李梁珊,郭依俠,劉世國,王麗娜

(青島大學附屬醫(yī)院,山東 青島 266003 1 醫(yī)學遺傳科； 2 產(chǎn)前診斷中心； 3 兒童保健科； 4 呼吸與危重癥醫(yī)學科)

囊性纖維化(CF)是一種白種人較常見的常染色體隱性單基因遺傳病，常累及肺、胰腺、肝臟、胃腸道及生殖系統(tǒng)等多器官系統(tǒng)[1]，肺部病變是CF病人主要的死亡原因[2]。其臨床特征具有異質性，主要的臨床表現(xiàn)為咳嗽、咳痰、氣管重塑、黏液堆積、胰腺功能不全、營養(yǎng)不良、汗液電解質異常升高、男性不育等[3-5]，有的病人還會出現(xiàn)其他并發(fā)癥，如糖尿病、鼻竇炎、慢性代謝性堿中毒、肝大和肝硬化等表現(xiàn)[6-7]。CF病人診斷根據(jù)是典型的臨床表現(xiàn)、CF家族史、汗液試驗和基因突變檢測結果等。

囊性纖維化跨膜傳導調(diào)節(jié)因子(CFTR)是目前已知的CF致病基因，定位于Chr7q31.2，長188 kb，它含有27個外顯子，編碼含有1 480個氨基酸的CFTR蛋白。自RIORDAN[8]在1989年發(fā)現(xiàn)該基因以來，CFTR基因的結構、功能和突變對蛋白的影響已經(jīng)得到了深入研究。CFTR是一種環(huán)磷酸腺苷(cAMP)依賴的氯離子通道蛋白[9]，控制氯離子和碳酸氫鹽離子進出細胞[10]，表達于氣道、肺、消化道和生殖道等多部位上皮細胞的頂膜[11]。CFTR缺失或功能障礙可導致氯離子轉運功能異常、鈉離子通道調(diào)節(jié)受損，使得陰離子分泌減少，鈉離子和水重吸收增加，導致汗液和黏性分泌物中鹽離子濃度增加，分泌物黏稠，從而堵塞不同的器官系統(tǒng)[7,12]。至今已有2 000多個CFTR基因突變被報道[11]，但是CF基因型和表型之間的關系仍然不夠明確，有待進一步研究。

作為一種高通量的基因測序技術，全外顯子測序(WES)具有成本效益高、準確性較高、測序時間短等優(yōu)勢，現(xiàn)已成為臨床上診斷單基因遺傳病的重要輔助手段。本研究報告一個肺囊性纖維化(PCF)家系，因家系比較小，臨床表現(xiàn)單一，父母均未出現(xiàn)相似癥狀，很難對先證者做出準確診斷并判斷可疑致病基因，所以本研究聯(lián)合采用WES和Sanger測序驗證技術篩查并確定可疑致病基因突變位點，探討疾病基因型和表型的關系。

1 對象和方法

1.1 研究對象

病兒，女，8歲。3年前因反復咳嗽入院治療。病兒反復咳嗽，活動后加重，有痰不易咳出，無咯血，無發(fā)熱，支氣管鏡見大量白色黏痰，無胰腺、腸道、汗腺、肝臟及鼻竇等其他外分泌腺異常表現(xiàn)。既往有卵圓孔未閉史和哮喘史。體格檢查：神志清，口唇無發(fā)紺，雙肺呼吸音粗，未聞及哮鳴音，雙下肺聞及少許濕啰音，心律齊，無雙下肢水腫。行基因檢測后確診為PCF。病兒無兄弟姐妹，父母既往體健，無明顯PCF癥狀，否認家族遺傳史。本研究經(jīng)青島大學附屬醫(yī)院倫理委員會審核批準。

1.2 研究方法

1.2.1外周血DNA提取 獲得家系各成員的書面知情同意后，采集先證者及其父母的外周靜脈血各3 mL，同時采集200例來自山東的健康對照者外周靜脈血各3 mL。采用Tiangen DNA提取試劑盒提取外周血全基因組DNA，嚴格按照說明書要求進行操作。

1.2.2WES 將基因組DNA用超聲波隨機打斷成長度為180～280 bp的片段，向純化后的DNA片段中加入末端補齊體系和多聚核苷酸激酶(PNK)進行末端修復反應，經(jīng)過Agencourt AMpure XP磁珠純化，得到5′端含有磷酸基團的平末端DNA短片段文庫。在已修復DNA片段的3′末端加上A堿基，并將Illumina測序接頭連接至文庫DNA兩端。行PCR反應有效富集兩端都連有接頭的DNA片段。使用Agilent SureSelect Human All Exon V6試劑盒進行全外顯子雜交捕獲，從而捕獲到基因的外顯子，然后應用PCR擴增外顯子DNA文庫。完成橋式PCR之后，利用Illumina平臺PE150(Pair end 150 bp)上機測序，目標區(qū)平均深度為111.360，目標區(qū)覆蓋度為99.90%，并應用生物信息專業(yè)軟件分析測序數(shù)據(jù)。與1 000 genomes、dbSNP數(shù)據(jù)庫中人類基因組參考序列進行比對，尋找可疑的基因突變位點。

1.2.3Sanger測序驗證 將WES篩查到的可疑致病突變在先證者及其父母和200例健康對照者中進行Sanger測序驗證。對突變位點所在外顯子序列進行PCR擴增，用Primer premier 5軟件設計引物。PCR反應體系為20 μL，包括Master Mix 10 μL，上游、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 6 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。擴增完成后，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，若條帶明亮且單一，則使用ABI3730XL測序儀(Applied Biosystems)對PCR產(chǎn)物進行測序。與NCBI(National Center Biotechnology Information)網(wǎng)站上的標準序列進行比對，找出突變位點。

2 結 果

2.1 遺傳學分析

WES遺傳學分析表明，先證者存在兩處錯義突變(c.650A>G/p.Glu217Gly和c.1231A>G/Lys411Glu)分別位于CFTR基因的第6外顯子和第10外顯子，c.650A>G導致217位的谷氨酸變成甘氨酸，c.1231A>G導致賴氨酸在411位變成谷氨酸。Sanger測序驗證表明，母親存在一處c.650A>G/p.Glu217Gly雜合突變，父親則是c.1231A>G/Lys411Glu雜合子攜帶者，先證者的兩處復合雜合突變分別來自父親和母親。這兩處突變均未在200例健康對照個體中檢測到，表明變異在該家族中存在共分離現(xiàn)象。見圖1。查閱相關文獻和數(shù)據(jù)庫，先證者的復合雜合突變在國內(nèi)系首次報道。

2.2 生物信息學分析

從NCBI網(wǎng)站中獲得人、牛、狗、家貓、小家鼠、兔、黑猩猩、豬的CFTR蛋白序列，并用DNAMAN軟件進行多重序列比對。生物信息學的分析結果顯示，突變c.650A>G位于CFTR蛋白的非保守序列中(圖2A)，而突變c.1231A>G位于CFTR蛋白的高度保守區(qū)域(圖2 B)。

3 討 論

CF是由CFTR基因突變導致的一種外分泌腺功能異常的常染色體隱性遺傳病，可累及全身多個器官系統(tǒng)，預后不良。該病以肺部持續(xù)炎癥和反復感染、生長發(fā)育遲緩、脂肪和蛋白質吸收不良、不孕不育、慢性肝病等為主要特征[5-6,12-13]，其中肺和氣道表現(xiàn)是CF最顯著的臨床表現(xiàn)[10]。

本研究通過WES結合Sanger測序驗證的方法，在PCF病人CFTR基因的第6外顯子和第10外顯子發(fā)現(xiàn)了兩處復合雜合突變(c.650A>G/p.Glu217Gly和c.1231A>G/Lys411Glu)，而在200例健康對照者中均未發(fā)現(xiàn)這兩處突變，突變位點在該家系中共分離。LEE[14]研究證實，Glu217Gly突變降低了膜蛋白表達和陰離子轉運活性的60%～70%，而Lys411Glu突變被NAKANO等[15]預測為有害變異。雖然這兩個突變均曾被論述過對蛋白質的結構和功能有較大的影響，但由于本研究未行功能學驗證，因此只能認為這兩處突變是先證者PCF的高度可疑致病突變。

CFTR基因位于Chr7q31.2的長臂上，由27個外顯子組成，全長約188 kb，在上皮細胞表面表達，編碼由1 480個氨基酸組成的CFTR蛋白(氯離子通道蛋白)。CFTR蛋白是ATP結合盒(ABC)轉運蛋白超家族中的一員，由5個結構域組成：包括2個跨膜結構域TMD1/TMD2、1個調(diào)控域R(為磷酸化位點)和2個核苷酸結構域NBD1/NBD2[4,10,16]。CFTR蛋白可以促使氯離子通過黏液產(chǎn)生于上皮細胞的頂膜，但是CFTR突變會影響該蛋白的合成和功能，導致上皮細胞對氯離子的通透性降低、鈉離子重吸收增加，造成黏液黏稠和汗液氯離子濃度異常增高，厚厚的黏液在不同的器官中堆積，使黏液腺導管堵塞，進而引起外分泌腺功能障礙[7,14]。

根據(jù)CFTR的截斷或缺乏、結構和功能，CFTR突變可分為6大類。Ⅰ類突變是由于移碼突變或錯義突變出現(xiàn)新的終止密碼子，影響蛋白的生物合成，產(chǎn)生縮短的功能缺陷的CFTR[7,17]。Ⅱ類突變導致CFTR折疊或成熟障礙，致使缺陷的CFTR在內(nèi)質網(wǎng)被提前降解而不能被運輸至頂膜處[4]，其中最常見的突變是F508del[7,18]。Ⅲ類突變改變CFTR的調(diào)節(jié)，導致蛋白活性降低，使CFTR與ATP結合不能正常進行，從而影響通道的激活[17]。Ⅳ類突變導致蛋白傳導異常。CFTR通道能打開及關閉，但是由于電傳導缺陷，導致氯離子的轉運功能降低[18]。Ⅴ類突變是RNA剪接異常，使功能正常的CFTR數(shù)量減少[16,19]。Ⅵ類突變導致CFTR蛋白的C-末端異常，影響成熟蛋白的穩(wěn)定性，但CFTR的功能和數(shù)量均正常[7,9]。因未進行進一步的蛋白功能學驗證，故不能證實本研究發(fā)現(xiàn)的兩處錯義突變屬于哪一類CFTR突變。

總之，CF是一種累及多系統(tǒng)的復雜疾病，具有臨床異質性，在中國的發(fā)病率很低，對該病進行準確診斷還需借助基因測序技術。隨著技術的發(fā)展，具有準確、高通量、性價比高等特點的WES在單基因遺傳病的檢測和診斷中取得了豐碩的成果，可為遺傳病的明確診斷、個體化治療、遺傳咨詢和產(chǎn)前篩查等提供依據(jù)，具有廣闊的臨床應用前景。本研究結果不僅為CF的臨床診斷和產(chǎn)前篩查提供了依據(jù)，也為CF致病機制和治療方案的進一步研究奠定了堅實的基礎。