袁秋虹 羅駿 李娟敏 彭琪媛 鄧偉民

1.廣東藥科大學(xué)，廣東 廣州 510010

2.南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，廣東 廣州 510010

3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510010

4.南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510010

5.前海人壽廣州總醫(yī)院，廣東 廣州 511300

骨質(zhì)疏松癥 ( osteoporosis，OP) 是常見的骨骼疾病，是一種以骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)損壞以致骨脆性增加易發(fā)骨折為特征的全身性骨病[1]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis, PMO)的發(fā)生與婦女絕經(jīng)后體內(nèi)雌激素水平驟降密切相關(guān)，臨床中常用雌激素替代療法防治PMO，但長期應(yīng)用雌激素替代療法會有子宮內(nèi)膜增生、陰道出血等不良反應(yīng)，甚至?xí)黾幼訉m內(nèi)膜癌的患病風(fēng)險，因此人們對長期應(yīng)用雌激素替代療法防治PMO存在較大顧慮。補(bǔ)腎壯骨顆粒臨床中常用于治療骨質(zhì)疏松癥及更年期綜合征，多年臨床觀察及前期實驗研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎壯骨顆粒對PMO亦有良好療效，但臨床中一直沒有補(bǔ)腎壯骨顆粒對子宮內(nèi)膜不良作用的明確報告。因此，本實驗主要研究補(bǔ)腎壯骨顆粒治療PMO期間對子宮內(nèi)膜及其雌激素受體α( anti-estrogen receptor alpha antibody, ERα)、雌激素受體β( anti-estrogen receptor beta antibody, ERβ)、G蛋白偶聯(lián)雌激素受體30(anti-G-protein coupled receptor 30, GPCR30)表達(dá)量的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

補(bǔ)腎壯骨顆粒(顆粒劑，10 g/包，中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥劑科)；鹽酸雷洛昔芬片(易維特，60 mg/片，美國禮來公司)；戊酸雌二醇片(補(bǔ)佳樂，1 mg/片，德國先靈公司)；anti-estrogen receptor alpha antibody(ERα，英國Abcam公司，ab75635)，anti-estrogen receptor beta antibody(ERβ，英國Abcam公司，ab3576)，anti-G-protein coupled receptor 30(GPCR30，英國Abcam公司，ab39742)；蘇木精伊紅(HE)染色液(leagene，DH0006)；美國GE雙能X線骨密度儀[通用電氣(中國)有限公司，Prodigy]；全自動化學(xué)發(fā)光成像儀(廣州光儀生物科技有限公司，BIO-OI600)；透反射型系統(tǒng)金相顯微鏡(日本OLYMPUS，BX-51)。

1.2 方法

1.2.1動物分組及造模：選取6月齡SPF級SD雌性大鼠60只，體重250～300 g，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(粵)2016-0041。SD大鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房，投喂SPF級大鼠飼料及滅菌水，自由攝食。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(sham-operated group，SOG)、模型組(model group，MG)、雷洛昔芬組(raloxifene group，RG)、戊酸雌二醇組(estradiol valerate group，EVG)、中藥組(Chinese medicine group，CMG)，每組12只。對MG、RG、EVG、CMG 4組大鼠實施雙側(cè)卵巢切除以建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型。具體步驟如下：將10 %水合氯醛以3 ml/kg的劑量行腹腔注射麻醉，腰背備皮，在髂脊直上2 cm與脊柱旁開1 cm交點處縱行開一長約1 cm切口，暴露卵巢，結(jié)扎卵巢下端輸卵管，完整切除卵巢，逐層縫合切口，以5 % 碘附消毒切口；SOG大鼠不切除卵巢，僅去除卵巢附近與卵巢同體積的脂肪組織，其余操作與MG、RG、EVG、CMG 4組保持一致。術(shù)后立即肌肉注射40 kU/(kg·d)青霉素，持續(xù)3 d，防止感染。

1.2.2干預(yù)及取材：造模14 d后，各組大鼠恢復(fù)情況良好，開始進(jìn)行實驗干預(yù)。RG、EVG、CMG的干預(yù)藥品實驗用藥劑量，為臨床用藥劑量通過人與動物體表面積比值換算出的等效用藥劑量，RG雷洛昔芬4.29 mg/(kg·d) ，EVG戊酸雌二醇0.071 mg/(kg·d) ，CMG補(bǔ)腎壯骨顆粒2.5 g/(kg·d) ，灌胃量10 ml/kg，SOG和MG灌服等體積生理鹽水，各組灌胃頻率均為1次/d。用藥干預(yù)3個月后，通過隨機(jī)數(shù)字表法抽取各組半數(shù)大鼠，行10 %水合氯醛麻醉后，活體測量股骨及全身骨密度。經(jīng)腹主動脈采血后將大鼠處死，取出子宮分離多余脂肪，將一側(cè)子宮置于液氮中速凍并放入-80 ℃超低溫冰箱凍存，待后續(xù)檢測；將另一側(cè)子宮用10 %中性甲醇固定，24 h后脫水石蠟包埋。余下半數(shù)大鼠繼續(xù)用藥干預(yù)3個月(總共6個月)。

1.2.3檢測指標(biāo)及方法

1.2.3.1股骨及全身骨密度：將大鼠在麻醉狀態(tài)下行俯臥位固定，舒展脊柱及四肢，進(jìn)行全身骨掃描檢測，記錄股骨及全身骨密度。

1.2.3.2子宮內(nèi)膜厚度及直徑長度：通過HE染色觀察組織結(jié)構(gòu)，將子宮石蠟組織塊切片，厚度4 μm，切片二甲苯脫蠟，100 %、90 %、80 %、70 %各濃度乙醇復(fù)水，蘇木精染液染核，伊紅染液染質(zhì)，脫水、透明、封片后，顯微鏡下觀察切片形態(tài)，并用Cellscan切片成像系統(tǒng)測量各子宮內(nèi)膜和直徑的最大值、最小值及另兩對稱點，求得平均值即為子宮內(nèi)膜厚度及直徑。

1.2.3.3子宮組織ERα、ERβ、GPCR30蛋白相對表達(dá)量：通過Western blot檢測蛋白表達(dá)，取20 mg子宮組織在200 μL含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液(中)冰上充分勻漿裂解，離心取上清，既得總蛋白提取液；測定總蛋白溶液濃度，以含總蛋白30 μg為上樣量，量取各組上樣體積，按比加入相應(yīng)體積的5×上樣緩沖液，混勻沸水浴5 min；制膠上樣電泳，濃縮膠設(shè)置電壓80 V，分離膠120 V；轉(zhuǎn)膜封閉，5 %脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗孵育，4 ℃過夜，洗膜，二抗孵育，室溫1 h，洗膜；ECL化學(xué)發(fā)光，全自動化學(xué)發(fā)光成像儀檢測，應(yīng)用圖像處理軟件Image J 7.0 對條帶進(jìn)行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠股骨及全身骨密度

MG的股骨及全身骨密度在切除卵巢3個月后明顯低于SOG，比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；用藥干預(yù)3個月后，RG、EVG、CMG股骨及全身骨密度低于SOG，其中RG、EVG與SOG的差異有統(tǒng)計學(xué)意義；RG、EVG、CMG股骨及全身骨密度高于MG，其中RG、CMG與MG的差異有統(tǒng)計學(xué)意義；用藥干預(yù)6個月后，RG、EVG、CMG股骨及全身骨密度仍低于SOG，但比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，RG、EVG、CMG股骨及全身骨密度高于MG，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 各組大鼠骨密度的結(jié)果

2.2 子宮組織切片形態(tài)及直徑和內(nèi)膜厚度

觀察各組大鼠子宮組織HE染色切片，可知用藥3個月SOG子宮平滑肌層厚度均勻，層次分明內(nèi)環(huán)肌外縱肌界限清晰，肌細(xì)胞排列規(guī)律，肌層血管散在分布，子宮內(nèi)膜厚度適中，間質(zhì)疏松；MG子宮平滑肌層厚薄不一，層次不分明，內(nèi)環(huán)肌外縱肌局部相互交錯界限不清晰，肌細(xì)胞排列紊亂，子宮壁呈皺縮狀，肌層血管局部增生擴(kuò)張充血，子宮內(nèi)膜厚度明顯小于SOG，間質(zhì)緊密；RG肌層血管數(shù)量較多內(nèi)膜較薄間質(zhì)較緊密；EVG肌層血管數(shù)量較多內(nèi)膜較??；CMG內(nèi)膜較薄間質(zhì)較緊密。用藥6個月，各組子宮肌層血管狀態(tài)與用藥3個月相似，無明顯變化，但子宮內(nèi)膜厚度及直徑出現(xiàn)了不同程度的增長，以EVG最為明顯。

測量后可知MG子宮內(nèi)膜厚度及直徑在切除卵巢3個月后明顯小于SOG，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；用藥干預(yù)3個月后，RG、EVG、CMG子宮內(nèi)膜厚度及直徑小于SOG，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；RG、EVG、CMG子宮內(nèi)膜厚度及直徑大于MG，其中RG、EVG與MG的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。用藥干預(yù)6個月后，RG、CMG子宮內(nèi)膜厚度及直徑仍小于SOG，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；EVG子宮內(nèi)膜厚度及直徑大于SOG，直徑與SOG的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，RG、EVG子宮內(nèi)膜厚度及直徑大于MG，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，CMG子宮內(nèi)膜厚度及直徑大于MG ，直徑與MG的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1～圖4、表2。

表2 各組大鼠子宮內(nèi)膜及直徑的結(jié)果

圖1 用藥3個月各組大鼠子宮組織HE染色切片圖 (40×)

圖2 用藥3個月各組大鼠子宮組織HE染色切片圖 (100×)

圖3 用藥6個月各組大鼠子宮組織HE染色切片圖 (40×)

圖4 用藥6個月各組大鼠子宮組織HE染色切片圖 (100×)

2.3 ERα、ERβ、GPCR30蛋白相對表達(dá)量

用藥3個月后，MG的ERα/β-actin、ERβ/β-actin小于SOG，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，RG、EVG、CMG的ERα/β-actin、ERβ/β-actin大于MG，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，RG、EVG、CMG的GPCR30/β-actin與MG雖有不同程度的差異但均無統(tǒng)計學(xué)意義；用藥6個月，MG的ERα/β-actin、ERβ/β-actin均小于SOG，RG、EVG、CMG的ERα/β-actin、ERβ/β-actin均大于MG，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，MG的GPCR30/β-actin較SOG高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，RG的GPCR30/β-actin大于MG，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，EVG、CMG的GPCR30/β-actin小于MG，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

表3 各組ERα、ERβ、GPCR30蛋白相對表達(dá)量

圖5 各組蛋白免疫印跡圖

3 討論

戊酸雌二醇和雷洛昔芬是臨床應(yīng)用雌激素替代療法防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的常用藥物。戊酸雌二醇是長效雌激素制劑，可緩解去勢所致雌激素缺乏引起的癥狀，減少絕經(jīng)期骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生，促進(jìn)子宮內(nèi)膜增生、修復(fù)[2]。雷洛昔芬是選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，對雌激素作用組織選擇性表現(xiàn)激動或拮抗作用，在骨骼表現(xiàn)為激動作用，減少骨骼重吸收，降低骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物水平，增加骨密度，對子宮內(nèi)膜無增生作用[8]。補(bǔ)腎壯骨顆粒是由鄧偉民教授研制的中藥復(fù)方制劑，具有補(bǔ)腎健脾壯骨作用，多年臨床及實驗研究顯示補(bǔ)腎壯骨顆粒對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥有明顯治療作用。由本研究亦可看出補(bǔ)腎壯骨顆粒用藥3個月后，中藥組的骨密度雖然低于正常的SOG，但顯著高于去勢的MG，用藥6個月后，中藥組的骨密度雖然仍低于SOG但差異已無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；分析CMG、RG、EVG的股骨及全身骨密度可知，用藥3、6個月CMG與RG、EVG的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05))，說明補(bǔ)腎壯骨顆粒治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的療效與戊酸雌二醇、雷洛昔芬沒有明顯差異；分析各組子宮內(nèi)膜厚度可知，去勢后子宮內(nèi)膜厚度會顯著降低，用藥3個月，CMG、RG、EVG內(nèi)膜厚度均顯著低于正常的SOG，用藥6個月，CMG、RG內(nèi)膜厚度仍顯著低于SOG，但EVG子宮內(nèi)膜明顯增厚高于SOG、CMG、RG，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明長期使用戊酸雌二醇會使子宮內(nèi)膜增厚，而使用補(bǔ)腎壯骨顆粒和雷洛昔芬則不存在這個問題。

雌激素受體ERα、ERβ、GPCR30在正常子宮組織和癌變子宮組織中存在差異性表達(dá)。Jarzabek等[3]發(fā)現(xiàn)，雌激素核受體ERα和ERβ在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)量較正常組織均有減少，推測核受體ERα、ERβ與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。并有研究[4]表明，ERα低表達(dá)或表達(dá)缺失與子宮內(nèi)膜癌的惡性轉(zhuǎn)變呈正相關(guān)。Smith等[5]發(fā)現(xiàn)，雌激素膜受體GPCR30在癌細(xì)胞過量表達(dá)，且表達(dá)量與癌癥的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，患者的生存率也隨著GPCR30的超量表達(dá)明顯降低。莊研等[6]亦發(fā)現(xiàn)，表達(dá)陰性的腺癌和腺鱗癌組織中GPCR30蛋白也有高表達(dá)。本研究對子宮內(nèi)膜ERα、ERβ、GPCR30表達(dá)進(jìn)行了研究，用藥3個月，CMG的ERα/β-actin、ERβ/β-actin雖然小于正常的SOG，但明顯大于去勢的MG，GPCR30/β-actin在SOG、MG、CMG、RG、EVG的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，用藥6個月，CMG的ERα/β-actin小于SOG，ERβ/β-actin大于SOG，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，GPCR30/β-actin在MG、CMG、EVG的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明補(bǔ)腎壯骨顆粒不會導(dǎo)致ERα、ERβ低表達(dá)或表達(dá)缺失，也不會使GPCR30 過量表達(dá)。

綜上，長期應(yīng)用補(bǔ)腎壯骨顆粒治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥可以提高骨密度，療效與戊酸雌二醇、雷洛昔芬無明顯差異，而且不會導(dǎo)致子宮內(nèi)膜增厚，也不會導(dǎo)致ERα、ERβ、GPCR30表達(dá)紊亂。補(bǔ)腎壯骨顆粒作為中藥復(fù)方制劑兼具滋陰補(bǔ)陽、強(qiáng)筋壯骨、祛淤通經(jīng)等作用，用于防治老年性骨質(zhì)疏松癥也有良好療效[7]。