張朝輝 張 廣 閆 鵬 杜田雨 趙涔岑李明輝 閆新悅 王振河

(1河南科技學院生命科技學院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003)

平菇(Pleurotus ostreatus)，學名糙皮側(cè)耳，是世界上廣泛栽培的木腐型食用菌，同時也是我國重要的商業(yè)化食用菌之一[1]。據(jù)報道，平菇產(chǎn)量在我國所有食用菌中居第三位[2]。平菇具有較高的營養(yǎng)價值，富含蛋白質(zhì)、維生素、海藻糖及礦物質(zhì)元素；其蛋白多糖能夠增強人體的免疫功能，且對癌細胞具有較強的抑制作用，因此具有較高的藥用價值[3]。平菇生產(chǎn)中多采用發(fā)酵料或生料栽培[4]，極易感染雜菌，但使用殺菌劑會導致藥劑濫用和農(nóng)藥殘留等問題，限制了我國平菇產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[5]。

平菇生產(chǎn)中常見的病害主要包括真菌性病害、細菌性病害和病毒性病害[6]。其中，真菌性病害的病原體與平菇同屬真菌，且二者在生理特性方面的差異小，故平菇真菌病害為平菇生產(chǎn)最難防治的病害[7]。鐮刀菌(Fusariumspp.)引起的平菇枯萎病，最早報道于1992年[8]，是平菇生產(chǎn)過程中較常見的病原真菌[9]，對平菇生產(chǎn)造成嚴重的危害。平菇枯萎病主要發(fā)生在幼菇階段，發(fā)病初期，菇體呈軟腐癥狀，之后呈失水軟革質(zhì)狀，最后菇體變褐而枯萎。若第一潮菇染病嚴重，第二潮菇在菇體階段就停止發(fā)育而枯萎[8]。在平菇生產(chǎn)中，該病常與平菇其他霉菌病害同時發(fā)生，常通過添加適量的單一殺菌劑來防治平菇枯萎病等病害。

平菇生產(chǎn)中專用的殺真菌劑較少，大多來自用于農(nóng)作物和果樹等的殺真菌劑，如多菌靈、克霉靈、使百功、百菌清、甲霜靈·錳鋅、代森錳鋅和甲基硫菌靈等[10－11]。菇農(nóng)在平菇生產(chǎn)中常使用單一殺菌劑防治真菌病害，然而長期使用高濃度的單一殺菌劑造成病原菌的抗藥性不斷增強，形成病害與施藥量逐漸增加的惡性循環(huán)[12]，進而造成平菇子實體中農(nóng)藥殘留超標[11]，嚴重影響平菇的深加工和出口創(chuàng)匯。而對不同殺菌劑進行復配可以擴大抗菌譜，不僅優(yōu)于單一藥劑的防治效果[12－13]，而且能減少藥劑使用量和延緩病原菌出現(xiàn)抗藥性，有效延長殺菌劑使用壽命，同時解決食用菌農(nóng)藥殘留超標等問題。但目前有關(guān)復配殺菌劑在平菇栽培中的應(yīng)用尚鮮有報道。

本研究選用平菇生產(chǎn)中常用的殺真菌劑使百功、克霉靈和多菌靈[14]，進行兩兩復配組合，探究復配殺菌劑對平菇生產(chǎn)中常見病原菌尖孢鐮刀菌的抑菌效果及其在平菇栽培中的應(yīng)用效果，以期為開發(fā)平菇栽培中適用的新型復配藥劑提供理論依據(jù)，并為解決食用菌農(nóng)藥殘留超標問題提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試藥劑 50%使百功可濕性粉劑，上海迪拜農(nóng)藥有限公司，有效成分為咪鮮胺錳鹽，是真菌麥角甾醇生物合成抑制劑；50%多菌靈可濕性粉劑，青島益農(nóng)化工有限公司，有效成分為N－(2－苯并咪唑基)－氨基甲酸甲酯，干擾病原菌有絲分裂中紡錘體的形成，影響其細胞分裂；40%克霉靈可濕性粉劑，中鑫化工有限公司，有效成分為二氯異氰尿酸鈉，溶于水后產(chǎn)生次氯酸，易擴散滲透進入菌體內(nèi)，使菌體蛋白氧化導致死亡。

1.1.2 供試菌株 平菇(Pleurotus ostreatus):灰美2號，河南省農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究開發(fā)中心保藏；尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum):河南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)微生物酶工程重點實驗室保藏。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Waters Acquity UPL? CH-CLASS 型超高效液相色譜-Xevo TQD MS 型三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Waters 公司；ZXSD－A1160 生化培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司；K9840 自動凱氏定氮儀，濟南海能儀器股份有限公司；B－811 自動脂肪測定儀，瑞士Buchi 公司；752N 紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 藥劑配制 復配殺菌劑采用兩兩組合:使百功＋多菌靈；使百功＋克霉靈；多菌靈＋克霉靈。在平板試驗中，根據(jù)單藥劑的有效中濃度(median effective concentration，EC50)[15]設(shè)計復配殺菌劑的加藥濃度范圍，復配殺菌劑影響尖孢鐮刀菌菌絲生長的試驗濃度范圍設(shè)計為0.5～16 mg·L－1，復配殺菌劑影響平菇菌絲生長的試驗濃度范圍設(shè)計為16～512 mg·L－1。兩種藥劑按質(zhì)量比1 ∶1進行復配[16]，3 種單藥使用的質(zhì)量濃度與復配藥劑一致。袋栽平菇試驗中，單藥和復配殺菌劑的加藥濃度則依據(jù)栽培經(jīng)驗中常用加藥濃度，按照質(zhì)量百分比加入。

復配殺菌劑的EC50理論值(X1) 及增效系數(shù)(synergistic ratio，SR)的計算參考張權(quán)等[17]的方法，計算公式如下:

式中，PA為復配殺菌劑中單藥A 的百分含量；PB為復配殺菌劑中單藥B 的百分含量；A、B 分別為2 種單藥的EC50值，mg·L－1。

式中，X1為復配殺菌劑EC50理論值，mg·L－1；X2為復配殺菌劑EC50實際值，mg·L－1。

通過比較SR 評價復配殺菌劑的聯(lián)合作用類型，SR>1.5 為增效作用，0.5≤SR≤1.5 為相加作用，SR<0.5 為拮抗作用，從而評價藥劑效果[18]。

1.3.2 復配殺菌劑影響尖孢鐮刀菌和平菇菌絲生長的測定 采用平板菌絲生長速率法對供試殺菌劑進行室內(nèi)毒力測定[17，19]。每個處理設(shè)定5 次重復，未加藥組為CK。菌絲生長速率和相對抑制率的計算參考李月月等[20]的方法。菌絲生長速率(mm·d－1)＝內(nèi)外圈距離/兩次劃線間隔時間；菌絲生長相對抑制率＝(未加藥組菌絲生長速率－加藥組菌絲生長速率)/未加藥組菌絲生長速率×100%。

1.3.3 復配殺菌劑在平菇栽培中的防霉菌效果測定 平菇栽培試驗采用發(fā)酵料栽培方式，栽培料配方為:玉米芯80%、麩皮10%、玉米粉5%、石灰3%、磷酸二銨1%、石膏1%，料水混合，料水質(zhì)量比1 ∶1.6。建堆發(fā)酵和裝袋均參見張權(quán)等[17]的方法。在最后一次翻堆發(fā)酵時加入供試藥劑，劑量分別為培養(yǎng)料干重的0.1%、0.2%、0.3%，未加藥組為CK，每處理300 個重復。25℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)開始時，在培養(yǎng)室內(nèi)采用噴霧法均勻噴灑濃度為1×105CFU·mL－1的尖孢鐮刀菌孢子溶液[8]，統(tǒng)計菌絲生長速度、雜菌污染情況及生物學效率[11]。其中雜菌污染的統(tǒng)計階段是從裝袋結(jié)束到出菇結(jié)束，污染的雜菌通過分離培養(yǎng)，并根據(jù)其形態(tài)進行鑒定。

1.3.4 農(nóng)藥殘留測定 樣品的采集、提取、凈化和液相色譜及質(zhì)譜檢測均參照賀敏等[10]的方法。質(zhì)譜條件:電噴霧離子源，正離子模式；毛細管電壓3.20 kV；離子源溫度150℃；去溶劑溫度350℃；以高純液氮為去溶劑氣和錐孔氣，去溶劑氣流速為550 L·h－1，錐孔氣流速為40 L·h－1，碰撞氣為高純氬氣；采用多反應(yīng)離子監(jiān)測模式，用基質(zhì)匹配標準溶液的外標法進行定量。

1.3.5 平菇基本營養(yǎng)成分測定 為探究復配殺菌劑對平菇基本營養(yǎng)成分的影響，本試驗對平菇子實體中粗脂肪、粗蛋白和粗多糖等含量進行了測定。其中，粗脂肪含量測定根據(jù)GB/T 15674－2009[21]的方法；粗蛋白含量測定根據(jù)GB/T 15673－2009[22]的方法；粗多糖含量測定依據(jù)NY/T 1676－2008[23]的方法。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 使用GraphPad Prism 7 進行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以平均值±標準偏差形式表示，使用Oneway ANOVA 進行方差分析，P<0.05 被認為具有統(tǒng)計學顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 復配殺菌劑對尖孢鐮刀菌菌絲生長的影響

由圖1 可知，隨著藥劑質(zhì)量濃度的增加，單藥處理與復配殺菌劑處理對尖孢鐮刀菌菌絲生長的抑制效果均逐漸增強，同時，在相同質(zhì)量濃度時(除0.5 mg·L－1外)，復配殺菌劑對尖孢鐮刀菌的抑制作用均顯著高于單藥。當藥劑質(zhì)量濃度為0.5～16 mg·L－1時，6 種處理(使百功、多菌靈、克霉靈、使百功＋多菌靈、使百功＋克霉靈、多菌靈＋克霉靈)對尖孢鐮刀菌菌絲的抑制率分別為1.04% ～62.09%、1.34% ～70.45%、2.24% ～69.85%、7.76%～98.51%、15.37%～97.01%、1.04%～84.18%，其中使百功＋多菌靈、使百功＋克霉靈復配處理對尖孢鐮刀菌的抑制效果較好。

圖1 復配殺菌劑對尖孢鐮刀菌菌絲生長的影響Fig.1 The influence of fungicide combinations on the fungal growth of F. oxysporum

由表1 可知，單藥處理中克霉靈對尖孢鐮刀菌的EC50值最低，為9.77 mg·L－1；3 種復配殺菌劑處理(使百功＋多菌靈、使百功＋克霉靈、多菌靈＋克霉靈)對尖孢鐮刀菌的EC50值均顯著小于各單藥，根據(jù)增效系數(shù)分別表現(xiàn)為增效、增效和相加作用，其中使百功＋多菌靈處理的EC50值最小(3.67 mg·L－1)，其增效系數(shù)最大(2.904 9)，效果最好。

表1 復配殺菌劑對尖孢鐮刀菌菌絲生長的EC50Table 1 The EC50 of fungicide combinations on the fungal growth of F. oxysporum

2.2 復配殺菌劑對平菇菌絲生長的影響

由圖2 可知，隨著藥劑質(zhì)量濃度的增加，單藥處理與復配殺菌劑處理對平菇菌絲生長的抑制效果均逐漸增強，且在相同質(zhì)量濃度(128～512 mg·L－1)時，復配殺菌劑(使百功＋多菌靈、使百功＋克霉靈)對平菇的抑制作用高于單藥。當藥劑質(zhì)量濃度為16～512 mg·L－1時，6 種處理(使百功、多菌靈、克霉靈、使百功＋多菌靈、使百功＋克霉靈、多菌靈＋克霉靈)對平菇菌絲的抑制率分別為7.18%～62.23%、0.27%～49.07%、0.27%～ 62.23%、 4.90% ～ 63.74%、 12.50% ～ 86.88%、13.16%～86.13%，其中使百功＋多菌靈、使百功＋克霉靈復配對平菇的抑制效果較強，單藥劑處理中多菌靈的抑制效果較弱。

圖2 復配殺菌劑對平菇菌絲生長的影響Fig.2 The influence of fungicide combinations on the fungal growth of P. ostreatus

由表2 可知，單藥處理中使百功對平菇的EC50值小于多菌靈和克霉靈，其對平菇菌絲生長的抑制效果最強；3 種復配殺菌劑處理(使百功＋多菌靈、使百功＋克霉靈、多菌靈＋克霉靈)對平菇的EC50值均顯著小于各單藥處理，且均表現(xiàn)為增效作用，其中使百功＋克霉靈處理對平菇的EC50值最小(121.97 mg·L－1)，且增效系數(shù)最大(2.515 0)，說明該復配殺菌劑對平菇菌絲生長的抑制效果最強。

表2 復配殺菌劑對平菇菌絲生長的EC50Table 2 The EC50 of fungicide combinations on the fungal growth of P. ostreatus

2.3 復配殺菌劑在平菇栽培中的應(yīng)用效果

2.3.1 復配殺菌劑對袋栽平菇菌絲生長速度的影響 由表3 可知，在平菇發(fā)酵料栽培試驗中，與CK(未添加藥劑)相比，0.2%使百功和0.3%多菌靈處理的袋栽平菇菌絲生長速度顯著增加，分別增加了5.1%和6.8%(P<0.05)；使百功＋克霉靈處理的袋栽平菇菌絲生長速度均顯著高于CK，其中0.3%使百功＋克霉靈處理的袋栽平菇菌絲生長速度最快，顯著高于同濃度的單藥處理(P<0.05)。

2.3.2 復配殺菌劑對袋栽平菇生物學效率的影響 由表3 可知，袋栽平菇試驗中，與CK 相比，所有復配殺菌劑處理的平菇袋栽生物學效率均顯著增加(P<0.05)，增加5.1～22.5 個百分點；除0.3%使百功＋多菌靈和0.1%多菌靈＋克霉靈處理外，其余復配殺菌劑處理的袋栽平菇生物學效率均顯著高于同濃度的單藥處理(P<0.05)，增加3.2～24.4 個百分點。

2.3.3 復配殺菌劑對袋栽平菇污染率的影響 由表3 可知，袋栽平菇試驗中，所有處理的尖孢鐮刀菌污染率和其他霉菌的污染率均隨藥劑質(zhì)量濃度升高呈降低趨勢；與CK 相比，所有復配殺菌劑處理的尖孢鐮刀菌污染率均顯著降低(P<0.05)，降低1.8～6.5 個百分點；除0.1%多菌靈＋克霉靈處理外，其余復配殺菌劑處理的尖孢鐮刀菌污染率均顯著低于同濃度的單藥處理。其中，0.3%使百功＋克霉靈處理的袋栽平菇尖孢鐮刀菌污染率最低，為0.8%，較CK 降低了6.5 個百分點。經(jīng)鑒定，平菇栽培試驗中感染的雜菌主要有綠霉、尖孢鐮刀菌、毛霉和根霉等。

表3 復配殺菌劑在平菇栽培中的應(yīng)用效果Table 3 The applied effect of fungicide combinations in the cultivation of P. ostreatus

2.4 復配殺菌劑對平菇農(nóng)藥殘留和基本營養(yǎng)成分的影響

由表4 可知，袋栽平菇試驗中，平菇子實體中使百功與多菌靈的農(nóng)藥殘留量隨藥劑質(zhì)量濃度的增加而增高，復配殺菌劑處理的平菇子實體中使百功和多菌靈的殘留量均顯著低于同濃度的單藥處理。與0.3%使百功和0.3%多菌靈處理相比，0.3%使百功＋多菌靈處理的平菇子實體中使百功和多菌靈殘留量分別降低68.0%和73.8%，0.3%使百功＋克霉靈處理的平菇子實體中使百功殘留量降低71.8%，0.3%多菌靈＋克霉靈處理的平菇子實體中多菌靈殘留量降低68.1%。克霉靈殘留量在所有處理中均未檢出，可能是因為平菇在新陳代謝過程中將其降解或轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)。單藥或復配使用使百功處理，子實體中的使百功殘留量介于12.32～110.95 μg·kg－1之間，遠低于我國食品安全國家標準中農(nóng)藥最大殘留限量(2 mg·kg－1)[24]和歐盟在新鮮菇類中的最大殘留限量(3 mg·kg－1)[25]；單用多菌靈處理，子實體中多菌靈殘留量介于61.13～132.59 μg·kg－1之間，接近或超過歐盟在新鮮菇類中的最大殘留限量(0.1 mg·kg－1)，而復配使用多菌靈處理，子實體中多菌靈殘留量介于8.12～42.23 μg·kg－1之間，遠低于歐盟在新鮮菇類中的最大殘留限量(0.1 mg·kg－1)[25]。

表4 復配殺菌劑處理對平菇藥劑殘留的影響Table 4 The influence of fungicide combinations to the fungicide residue in P. ostreatus

由表5 可知，在袋栽平菇試驗中，與CK 相比，單藥和復配殺菌劑處理的平菇子實體中粗脂肪的含量未發(fā)生顯著變化，0.2%復配殺菌劑處理的平菇子實體中粗蛋白和粗多糖的含量均未發(fā)生顯著變化；使百功＋克霉靈處理不同質(zhì)量濃度之間平菇的基本營養(yǎng)成分均無顯著差異。

3 討論

在平菇栽培中，現(xiàn)有防治雜菌的措施主要有物理方法和化學方法，化學方法以應(yīng)用化學殺菌劑為主[26－27]，單一化學殺菌劑的長期連續(xù)使用已致使包括尖孢鐮刀菌在內(nèi)的多種食用菌病原菌產(chǎn)生抗性。開發(fā)新型殺菌劑或替代藥品以緩解病原菌的抗藥性顯得尤為重要。但新型殺菌劑開發(fā)難度大，利用現(xiàn)有殺菌劑進行復配增加藥劑的功效并延長其使用壽命，已成為一種切實可行的方法[13]。在植物真菌性病害的防治過程中，已有較多學者針對不同殺菌劑復配的增效作用開展了研究。畢秋艷等[28]研究發(fā)現(xiàn)，福美雙與啶菌惡唑以5 ∶1的比例進行復配對植物病原菌灰葡萄孢(Botrytis cinerea)具有協(xié)同抑制作用。殺菌劑復配協(xié)同增效作用的機理，可能與復配藥劑增加了靶標位點[29]或分別作用于病原菌的不同生長階段等[30]有關(guān)。

殺菌劑的復配在食用菌栽培中的研究則比較少見。前期研究發(fā)現(xiàn)，在平菇栽培中，多菌靈、使百功和克霉靈分別以1 ∶1兩兩復配時均可顯著增加其對根霉菌的抑制效果，復配殺菌劑的防雜增產(chǎn)效果顯著優(yōu)于單藥[17]。本研究也發(fā)現(xiàn)，多菌靈、使百功和克霉靈以1 ∶1兩兩復配時均顯著增加了其對尖孢鐮刀菌的抑制效果。此外，3 種單藥對尖孢鐮刀菌生長抑制的EC50值均明顯小于其對根霉菌生長抑制的EC50值(使百功:112.65 mg·L－1；多菌靈:301.25 mg·L－1；克霉靈:275.31 mg·L－1)，暗示尖孢鐮刀菌對這3 種殺菌劑的敏感性均強于根霉菌；本研究中多菌靈和克霉靈單藥處理及3 種復配殺菌組合處理對平菇(灰美2 號)生長抑制的EC50值也均顯著小于前期研究中其對平菇(德豐5 號)生長抑制的EC50值[17]，說明殺菌劑及其復配組合對不同平菇品種菌絲生長的影響存在一定的差異，在平菇栽培中，需要根據(jù)平菇品種確定所用殺菌劑的濃度。多菌靈、使百功和克霉靈兩兩復配在平菇栽培中的增效作用機理，可能與這3 種殺菌劑在平菇中的靶標位點不同，從而增加了抑菌作用有關(guān)。

在藥劑試驗中，多數(shù)研究均忽略了藥劑對施用對象營養(yǎng)成分的影響及其在施用對象本身中的殘留量。前期研究結(jié)果雖表明復配殺菌劑在平菇栽培中的防雜增產(chǎn)效果顯著優(yōu)于單藥，但未研究其對平菇營養(yǎng)成分和其在平菇子實體中藥劑殘留的影響[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，與未添加藥劑的對照相比，使百功＋克霉靈處理在降低平菇袋栽污染率的同時，未顯著影響平菇子實體中的粗蛋白、粗脂肪和粗多糖等基本營養(yǎng)成分。此外，平菇栽培中施用相同質(zhì)量濃度(0.3%)的殺菌劑時，復配殺菌劑處理的平菇子實體中使百功和多菌靈的殘留量均顯著低于單一殺菌劑的殘留量，降幅為68.0%～73.8%，這可能是因為使百功和多菌靈在平菇中的靶標位點和作用機制不同，二者協(xié)同使用，增加了抑菌效果，進而降低了復配中單一藥劑的使用量。此結(jié)果再次證實復配殺菌劑在防雜增產(chǎn)的同時可有效降低平菇子實體中的農(nóng)藥殘留量。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)使百功＋克霉靈處理顯著抑制了平菇病原菌尖孢鐮刀菌的菌絲生長，也顯著降低了平菇子實體中的農(nóng)藥殘留量，同時未影響平菇子實體的基本營養(yǎng)成分，對平菇的防雜增產(chǎn)效果顯著優(yōu)于單一殺菌劑。使百功與克霉靈復配用于防治平菇枯基病效果最佳。

表5 復配殺菌劑處理對平菇基本營養(yǎng)成分的影響Table 5 The influence of fungicide combinations to the nutritional composition of P. ostreatus