張華偉,董作祥,蔡學(xué)昌,盧東林,劉恒健,孫鵬

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,山東 青島 266003)

我國(guó)已進(jìn)入老齡化社會(huì)，到目前為止我國(guó)老齡人口接近3億，并以每年3%的速度遞增。隨著老齡人口增加，各種衰老相關(guān)疾病的發(fā)病人數(shù)也明顯增加，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。其中包括腦小血管相關(guān)的疾病，如腦出血、腦梗死以及認(rèn)知障礙和癡呆等[1-2]。腦小血管包括腦小動(dòng)脈、小靜脈和毛細(xì)血管，它們均在腦微循環(huán)中發(fā)揮著重要作用[3]，其中以腦小動(dòng)脈的作用最為重要，因?yàn)槟X小動(dòng)脈與星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞共同組成神經(jīng)血管單位，從而控制和協(xié)調(diào)局部腦血流和阻力[4]。當(dāng)腦小動(dòng)脈結(jié)構(gòu)和功能改變時(shí)，必然影響到腦實(shí)質(zhì)的血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，繼而導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血-腦脊液屏障破壞、炎性滲出以及神經(jīng)損傷等。大量研究表明，衰老是多種重要生理功能減退的結(jié)果，同時(shí)也是諸多腦小血管相關(guān)疾病的危險(xiǎn)因素，隨著衰老，腦小血管相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)也相應(yīng)增加[5]，但其發(fā)病機(jī)制仍然不是很清楚。本研究通過(guò)探討衰老對(duì)腦小動(dòng)脈的結(jié)構(gòu)和收縮功能影響，從而為衰老導(dǎo)致的腦小血管相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

雄性12周齡SD大鼠(體質(zhì)量約345 g)30只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，隨機(jī)分為年輕組和老年組，每組15只，均飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)藥品包括NaCl、KCl、NaHCO3、CaCl2、MgSO4、HEPES、NaH2PO4和葡萄糖，全部購(gòu)自于美國(guó)Sigma公司。生理鹽溶液(PSS)內(nèi)含：119.0 mmol/L NaCl、4.7 mmol/L KCl、18.0 mmol/L NaHCO3、5.0 mmol/L HEPES、1.2 mmol/L MgSO4、1.6 mmol/L CaCl2、10.0 mmol/L葡萄糖、1.2 mmol/L NaH2PO4,使用前將pH值調(diào)整為7.4。無(wú)鈣生理鹽溶液(PSS0Ca，除不含CaCl2以及增加0.03 mmo/L EDTA之外，其他成分和PSS相同)，使用前也需將溶液pH值調(diào)整為7.4[6-7]。SZ2體視鏡、IMT-2倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；CH-1 Living system(美國(guó)Living systems公司，是一套可以模擬體內(nèi)生理環(huán)境，保持離體血管活性和生理功能的裝置)，由以下部分組成：可以固定血管的小水槽，壓力控制器(調(diào)節(jié)離體血管腔內(nèi)的壓力)，溫控裝置(維持離體血管溫度37 ℃左右)，供氧系統(tǒng)(維持相對(duì)穩(wěn)定的氧氣含量)，圖像采集和顯示器(實(shí)時(shí)采集和放大血管圖像并對(duì)血管內(nèi)外徑進(jìn)行測(cè)量)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物模型制備 兩組大鼠均自由進(jìn)食及飲水，避免刺激引起應(yīng)激反應(yīng)，人工照明控制晝夜節(jié)律各為12 h。年輕組大鼠飼養(yǎng)到15周齡、老年組大鼠飼養(yǎng)到65周齡時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2麻醉及取腦 實(shí)驗(yàn)前大鼠在安靜環(huán)境下休息60 min，稱(chēng)質(zhì)量后經(jīng)腹腔注射10 g/L戊巴比妥鈉(50 mg/kg體質(zhì)量)麻醉。待大鼠角膜反射和疼痛反射消失后斬頭，剪開(kāi)頭頂皮膚，用咬骨鉗分離顱骨，取出大腦，置于冰上預(yù)冷的充滿(mǎn)PSS0Ca的玻璃皿中。

1.2.3腦小動(dòng)脈分離及其在Living system中的安裝和固定 在體視鏡下用小剪刀沿大腦中動(dòng)脈(MCA)周?chē)糸_(kāi)腦組織，取出一塊大小約4 mm×7 mm、包含MCA M1段(長(zhǎng)度約為2.5 mm)的腦組織，置于另一充滿(mǎn)PSS0Ca的玻璃皿中。小心分離出MCA M1段深入腦實(shí)質(zhì)的小動(dòng)脈，將其轉(zhuǎn)移至Living system小水槽中，小水槽中充滿(mǎn)PSS[8-9]。用尖頭鑷子將腦小動(dòng)脈一端套在小水槽的玻璃管上，再用6號(hào)外科縫線(xiàn)中的單根棉線(xiàn)將其固定，另一端固定在對(duì)側(cè)玻璃管上。將小水槽轉(zhuǎn)移到倒置顯微鏡下并通入混合氣體(其中含體積分?jǐn)?shù)0.21的O2和0.06的CO2,0.73的N2)，連接控溫裝置和加壓裝置，使水槽溫度維持在37 ℃，小動(dòng)脈管腔內(nèi)充滿(mǎn)PSS并將灌注壓維持在1.3 kPa。

1.2.4圖像描記和血管內(nèi)外徑測(cè)量 圖像采集系統(tǒng)采用高分辨率黑白相機(jī)，在顯示器上小動(dòng)脈管壁因?yàn)橥腹庑圆疃尸F(xiàn)灰黑色，管腔呈現(xiàn)灰白色，根據(jù)色差以?xún)蓚?cè)血管壁的灰黑色外邊界為基準(zhǔn)測(cè)量血管外徑，以?xún)蓚?cè)血管壁黑色內(nèi)邊界為基準(zhǔn)測(cè)量血管內(nèi)徑。在含鈣的情況下，待溫度上升到37 ℃時(shí)，按上述方法測(cè)量血管內(nèi)徑和外徑初始值。等待25～30 min，使血管恢復(fù)活力并收縮穩(wěn)定，依次升高灌注壓到1.3、2.7、4.0、5.3、6.7、8.0 kPa，每次升高灌注壓后維持3 min，測(cè)量有鈣情況下血管內(nèi)徑和外徑值。有鈣情況下血管內(nèi)徑測(cè)量結(jié)束后，將灌注壓降到0.7 kPa,以PSS0Ca置換小水槽中的PSS，反復(fù)洗滌6～8次直到血管不再收縮。待溫度恢復(fù)到37 ℃后，再次測(cè)量灌注壓分別為0.7、1.3、2.7、4.0、5.3、6.7、8.0 kPa時(shí)的血管內(nèi)徑和外徑，為無(wú)鈣情況下血管內(nèi)徑(ID0Ca)和外徑(OD0Ca)。

1.2.5血管結(jié)構(gòu)參數(shù)計(jì)算[10-14]管壁厚度(μm)=(OD0Ca-ID0Ca)/2;橫截面積(μm2)=(π/4)×(OD0Ca-ID0Ca);管壁厚度與管徑之比=管壁厚度/ID0Ca;管壁應(yīng)力(σ)=(P×ID0Ca)/2×管壁厚度，式中的P為血管內(nèi)灌注壓;管壁應(yīng)變(ε)=(ID0Ca-ID0Ca 0.7 kPa)/ID0Ca 0.7 kPa。

血管硬化程度和剛度由彈性模量(E=σ/ε)來(lái)反映，彈性模量由應(yīng)力-應(yīng)變曲線(xiàn)來(lái)表示。應(yīng)用Microsoft Office Excel軟件中最小二乘法對(duì)每一根血管對(duì)應(yīng)的兩組數(shù)據(jù)(不同壓力下對(duì)應(yīng)的系列血管應(yīng)變值及系列血管應(yīng)力值)進(jìn)行指數(shù)曲線(xiàn)擬合，擬合模型σ=σ初始eβε，σ初始為壓力在0.7 kPa時(shí)初始內(nèi)徑對(duì)應(yīng)的σ值。擬合后每一根血管對(duì)應(yīng)生成一條擬合曲線(xiàn)方程式，方程式中包含確切的σ初始值和β值，將σ初始值和β值的平均值代入擬合模型，并最終得到代表各組應(yīng)力-應(yīng)變的綜合方程式及對(duì)應(yīng)曲線(xiàn)。擬合曲線(xiàn)中β值為對(duì)應(yīng)曲線(xiàn)的斜率，反映彈性模量的大小，β值增加代表血管剛度和硬化程度增加[13-16]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 腦小動(dòng)脈內(nèi)外徑隨灌注壓升高的變化

有鈣情況下，年輕組和老年組腦小動(dòng)脈初始血管內(nèi)徑分別為(25.50±4.20)、(25.67±3.60)μm,兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.79,P>0.05)。灌注壓從1.3 kPa升高到8.0 kPa的過(guò)程中，血管表現(xiàn)為主動(dòng)收縮，血管內(nèi)徑組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組別=10.12,P<0.05),不同灌注壓比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F灌注壓=11.90,P<0.05)，二者存在交互作用(F交互=36.36,P<0.05)；單獨(dú)效應(yīng)結(jié)果顯示，灌注壓在5.3、6.7、8.0 kPa時(shí)，老年組的血管內(nèi)徑大于年輕組(t=3.89～5.06,P<0.05)。見(jiàn)圖1A和1B。血管外徑組間比較差異有顯著意義(F組別=10.29,P<0.05),不同灌注壓比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F灌注壓=6.81,P<0.05)，二者存在交互作用(F交互=17.99,P<0.05)；單獨(dú)效應(yīng)結(jié)果顯示，灌注壓在5.3、6.7、8.0 kPa時(shí)，老年組的血管外徑大于年輕組(t=3.82～4.72,P<0.05)。見(jiàn)圖1C。血管內(nèi)徑變化百分比組間比較差異亦有顯著意義(F組別=24.00，P<0.05),不同灌注壓比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F灌注壓=5.92，P<0.05)，二者存在交互作用(F交互=15.48，P<0.05)；單獨(dú)效應(yīng)結(jié)果顯示，灌注壓在4.0～8.0 kPa時(shí)，老年組血管內(nèi)徑增加百分比大于年輕組(t=5.08～7.11,P<0.05)，隨著灌注壓升高，老年組血管持續(xù)擴(kuò)張，而年輕組的血管先收縮，到6.7 kPa時(shí)才出現(xiàn)擴(kuò)張。見(jiàn)圖1D。

在無(wú)鈣情況下，兩組在灌注壓從0.7 kPa升高到8.0 kPa的過(guò)程中，血管表現(xiàn)為被動(dòng)擴(kuò)張，血管內(nèi)徑組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組別=7.83，P<0.05),不同灌注壓比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F灌注壓=176.60，P<0.05)，二者存在交互作用(F交互=14.45，P<0.05)；單獨(dú)效應(yīng)結(jié)果顯示，在0.7、1.3、2.7 kPa時(shí)，老年組的血管內(nèi)徑大于年輕組(t=3.23～3.86,P<0.05)。見(jiàn)圖1E。血管外徑組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組別=17.85,P<0.05),不同灌注壓比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F灌注壓=127.80,P<0.05)，二者存在交互作用(F交互=14.15,P<0.05)；單獨(dú)效應(yīng)結(jié)果顯示，灌注壓在0.7～8.0 kPa時(shí)，老年組的血管外徑大于年輕組(t=3.04～5.16,P<0.05)。見(jiàn)圖1F。血管內(nèi)徑變化百分比組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組別=39.50，P<0.05),不同灌注壓比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F灌注壓=158.20，P<0.05)，二者存在交互作用(F交互=29.91，P<0.05)；單獨(dú)效應(yīng)分析結(jié)果顯示，灌注壓在2.7～8.0 kPa時(shí)，老年組血管內(nèi)徑增加百分比小于年輕組(t=2.93～9.99,P<0.05)。見(jiàn)圖1G。

2.2 腦小動(dòng)脈結(jié)構(gòu)參數(shù)隨灌注壓升高的變化

血管壁厚度組間比較差異有顯著意義(F組別=7.04，P<0.05),不同灌注壓比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F灌注壓=9.79，P<0.05)，二者不存在交互作用(F交互=2.00，P>0.05)；單獨(dú)效應(yīng)結(jié)果顯示，灌注壓在5.3～8.0 kPa時(shí)，老年組的血管壁厚度大于年輕組(t=2.78～2.90,P<0.05)。見(jiàn)圖2A。血管壁橫截面積組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組別=25.86，P<0.05),不同灌注壓相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F灌注壓=6.72，P<0.05)，二者不存在交互作用(F交互=0.75，P>0.05)；單獨(dú)效應(yīng)結(jié)果顯示，灌注壓在0.7～8.0 kPa時(shí)，老年組的管壁橫截面積大于年輕組(t=4.73～5.22,P<0.05)。見(jiàn)圖2B。血管壁厚度與管徑之比組間比較差異有顯著意義(F組別=7.23，P<0.05),不同灌注壓情況下比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F灌注壓=43.99，P<0.05)，二者存在交互作用(F交互=3.742，P<0.05)；單獨(dú)效應(yīng)結(jié)果顯示，灌注壓在5.3～8.0 kPa時(shí)，老年組管壁厚度與管徑之比大于年輕組(t=2.88～3.23,P<0.05)。見(jiàn)圖2C。

管壁應(yīng)變組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組別=40.02，P<0.05),不同灌注壓比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F灌注壓=156.10，P<0.05)，二者存在交互作用(F交互=29.54，P<0.05)；單獨(dú)效應(yīng)結(jié)果顯示，灌注壓在2.7～8.0 kPa時(shí)，老年組管壁應(yīng)變小于年輕組(t=2.96～9.95,P<0.05)。見(jiàn)圖2D。管壁應(yīng)力組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組別=7.05，P<0.05),不同灌注壓比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F灌注壓=230.10，P<0.05)，二者存在交互作用(F交互=10.60，P<0.05)；單獨(dú)效應(yīng)結(jié)果顯示，灌注壓為6.7、8.0 kPa時(shí)，老年組管壁應(yīng)力值均小于年輕組(t=4.45、5.34,P<0.05)。見(jiàn)圖2E。應(yīng)力-應(yīng)變曲線(xiàn)擬合模型：年輕組σ=1.31e5.44ε，老年組σ=1.05e9.95ε；曲線(xiàn)的擬合優(yōu)度:年輕組R2=0.97，老年組R2=0.98；年輕組β=5.44±1.30，老年組β=9.95±1.31，老年組的β值大于年輕組(t=10.34,P<0.05)。見(jiàn)圖2F。

3 討 論

已有研究顯示，衰老會(huì)導(dǎo)致腦小動(dòng)脈的肌源性反應(yīng)一定程度的受損，肌源性反應(yīng)是維持腦血流自調(diào)節(jié)的重要機(jī)制[17-18]。衰老后，腦小血管肌源性反應(yīng)受損，可以導(dǎo)致腦血流自調(diào)節(jié)失常，繼而造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、神經(jīng)損害、血-腦脊液屏障破壞、炎性滲出等，并最終導(dǎo)致腦血管疾病、認(rèn)知障礙和癡呆等[18-22]。衰老情況下，腦血管疾病發(fā)病率增高。動(dòng)脈重塑主要表現(xiàn)為動(dòng)脈直徑、管壁結(jié)構(gòu)、擴(kuò)張性能以及硬化程度的變化。動(dòng)脈重塑是動(dòng)脈功能減退的主要標(biāo)志[23]。本研究通過(guò)檢測(cè)在無(wú)鈣條件下血管被動(dòng)擴(kuò)張狀態(tài)的血管內(nèi)徑、管壁厚度、橫截面積等以反映血管的重塑情況。在無(wú)鈣條件下，隨著灌注壓的升高，血管因?yàn)槿狈︹}而無(wú)法主動(dòng)收縮，只能隨著灌注壓的升高而被動(dòng)擴(kuò)張。因此，在無(wú)鈣的情況下測(cè)量血管的各項(xiàng)指標(biāo)可以反映血管的被動(dòng)舒張性能。本文結(jié)果顯示，衰老情況下，血管內(nèi)徑增大，管壁變厚，橫截面積增加，管壁厚度與管徑之比增大，擴(kuò)張性能減弱，提示衰老會(huì)導(dǎo)致血管重塑、彈性變差，尤其是在血壓增高的情況下，更易發(fā)生腦血管意外。另外，衰老不是只影響腦的小動(dòng)脈，很可能其他各器官小動(dòng)脈都會(huì)受累，而小動(dòng)脈系統(tǒng)具有容量血管和調(diào)節(jié)血流量的作用，當(dāng)小動(dòng)脈擴(kuò)張性能減弱、彈性變差時(shí)，其容量血管和調(diào)節(jié)血流量的作用勢(shì)必受影響，這在一定程度上可能會(huì)影響外周阻力，從而促進(jìn)高血壓的發(fā)生，但需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)去證實(shí)。

本文研究中腦小動(dòng)脈的灌注壓范圍為1.3～8.0 kPa。已有多項(xiàng)研究證實(shí)，動(dòng)脈灌注壓會(huì)隨著血管直徑的縮小而逐漸減小，腦表面動(dòng)脈(直徑100～200 μm)的灌注壓大約為大動(dòng)脈的50%以下[24]，即腦表面動(dòng)脈的灌注壓為5.3～8.0 kPa，而腦小動(dòng)脈的管徑則遠(yuǎn)小于腦表面動(dòng)脈，因此其正常灌注壓比5.3～8.0 kPa更小。已有研究顯示，衰老會(huì)導(dǎo)致小鼠腦小動(dòng)脈的重塑[16]，但其使用的灌注壓為5.3～16.0 kPa，這遠(yuǎn)超腦小動(dòng)脈的正常灌注壓，并且也未比較收縮功能的差異，因此并不能真實(shí)反映腦小動(dòng)脈的重塑情況以及自調(diào)節(jié)的改變。

另外，本文還引入了應(yīng)力-應(yīng)變曲線(xiàn)來(lái)描述血管的彈性性能和硬化程度。應(yīng)力-應(yīng)變曲線(xiàn)又稱(chēng)為彈性模量，是衡量材料產(chǎn)生彈性形變難易程度的指標(biāo)，其值越大，材料剛度越大，在一定應(yīng)力下發(fā)生彈性形變的能力越小。本文結(jié)果顯示，對(duì)年輕組和老年組的應(yīng)力和應(yīng)變進(jìn)行擬合后，計(jì)算得到老年組β值明顯大于年輕組，說(shuō)明老年組的彈性模量明顯大于年輕組，因此老年組的腦小動(dòng)脈具有更差的彈性性能和更高的硬化程度和剛度。進(jìn)一步證實(shí)衰老會(huì)導(dǎo)致腦小動(dòng)脈結(jié)構(gòu)的改變。

綜上所述，衰老不僅會(huì)影響腦小動(dòng)脈的收縮功能，從而影響腦實(shí)質(zhì)局部血流量的調(diào)節(jié)，同時(shí)也在血管重塑和硬化中起著重要作用。腦小動(dòng)脈的這些結(jié)構(gòu)和功能的改變?cè)谀X小血管疾病的發(fā)病機(jī)制中具有重要意義。但是本實(shí)驗(yàn)僅局限于體外實(shí)驗(yàn)，腦血流的自調(diào)節(jié)不僅是動(dòng)脈血管肌源性反應(yīng)的結(jié)果，還受神經(jīng)、體液等多種因素的影響，因此衰老對(duì)腦血流自調(diào)節(jié)的影響還需體內(nèi)實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。