羅洋， 劉方， 朱健， 羅緒強， 楊曉斕， 孫麗

(1.貴州師范學院地理與資源學院，貴州 貴陽 550018；2.貴州大學資源與環(huán)境工程學院，貴州 貴陽 550025)

鎘是生物非必需元素，在體內(nèi)蓄積至一定程度后會導致植物質(zhì)膜破壞和生長發(fā)育受阻，也會造成動物或人體骨骼和神經(jīng)系統(tǒng)受損等嚴重后果[1]。近年來，大量鎘通過化肥施用、污泥農(nóng)用、污水灌溉、礦產(chǎn)資源開采冶煉和工業(yè)及生活“三廢”途徑進入土壤，威脅著動植物生長和人類健康。據(jù)2014年國土資源部發(fā)布的《全國土壤污染公報》顯示，中國土壤鎘的點位超標率已達7%，是污染最廣的重金屬元素[2]。因此，選擇適宜的方法來修復鎘污染土壤，是實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展和生態(tài)文明建設的必然要求。

螯合劑能與土壤重金屬發(fā)生鍵合/螯合作用，使重金屬從不溶態(tài)轉(zhuǎn)變成可溶態(tài)，形成水溶性的金屬-螯合劑絡合物，從而提高植物對重金屬的提取效率[3-4]，也常被用于強化Cd污染土壤的植物提取修復中。傳統(tǒng)的EDTA等螯合劑雖然應用較為廣泛，對Cd有效性的提升效果也較好，但在土壤中生物毒性大、持續(xù)時間長、降解能力差，存在潛在的生態(tài)風險[5]。天然低相對分子質(zhì)量有機酸(LMWOA)作為螯合劑的一類，因為具有降解性好、能與Cd 絡合形成低毒害的物質(zhì)進而提高重金屬生物有效性等優(yōu)勢[6]。近年來學者們嘗試應用LMWOA如草酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸和氨三乙酸等與植物聯(lián)合作用來修復Cd污染土壤，表現(xiàn)出了一定的應用前景[7]。然而，目前在有機酸對植物 Cd 吸收積累方面仍沒達成統(tǒng)一認識，主要是因為其修復效果受到植物種類、有機酸種類與濃度、土壤條件和污染元素性質(zhì)等多種因素的影響[8]。

龍葵(SolanumnigrumL.)是中國發(fā)現(xiàn)的一種鎘超積累植物，具有生物量較大、適應性強、生長迅速等特點，是用于提取土壤中鎘的良好材料[9-10]。為提高其修復效率，學者們從添加促生菌、螯合劑、植物生長調(diào)節(jié)劑和肥料等外源物質(zhì)，并結(jié)合農(nóng)藝調(diào)控措施等方面開展了系列工作，取得了一定成果[11-13]。目前，有關(guān)龍葵對Cd修復的研究大多采用的是酸性或中性土壤，對于微堿性和堿性土壤缺乏關(guān)注。石灰土主要發(fā)育在碳酸鹽巖類風化物上，大多呈弱堿性，是貴州省的第二大土類，約占全省土壤面積的17.5%[14]。前期研究表明，受碳酸鹽巖風化成土過程中Cd 的相對富集的影響，石灰土的Cd背景值普遍較高[15]；孫子媛等[16]采用實地調(diào)查和地球化學測試分析等手段，也發(fā)現(xiàn)石灰土剖面Cd和As的超標程度最大，存在的潛在危害不容忽視。因此，近年來對貴州省石灰土鎘污染問題的研究逐漸增多，但目前主要集中在含量特征與污染風險評價、吸附解析特性、化學淋洗效應和對農(nóng)作物的毒性效應等方面[17-20]，尚未見到采用有機酸與超積累植物聯(lián)合施用修復效果的報道。本研究以石灰土為供試土壤，采用盆栽試驗，結(jié)合植物生長指標和Cd含量指標的測定，探討不同類型和濃度的有機酸對龍葵提取修復Cd的強化效果，以期為貴州省石灰土鎘污染的治理提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤：采自貴州師范學院后山，土壤類型為石灰土，自然風干挑出雜物后過2 mm篩。其基本理化性質(zhì)為：pH值為8.38；有機質(zhì)含量12.35 g·kg-1；堿解氮含量94.08 mg·kg-1；速效磷含量8.22 mg·kg-1；速效鉀含量115.67 mg·kg-1。通過添加CdCl2溶液的形式，直至配成Cd質(zhì)量濃度為6.86 mg·kg-1的模擬污染土壤，室溫下平衡1個月分裝到塑料盆中，每盆裝土3.5 kg。

供試植物：龍葵，種子購于網(wǎng)上農(nóng)資專賣店。

供試有機酸：主要為草酸(OA)、檸檬酸(CA)和氨三乙酸(NTA)，所用試劑均為優(yōu)級純。

1.2 試驗設計

試驗于2019年6—9月在貴州師范學院溫室大棚進行，共設計7組處理，分別為：CK(不加有機酸)、OA2.5(2.5 mmol·kg-1草酸)、OA5(5 mmol·kg-1草酸)、CA2.5(2.5 mmol·kg-1檸檬酸)、CA5(5 mmol·kg-1檸檬酸)、NTA2.5(2.5 mmol·kg-1氨三乙酸)和NTA5(5 mmol·kg-1氨三乙酸)，每個處理重復3次。龍葵種子經(jīng)質(zhì)量分數(shù)為75%的酒精浸泡30 s殺菌處理后，用蒸餾水清洗干凈，選取顆粒飽滿的龍葵種子播種于育苗缽中，置于室溫培養(yǎng)，待長至4片真葉時，選擇長勢良好、大小一致的幼苗移栽于塑料盆中，每盆3株。移栽30 d后，將有機酸一次性加入土壤。生長過程中保持土壤含水量為田間持水量的70%左右，移栽90 d后收獲。將植株挖出，分為地上部和根部，經(jīng)自來水沖洗、去離子水潤洗后用吸水紙擦干，測定株高和鮮質(zhì)量。于105 ℃殺青30 min，然后在60 ℃條件下于恒溫干燥箱(上海一恒，DHG-9030)中烘干，測量干質(zhì)量，再用植物粉碎機(東莞房太，800A)磨碎，裝袋保存，供鎘含量的測定分析。

1.3 測定項目及方法

龍葵采用HNO3-H2O2消解體系(體積比為5∶2)，在微波消解儀(成都奧普樂，APL)中按如下程序消解：升溫至120 ℃，保持20 min；升溫至160 ℃，保持20 min；升溫190 ℃，保持40 min至液體透明澄清；土壤采用HNO3-HCl-HF-H2O2體系(體積比為3∶1∶1∶1)下，在微波消解儀中按如下程序消解：升溫至120 ℃，保持7 min；升溫至150 ℃，保持9 min；升溫190 ℃，保持25 min至液體透明澄清，然后用火焰原子吸收光譜儀(novAA 350)測定消解液Cd含量，在樣品處理過程中，利用標準物質(zhì)(土壤為GSS系列，植物為GSV系列)、平行樣、空白對照等進行質(zhì)量控制試驗，所用試劑均為優(yōu)級純。

土壤有效態(tài)Cd采用0.1 mol·L-1HCl浸提，火焰原子吸收光譜儀(novAA 350)測定；土壤pH采用pH計(m(水)∶m(土)=2.5∶1)測定。

富集系數(shù)(BCF)=龍葵Cd含量(μg·g-1)/土壤Cd含量(μg·g-1)；轉(zhuǎn)運系數(shù)(TF)=龍葵地上部Cd含量(μg·g-1)/龍葵根部Cd含量(μg·g-1) 。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007 進行試驗數(shù)據(jù)的處理，所得結(jié)果以平均值加減標準差形式體現(xiàn)，用LSD法在P<0.05水平上進行處理間差異性比較，采用SPSS 22.0進行相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同有機酸對龍葵生長的影響

由表1可知，龍葵的株高、單株鮮質(zhì)量和干質(zhì)量等生長指標隨著有機酸類型和濃度的變化而有所不同。添加草酸能促進龍葵的生長，當其施用濃度為5 mmol·kg-1時龍葵的株高、單株鮮質(zhì)量和單株干質(zhì)量都比其余處理大，分別比CK增加了13.82%、29.24%和51.85%，差異均達顯著水平(P<0.05)。與對照相比，低濃度(2.5 mmol·kg-1)的檸檬酸對龍葵的生長沒有顯著影響(P>0.05)，當其施用濃度提升至5 mmol·kg-1時，反而使株高顯著降低了18.26%，單株鮮質(zhì)量和單株干質(zhì)量無明顯變化。氨三乙酸的施用對龍葵的生長產(chǎn)生了明顯的毒害作用，并且隨著施用濃度的提高，其抑制效應越強。其中NTA5處理組的株高、單株鮮質(zhì)量和單株干質(zhì)量分別比CK顯著降低了17.50%、48.73%和55.56%，也顯著低于草酸和檸檬酸處理組(P<0.05)。

表1 不同有機酸對龍葵株高和地上部生物量的影響Table 1 Effects of different organic acids on plant height and aboveground biomass of Solanum nigrum L.

2.2 不同有機酸對龍葵富集和轉(zhuǎn)移Cd的影響

經(jīng)過3個月的盆栽后，龍葵地上部Cd含量在65.06～84.20 μg·g-1之間，各處理大小順序為OA5>OA2.5>NTA5>NTA2.5> CK>CA2.5>CA5(表2)。從中可以看出，檸檬酸的添加會略微降低龍葵地上部Cd含量，但與對照相比未達顯著水平；而草酸和氨三乙酸則能強化龍葵地上部對Cd的富集，其中OA2.5、NTA2.5、OA5和NTA5處理組的龍葵地上部Cd含量與對照組相比增幅分別為28.23%、11.85%、28.30%和26.51%，差異均達顯著水平(P<0.05)。就同一種有機酸而言，主要表現(xiàn)為低濃度(2.5 mmol·kg-1)促進作用弱于高濃度(5 mmol·kg-1)，其中OA2.5和OA5處理組的數(shù)值接近，而NTA2.5和NTA5處理組則有顯著差異。

植物對Cd的修復效率主要取決于其地上部Cd積累量[21]，其數(shù)值等于地上部干重和Cd濃度的乘積，不同處理下龍葵地上部的Cd提取量狀況如表2所示。不添加有機酸(CK)時，單株龍葵的地上部Cd提取量為18.00 μg·株-1。隨著有機酸類型和濃度的不同，Cd提取量呈現(xiàn)多種變化趨勢。添加氨三乙酸后，總提取量分別下降至11.72 μg·株-1(NTA2.5)和10.00 μg·株-1(NTA5)，僅為對照的0.65和0.56倍，差異達顯著水平(P<0.05)；添加檸檬酸后，龍葵地上部Cd提取量為19.47 μg·株-1(CA2.5)和17.72μg·株-1(CA5)，與對照無明顯區(qū)別；添加草酸后，龍葵地上部對Cd的總提取量較對照有明顯提升，增加至27.22 μg·株-1(OA2.5)和34.47 μg·株-1(OA5)，分別是對照的1.51倍和1.92倍，2個濃度處理組之間無顯著差異。

龍葵作為Cd超積累植物，在本試驗中富集系數(shù)最小值為9.60(CK)，最大值為12.34(OA5)之間，轉(zhuǎn)移系數(shù)最小值為1.23(CK)，最大值為2.88(NTA5)，表明其體內(nèi)Cd濃度高于土壤中，且以地上部富集為主(表2)。OA2.5、OA5和NTA5 3個處理之間龍葵對Cd的富集系數(shù)無明顯區(qū)別，但都顯著高于NTA2.5處理組。此外，與對照相比，草酸和氨三乙酸這2種有機酸施用后都使龍葵地上部Cd富集系數(shù)呈顯著增加趨勢(P<0.05)，而檸檬酸則沒有體現(xiàn)出明顯的影響。由表2可知，不同處理條件下龍葵對Cd的轉(zhuǎn)移系數(shù)大小順序為NTA5>OA5>NTA2.5>CA2.5>OA2.5>CA5> CK，添加有機酸的處理組數(shù)值都高于對照，除CA5外，與CK相比均有顯著差異(P<0.05)。同一種酸方面，氨三乙酸和草酸處理組的轉(zhuǎn)移系數(shù)均表現(xiàn)為高濃度>低濃度，而檸檬酸則相反。

表2 不同有機酸對龍葵富集和轉(zhuǎn)移Cd的影響Table 2 Effects of different organic acids on Cd accumulation and transfer in Solanum nigrum L.

2.3 不同有機酸對土壤有效態(tài)Cd的影響

對土壤中重金屬的有效性進行分析，能夠表征重金屬被生物吸收利用或產(chǎn)生毒害的程度[22]，3種有機酸添加后土壤有效態(tài)Cd含量的變化如圖1所示。OA5處理組的土壤有效態(tài)Cd含量高于其余處理，為2.64 μg·g-1，比CK(2.10 μg·g-1)增加了27.72%，與除OA2.5和NTA5以外的處理相比差異顯著(P<0.05)。 從圖1還可以看出，OA2.5、NTA5、NTA2.5、CA5和 CA2.5處理組與CK相比土壤有效態(tài)Cd含量的變幅分別為13.81%、7.62%、6.19%、-4.76%和-9.52%，差異均未達顯著水平(P>0.05)，說明除了5 mmol·kg-1的草酸外，其余類型和濃度的有機酸添加并沒有對土壤中Cd的有效性產(chǎn)生明顯影響。

注：柱狀圖上小寫字母表示在P<0.05水平上差異顯著。下同。

2.4 不同有機酸對土壤pH值的影響

土壤pH值是控制重金屬吸附-解吸和沉淀-溶解平衡的主要因素，能決定重金屬的賦存形式和生物有效性[23]。3種有機酸的添加對土壤pH值產(chǎn)生了一定的影響，具體變化情況與有機酸的類型及其施用濃度有關(guān)(圖2)。龍葵在生長過程中根際會分泌一定量的有機酸、氨基酸等物質(zhì)，使得盆栽后土壤pH值較原土有所降低。試驗后各處理與對照土壤的pH值相比也呈下降趨勢。降幅最大的是草酸處理組，其土壤pH值分別比CK顯著下降了0.27(OA2.5)和0.32(OA5)，和其他處理相比也有顯著差異(P<0.05)；其次是氨三乙酸處理組，降幅分別為0.16(NTA2.5)和0.18(NTA2.5)，與對照及其他有機酸之間差異顯著(P<0.05)；而檸檬酸處理組的降幅僅為0.02(CA2.5)和0.03(CA2.5)，和對照相比并無顯著區(qū)別。同一種酸處理條件下，均表現(xiàn)為高濃度處理(5 mmol·kg-1)的土壤pH值降幅大于低濃度處理(2.5 mmol·kg-1)，但相互之間差異并不明顯(P>0.05)。

圖2 不同有機酸對土壤pH值的影響

2.5 土壤pH值、土壤有效態(tài)鎘含量與龍葵鎘含量的相關(guān)性

對土壤pH值、土壤有效態(tài)Cd含量與龍葵地上部Cd含量間進行了相關(guān)性分析(表3)，結(jié)果表明，本研究中土壤pH值與土壤有效態(tài)Cd含量和龍葵地上部Cd含量均呈極顯著負相關(guān)(P<0.01)，其相關(guān)系數(shù)分別為-0.723和-0.870，說明pH值是影響土壤Cd有效性的重要因素。土壤有效態(tài)Cd含量與龍葵地上部Cd含量的相關(guān)系數(shù)為0.572，也達極顯著相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，表明土壤有效態(tài)Cd含量的降低是阻礙龍葵地上部Cd吸收的重要原因。

表3 土壤pH值、土壤有效態(tài)Cd含量與龍葵地上部Cd含量之間相關(guān)性Table 3 Correlation between soil pH, soil available Cd content and aboveground Cd content of Solanum nigrum L

3 結(jié)論與討論

超積累植物是指地上部分的重金屬積累量是普通植物的100倍或以上，要高于一定的臨界值，即Cd含量在100 μg·g-1以上，Co、Cu、Ni、Pb 含量在1 000 μg·g-1以上，Mn、Zn含量在10 000 μg·g-1以上且對重金屬的轉(zhuǎn)運系數(shù)大于1的植物[24]。超積累植物的生長狀況是反應植物提取修復能力的重要指標[25]。因此，在利用有機酸等螯合劑活化土壤中的Cd進而強化植物提取修復的同時，也要關(guān)注這些外源物質(zhì)添加后對超積累植生長的影響。結(jié)果表明，3種低相對分子質(zhì)量有機酸對植物生長的影響各異。其中促進效果最強的是5 mmol·kg-1的草酸，能使龍葵的株高、單株鮮質(zhì)量和單株干質(zhì)量等指標與對照相比均有顯著提高；與之不同的是，兩種濃度下的檸檬酸施用對龍葵生長無明顯影響，而氨三乙酸甚至顯示出了顯著的抑制作用?？赡苁且驗樵谕粷舛认拢菟岬慕怆x常數(shù)最高，最易解離和釋放H+，導致土壤pH值降幅大于檸檬酸[26]，將其添加到土壤后使呈微堿性的石灰土中的部分養(yǎng)分得到釋放，改善了根際環(huán)境和營養(yǎng)狀況。而氨三乙酸雖然也能降低土壤pH值，但其本身對龍葵可能具有一定毒害效應，再與Cd脅迫狀況進行疊加，引起龍葵的黃化、萎蔫，甚至是死亡，進而造成株高和生物量的降低[27-29]。

利用低相對分子質(zhì)量有機酸活化土壤中的重金屬來提高植物對重金屬的吸收, 是植物修復研究的方向之一。但低相對分子質(zhì)量有機酸對土壤中重金屬的活化和植物對重金屬的吸收隨有機酸的種類和重金屬元素的類型而異[30-31]。本研究發(fā)現(xiàn)，草酸和氨三乙酸2種有機酸的添加均顯著提高了龍葵對Cd的富集能力，使龍葵的地上部Cd含量和富集系數(shù)呈增加趨勢，而檸檬酸促進作用不明顯。原因主要有兩方面，一是在本研究中土壤酸堿性與Cd有效性呈極顯著負相關(guān)關(guān)系。與檸檬酸相比，草酸和氨三乙酸添加后使土壤pH值的降低幅度更大，不僅可以提高土壤溶液的離子態(tài)Cd的濃度，而且可以促進土壤中礦物的解析，使得土壤中的黏粒、氧化物等表面電荷發(fā)生變化，從而減少對鎘的吸附能力，使得土壤有效態(tài)鎘含量增加，利于植物對Cd的吸收[32]；二是不同種類的有機酸所含的功能基團和螯合能不同，對土壤Cd2+解吸的促進能力也不相同[33]，具體機制有待進一步研究。遷移系數(shù)是指地上部某元素質(zhì)量分數(shù)與根系某元素質(zhì)量分數(shù)之比，是用來評價重金屬元素從根部向地上部遷移能力的指標。3種有機酸添加后均促進了Cd從龍葵根部向地上部的遷移，可能是因為有機酸提高了Cd的流動性，激活了細胞質(zhì)膜上的ATP酶，引起負責重金屬轉(zhuǎn)運的離子通道發(fā)生了變化，從而改變了Cd在龍葵根部和地上部之間的分配[34]。地上部Cd提取量是在疊加了植物生長狀況及重金屬吸收狀況的綜合反映，能夠評判強化方法或措施對修復效率影響的總體結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)，氨三乙酸的施用對龍葵的生長抑制作用大于其對Cd吸收的促進作用，因此2個濃度(2.5 mmol·kg-1和5 mmol·kg-1)下，地上部單株提取量和對照相比均有顯著降低。在一定濃度范圍內(nèi)，施加草酸能實現(xiàn)石灰土上龍葵生物量提升與Cd含量增加的“雙贏”，促進龍葵對Cd污染土壤的修復。

本研究通過在Cd污染石灰土上添加3種類型和兩個施用濃度的有機酸，來探討其對龍葵修復Cd污染土壤的強化效果。綜合植物生長指標和Cd含量指標，發(fā)現(xiàn)5 mmol·kg-1的草酸能夠顯著提高龍葵的修復效率，并從土壤Cd有效性的變化及土壤pH值的變化方面對其作用機理進行了初步探討。然而，土壤是一個復雜的綜合體，土壤養(yǎng)分、土壤物理性質(zhì)、土壤酶活性和土壤微生物狀況均有可能對植物的生長及Cd形態(tài)變化產(chǎn)生影響[35-37]，需要進行多角度的分析，才能對作用機理有更深刻的認識。本研究取得的是室內(nèi)盆栽試驗結(jié)論，在野外實踐中，隨著氣候和地形等自然地理條件的變化，其施用效果如何，有待進一步探討。