郝佳星,彭真,鄒淑花

(青島大學附屬青島市婦女兒童醫(yī)院,山東 青島 266034)

拷貝數(shù)變異是后基因組時代被逐漸認識到的腫瘤性疾病特征性改變。人類基因組有眾多頻率、強度不等的重復序列，而拷貝數(shù)變異被定義為涉及范圍從1 kb到數(shù)Mb不等的基因片段的刪除、插入、復制及多位點變異的改變類型[1-2]。目前研究認為，拷貝數(shù)變異不僅是個體遺傳差異的基礎，也在體細胞惡性轉化、腫瘤發(fā)生、進展及轉移定植中發(fā)揮著重要作用，拷貝數(shù)變異相關指標或可成為理想的腫瘤診斷標志物。磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/AKT是經(jīng)典的腫瘤信號轉導通路，PI3K/AKT通路的高活化與多種腫瘤凋亡抑制、侵襲轉移及促血管生成密切相關，而PI3K是該通路的關鍵分子[3]。在哺乳動物中編碼催化PI3K亞基的8種基因中，只有編碼普遍表達的p110α催化亞基的PIK3CA常有高突變率[4]。突變的PIK3CA持續(xù)活化，上調PI3K/AKT通路水平進而參與腫瘤發(fā)生。既往已有較多關于結直腸癌、乳癌中PIK3CA突變及拷貝數(shù)變異的研究報道，而PIK3CA在卵巢癌、宮頸癌等婦科腫瘤中研究并不多見[3]。本文借助癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫，將臨床樣本數(shù)據(jù)與RNA-Seq數(shù)據(jù)相結合，探討PIK3CA基因拷貝數(shù)異常在卵巢癌、宮頸癌中的表型及信號轉導機制，以期為卵巢癌及宮頸癌惡性進展機制研究及診斷提供思路[5]。

1 材料和方法

1.1 研究對象

相關數(shù)據(jù)自TCGA數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站中下載獲取，檢索TCGA數(shù)據(jù)庫中有關宮頸癌及卵巢癌的 Illumina HiSeq_RNA-Seq測序數(shù)據(jù)并進行打包整理。

1.2 數(shù)據(jù)分析

1.2.1納入研究樣本數(shù)量 在TCGA可視化數(shù)據(jù)庫cBioPortal(https://www.cbioportal.org)中選擇Ovary/Fallopain Tube→Ovarain Epithelial Tu-mor→Ovarain Serous Adenocarcinoma(TCGA, Pan Cancer Atlas)，共獲得了201例符合要求的研究樣本；選擇Cervix→Cervical Squamous Cell Carcinoma(TCGA, Pan Cancer Atlas),共獲得275例符合要求的研究樣本。

1.2.2病人總體樣本及PIK3CA基因的拷貝數(shù)擴增分析 分別選擇Mutations;Putative copy-number alteration from GISTIC;mRNA Expression Zscores,RSEM(Batch normalized from Illumina HiSeq_RNASeqV2)。選擇完畢后提取mRNA表達矩陣，運用R語言的R Bioconductor/DESeq2、ggplot等軟件包進行生物信息學分析，并進行可視化作圖。

1.2.3病理特征分析 在所獲取樣本中，二次檢索宮頸癌及卵巢癌病人中PIK3CA拷貝數(shù)擴增病人與不攜帶該基因拷貝數(shù)變異者的臨床信息，分別收集具有完整病史及臨床病理診斷結果等臨床信息的卵巢癌及宮頸癌病人。

1.2.4卵巢癌、宮頸癌腫瘤信號轉導通路生物信息學發(fā)掘 根據(jù)RNA-Seq數(shù)據(jù)表達矩陣的矩陣分組，比較卵巢癌、宮頸癌PIK3CA拷貝數(shù)擴增病人與不攜帶該基因拷貝數(shù)變異者的基因差異，差異基因表達分析的數(shù)據(jù)要求先進行標準化以避免誤差。所獲得的數(shù)據(jù)使用軟件edgeR(3.12.1)R Bioconductor包進行解析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。采用功能分析(Gene Ontology, GO)方法及通路分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)并富集分析差異基因功能。

1.2.5生存分析 采用Kaplan-Meier及Cox模型對所獲得的樣本進行生存分析，對結果進行Log-rank檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 兩組病人PIK3CA基因的拷貝數(shù)擴增情況

在納入的卵巢癌201例研究樣本中，對17個基因的擴增情況進行分析，擴增前5位的基因分別為PIK3CA(55%，110/201)、PRKCI(48%，96/201)、MYC(41%，82/201)、MECOM(35%，70/201)和KRAS(33%，66/201)，其病理分型均為卵巢上皮性腫瘤。在納入的宮頸癌275例研究樣本中，對17個基因的擴增情況進行分析，擴增前5位的基因分別為PIK3C(62%，170/275)、PRKCI(36%，99/275)、EIF5A2(28%，77/275)、MECOM(19%，52/275)和AKT2(19%，52/275)；病理分型中宮頸鱗狀細胞癌占84.5%，宮頸腺癌占8.8%，宮頸黏液腺癌占5.7%，子宮內膜樣癌占1.0%。病人總體樣本17個基因拷貝數(shù)擴增分布見圖1、2。

2.2 卵巢癌及宮頸癌PIK3CA基因拷貝數(shù)擴增病人的臨床及病理特征

在納入的201例卵巢癌研究樣本中，PIK3CA基因拷貝數(shù)擴增110例；在納入的275例宮頸癌研究樣本中，PIK3CA基因拷貝數(shù)擴增170例。對PIK3CA基因拷貝數(shù)擴增病人的臨床及病理特征分析顯示，PIK3CA基因拷貝數(shù)擴增在卵巢癌及宮頸癌41～60歲年齡病人占比最高，均超過50%。在卵巢癌病人中，PIK3CA基因拷貝數(shù)擴增與不攜帶該基因拷貝數(shù)變異病人腫瘤各病理分級比例接近，其中病理分級為3級者占比均超過80%，而且PIK3CA基因拷貝數(shù)擴增病人的病死率(50.91%)明顯高于不攜帶該基因拷貝數(shù)變異者(39.56%)。而在宮頸癌病人中，PIK3CA基因拷貝數(shù)擴增病人高級別病理分級占比(32.94%)明顯低于不攜帶該基因拷貝數(shù)變異者(53.33%)，而PIK3CA基因拷貝數(shù)擴增病人的病死率(20.49%)低于不攜帶該基因拷貝數(shù)變異者(24.76%)。PIK3CA基因拷貝數(shù)擴增影響卵巢癌病人病死率，而在宮頸癌病人中對腫瘤的病理分級具有顯著影響。見表1。

表1 卵巢癌及宮頸癌PIK3CA基因拷貝數(shù)擴增病人臨床病理特征(例(χ/%))

2.3 PIK3CA基因拷貝數(shù)擴增與預后相關性

生存分析顯示，卵巢癌病人不攜帶PIK3CA基因拷貝數(shù)變異病人的無病生存期和總生存期長于PIK3CA基因拷貝數(shù)擴增者，但差異無顯著性(P>0.05)；宮頸癌病人不攜帶PIK3CA基因拷貝數(shù)變異者與PIK3CA基因拷貝數(shù)擴增者的總生存期與無病生存期無明顯差異(P>0.05)。見圖3、4。

2.4 宮頸癌及卵巢癌病人中的生物信息學分析

KEGG分析表明，宮頸癌及卵巢癌PIK3CA基因拷貝數(shù)擴增與不攜帶該基因拷貝數(shù)變異病人所激活的信號通路類似，PIK3CA基因所參與的較為有關聯(lián)性的信號通路見圖5。對PIK3CA基因拷貝數(shù)擴增病人與不攜帶該基因拷貝數(shù)變異者的差異基因進行比較，結果顯示PIK3CA基因拷貝數(shù)擴增可能會引起一些基因表達網(wǎng)絡調控的變化，從而激活下游一些信號通路。PIK3CA的激活可參與調節(jié)第二信使PIP3的傳導以及PI3K磷酸化，激活PI3K-AKT信號通路。KEGG富集分析表明，在宮頸癌及卵巢癌病人中，PIK3CA拷貝數(shù)擴增與細胞轉錄失調、RNA轉運密切相關。利用DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)對差異基因數(shù)目大于100的通路進行GO分析顯示，細胞內的三大板塊生物進程、分子功能、細胞組分很多方面均受到顯著影響。見圖6、7。

3 討 論

隨著腫瘤生物學研究的深入，人們對腫瘤的認知深入到了分子水平。目前就腫瘤細胞惡性轉化及進展機制，最廣泛被接受的是“突變致癌”學說[6-7]?；蚩截悢?shù)變異是一種常見的基因多位點突變形式，其可影響腫瘤的生物學表型及異質性，驅動腫瘤復雜性生長。卵巢癌、宮頸癌均是極為常見的婦科惡性腫瘤[8-10]。開發(fā)出理想的實驗室診斷標志物，對卵巢癌和宮頸癌早期診斷、明確腫瘤分期進而制定正確治療方案及改善病人預后均有重大意義[11-13]。

腫瘤細胞中存在著多條信號轉導通路異常表達，PI3K/AKT為其中常見的通路之一。PI3K是影響該通路表達水平的決定性分子[14]，PI3K的持續(xù)活化常預示著腫瘤細胞發(fā)生惡性轉化。PI3K為異源二聚分子，其基本結構由一個起催化作用的PI3KC亞基和一個起調節(jié)作用的PI3KR亞基組成，而PI3KC亞基又由PI3KCA、PI3KCB等亞單位構成[15-16]。其中，PI3KCA分子結構的改變常導致PI3K持續(xù)激活，上調PI3K/AKT水平進而導致腫瘤的發(fā)生[17]。

本文的研究結果顯示，卵巢癌以及宮頸癌病人PIK3CA基因均有顯著的擴增，其占比分別為55%和62%；宮頸癌病人PIK3CA基因擴增最多的為鱗狀細胞癌(84.5%)，而卵巢癌病人病理類型均為卵巢漿液性上皮腫瘤，提示PIK3CA基因擴增檢測有助于卵巢腫瘤的鑒別診斷。本文研究對TCGA數(shù)據(jù)庫及cBioPortal網(wǎng)站檢索到的卵巢癌及宮頸癌PIK3CA基因拷貝數(shù)擴增病人的臨床數(shù)據(jù)與表達矩陣分析顯示，相較于正常人群[18]，PIK3CA基因在卵巢癌及宮頸癌病人中擴增率與拷貝數(shù)變異增加明顯；同時，卵巢癌及宮頸癌病人PIK3CA基因拷貝數(shù)擴增病人中41～60歲所占比例均超過50%；卵巢癌病人中，病理分級3級比例最高，而宮頸癌病人PIK3CA基因拷貝數(shù)擴增病人病理分級中、高級別比例接近。從臨床轉化醫(yī)學的觀點來看[19]，或許PIK3CA突變可作為卵巢癌病理分型的依據(jù)，但具體價值需要進一步的臨床研究。本文結果還顯示，卵巢癌及宮頸癌PIK3CA基因拷貝數(shù)擴增病人與不攜帶PIK3CA拷貝數(shù)變異者的病死率不同，可能與本文樣本量不夠大有關，結論有待進一步驗證。本文生存分析顯示，卵巢癌病人中不攜帶PIK3CA拷貝數(shù)變異的病人總生存期與無瘤生存期可能更長，PIK3CA拷貝數(shù)變異可能預示不良結局；對宮頸癌而言，并無證據(jù)證實PIK3CA拷貝數(shù)擴增和病人不良結局有關。

本文KEGG與GO分析結果顯示，PI3K-AKT信號通路在正常的生理狀況下能夠促進細胞生長，PIK3CA擴增或突變會引起轉錄調控失活，這與其他學者的研究結果一致[20]。PIK3CA的激活可參與調節(jié)第二信使PIP3的傳導以及PI3K磷酸化，激活PI3K-AKT信號通路。其中PTEN磷酸酶活性增加可以被氧化應激反應激活，而AKT磷酸化的變化會引起其下游蛋白的變化，包括下游凋亡、細胞周期、孕酮介導的卵母細胞成熟等相關基因蛋白的表達變化。在卵巢癌病人中，PIK3CA拷貝數(shù)擴增除了影響上述信號通路外，還影響內分泌抵抗信號通路。這預示著PIK3CA拷貝數(shù)擴增對卵巢癌病人的影響作用更加廣泛，生物功能更為多樣。

有富集分析結果顯示，PIK3CA擴增和多種細胞惡性轉變相關，主要影響細胞生長、分化和維持、凋亡以及信號傳導等過程以及基因產(chǎn)物在細胞中的位置[20]，同時內質網(wǎng)、核或蛋白酶體等也受到顯著影響，如包括細胞應激反應、細胞的蛋白質定位等。此外，轉錄組測序研究可以幫助我們找到更加復雜詳細的基因蛋白互作網(wǎng)路，了解下游基因蛋白的類型與功能。PIK3CA基因作為一種重要的癌基因，對其進行深入研究將為闡述腫瘤的分子發(fā)生機制、早期診斷、病理監(jiān)測、腫瘤生物學行為判斷、預后評估提供豐富的臨床資料。

綜上所述，PIK3CA基因在卵巢癌及宮頸癌中具有特征性的拷貝數(shù)改變，PIK3CA基因突變與卵巢癌、宮頸癌惡性轉化及進展密切相關。對卵巢癌、宮頸癌拷貝數(shù)變異數(shù)據(jù)進行深入探索及綜合分析，可為婦科惡性腫瘤標志物開發(fā)、分子病理分型及制定個體化治療策略提供思路。