèi)膜厚度均顯著低于正常的SOG,用藥6個(gè)月,CMG、RG內(nèi)膜厚度仍顯著低于SOG,但EVG子宮內(nèi)膜明顯增厚高于SOG、CMG、RG,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說明長期使用戊酸雌二醇會(huì)使子宮內(nèi)膜增厚,而使用補(bǔ)腎壯骨顆粒和雷洛昔芬則不存在這個(gè)問題。
雌激素受體ERα、ERβ、GPCR30在正常子宮組織和癌變子宮組織中存在差異性表達(dá)。Jarzabek等[3]發(fā)現(xiàn),雌激素核受體ERα和ERβ在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)量較正常組織均有減少,推測(cè)核受體ERα、ERβ與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。并有研究[4]表明,ERα低表達(dá)或表達(dá)缺失與子宮內(nèi)膜癌的惡性轉(zhuǎn)變呈正相關(guān)。Smith等[5]發(fā)現(xiàn),雌激素膜受體GPCR30在癌細(xì)胞過量表達(dá),且表達(dá)量與癌癥的嚴(yán)重程度呈正相關(guān),患者的生存率也隨著GPCR30的超量表達(dá)明顯降低。莊研等[6]亦發(fā)現(xiàn),表達(dá)陰性的腺癌和腺鱗癌組織中GPCR30蛋白也有高表達(dá)。本研究對(duì)子宮內(nèi)膜ERα、ERβ、GPCR30表達(dá)進(jìn)行了研究,用藥3個(gè)月,CMG的ERα/β-actin、ERβ/β-actin雖然小于正常的SOG,但明顯大于去勢(shì)的MG,GPCR30/β-actin在SOG、MG、CMG、RG、EVG的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),用藥6個(gè)月,CMG的ERα/β-actin小于SOG,ERβ/β-actin大于SOG,但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),GPCR30/β-actin在MG、CMG、EVG的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),說明補(bǔ)腎壯骨顆粒不會(huì)導(dǎo)致ERα、ERβ低表達(dá)或表達(dá)缺失,也不會(huì)使GPCR30 過量表達(dá)。
綜上,長期應(yīng)用補(bǔ)腎壯骨顆粒治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥可以提高骨密度,療效與戊酸雌二醇、雷洛昔芬無明顯差異,而且不會(huì)導(dǎo)致子宮內(nèi)膜增厚,也不會(huì)導(dǎo)致ERα、ERβ、GPCR30表達(dá)紊亂。補(bǔ)腎壯骨顆粒作為中藥復(fù)方制劑兼具滋陰補(bǔ)陽、強(qiáng)筋壯骨、祛淤通經(jīng)等作用,用于防治老年性骨質(zhì)疏松癥也有良好療效[7]。