許俊旭 李青竹 李 葉 楊柳燕 張永春 蔡友銘

(1上海市農業(yè)科學院林木果樹研究所，上海 201403；2上海市金山區(qū)廊下鎮(zhèn)農業(yè)技術推廣服務站，上海 201516)

石蒜[Lycoris radiata(L’Her.) Herb.]是具有較高觀賞和藥用價值的鱗莖類植物，常用于生產鮮切花、盆花以供應城市園林綠化，也可栽植于林下打造成獨特的林下景觀[1]。另外，石蒜鱗莖中提取出的生物堿被證明具有抵抗病毒、炎癥、腫瘤和癌癥的作用[2]。然而，由于石蒜鱗莖的自然膨大過程很慢，從種子萌發(fā)到進入商品階段需4—5年，無法滿足商業(yè)化生產的需求。為了滿足這種需求，石蒜自然棲息地遭到大量破壞性開采，極大地縮減了我國的野生石蒜資源[3]。因此，研究如何加速石蒜鱗莖的膨大具有重要意義。

淀粉是石蒜鱗莖膨大的物質基礎。有研究表明，隨著石蒜鱗莖的膨大，淀粉含量逐漸積累[4]。前人對換錦花(Lycoris sprengeriComes ex Baker.)種球膨大過程進行研究后發(fā)現(xiàn)，隨著換錦花鱗莖的膨大，淀粉粒積累明顯，淀粉和蔗糖含量逐漸上升[3]。因此，石蒜屬植物鱗莖膨大過程中鱗莖主要以淀粉的形式儲存營養(yǎng)物質，這對于其后續(xù)的生長發(fā)育都是必要的。

淀粉的積累和代謝過程受一系列基因的調控，這些基因也被證明與變態(tài)根莖的膨大密切相關。在甘薯[Ipomoea batatas(L.) Lam.]中，腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(glucose-1-phosphate adenylyltransferase，AGPase)、顆粒結合型淀粉合成酶基因(granule-bound starch synthase，GBSS)、可溶性淀粉合成酶基因(soluble starch synthase，SSS)、淀粉分支酶基因(starch branching enzyme，SBE)等與淀粉合成密切相關，直接決定了甘薯塊根中淀粉的含量，從而調控塊根的膨大[5]。另外，在蔬菜變態(tài)根莖的發(fā)育過程中，淀粉的合成和積累受編碼淀粉脫支酶(isoamylase，ISA)、SBE、GBSS 以及α－淀粉酶和β－淀粉酶等相關基因的調控[6]。然而，關于這些基因在石蒜鱗莖膨大過程中的調控作用還有待進一步揭示。

此外，糖也在石蒜鱗莖膨大過程中起關鍵調控作用，能夠為鱗莖的形態(tài)建成和發(fā)育提供能量[7－8]，并可能通過加速細胞分裂的方式促進鱗莖的膨大[4]。在其他植物的研究中，糖合成、代謝及運輸相關基因都參與調控變態(tài)根莖的發(fā)育過程[6]。其中，蔗糖合酶基因(sucrose synthase，SUS) 被證明可能是調節(jié)蘿卜(Raphanus sativusL.)肉質根蔗糖水平、控制肉質根庫活性的關鍵基因[9]；蔗糖轉化酶基因(invertase，INV)被證明正向調控蕪菁(Brassica rapaL.)肉質根內果糖和葡萄糖含量，從而加快根中生物量的積累[10]，然而這些基因是否參與調控石蒜鱗莖的膨大還鮮見相關報道。另外，糖轉運蛋白(sugar transporter protein，SUT)作為一種糖轉運載體，也能在植物生長發(fā)育等生理過程中發(fā)揮重要作用[11]。目前，關于糖轉運蛋白在調控果實發(fā)育方面的研究較多，其與果實的發(fā)育、成熟以及糖積累等過程密切相關，如葡萄(Vitis viniferaL.)[12]、杏(Armeniaca vulgarisLam.)[13]、 番茄(Solanum lycopersicumMill.)[14]等，然而關于SUT 在鱗莖發(fā)育過程中的研究還較少。

本研究中以前期構建的同一遺傳背景下石蒜自然膨大的鱗莖為材料，利用轉錄組測序的方式，篩選并研究此過程中碳水化合物相關基因的表達變化，并結合分析淀粉、可溶性糖、蔗糖含量，蔗糖合酶、淀粉合成酶以及淀粉分解酶活性的變化，探討碳水化合物代謝與石蒜鱗莖膨大調控的關系，以期為后續(xù)利用分子生物學等手段提高碳水化合物合成、代謝速率，從而加速石蒜鱗莖的膨大提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為前期構建的同一遺傳背景下膨大程度不同的石蒜小鱗莖，這些小鱗莖起源于同一個母球，通過在不同的時間點進行切割后扦插繁殖獲得[1]。于2019年1月，當石蒜處于營養(yǎng)生長期時，分別挖取月齡為3、6、12、24 個月4 個不同生長階段的未分球的鱗莖，并分別編號為S1、S2、S3 和S4，每個生長階段取6個大小一致的鱗莖(2 個為1 次重復，設3 次重復)，去葉、去根、去除鱗莖褐色皮膜，清洗干凈晾干后，記錄鱗莖直徑、周徑和鮮重，液氮速凍，－80℃凍存。

1.2 碳水化合物含量測定

采用蒽酮比色法[15]測定石蒜鱗莖中淀粉含量、蔗糖含量以及可溶性糖含量。稱取約0.5 g 樣品，在液氮中磨成粉末后加入4 mL 80% (v/v)乙醇，在80℃下萃取30 min，8 000×g離心20 min。取上清液用活性炭脫色后用于蔗糖和可溶性糖含量測定；沉淀物依次用9.2 mol·L－1和4.6 mol·L－1的HClO4溶液重懸浮，去除乙醇可溶性糖殘留物后用于淀粉含量測定。

1.3 碳水化合物代謝相關酶活性測定

1.3.1 蔗糖合酶(SUS) 稱取約0.5 g 樣品，在液氮中磨成粉末后加入2 mL pH 值7.5 的提取液進行萃取，萃取液組分為:50 mmol·L－14－羥乙基哌嗪乙磺酸{2－[4－(2-hydroxyethyl)piperazin－1-yl]ethanesulfonic acid，HEPES }，2.5 mmol · L－1二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)，5 mmol·L－1MgCl2，0.05% (v/v)Triton X－100，1 mmol·L－1乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)，0.1% (w/v) BSA，2% (w/v)聚乙烯聚吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)；4℃、8 000×g離心15 min，收集上清液，參考趙智中等[16]的方法測定分解方向SUS 活性。

1.3.2 淀粉合成酶 稱取約0.5 g 樣品，在液氮中磨成粉末后加入5 mL 提取液[100 mmol·L－1pH 值7.5的HEPES-NaOH，8 mmol·L－1MgCl2，2 mmol·L－1EDTA，50 mmol·L－1β－巰基乙醇，12.5% (v/v)甘油，1% (w/v) PVP－40]，4℃、8 000×g離心15 min，收集上清液，參考Nakamura 等[17]和Wu 等[18]的方法測定AGPase、SSS 和GBSS 活性。

1.3.3 淀粉分解酶 稱取約0.5 g 樣品，在液氮中磨成粉末后加入5 mL 蒸餾水，室溫提取15 min，8 000×g離心10 min，收集上清液，參考王學奎[19]的方法測定α－淀粉酶和β－淀粉酶的活性。

上述酶活性均用對應樣品中可溶性蛋白的含量進行換算，而可溶性蛋白含量的測定參考Bradford[20]的方法。

1.4 碳水化合物代謝相關基因的篩選及差異表達分析

根據(jù)前期已獲得的石蒜鱗莖4 個生長階段的轉錄組測序結果[1]，在七大公共數(shù)據(jù)庫中對Unigene 序列進行注釋，包括NR、NT、Swissprot、KEGG、KOG、Pfam和GO 數(shù)據(jù)庫，根據(jù)注釋結果篩選碳水化合物代謝相關基因，包括糖代謝及運輸、淀粉合成及代謝相關Unigene。

對已篩選得到的Unigene 進一步篩選生物學重復樣品間的差異表達基因，Unigene 的表達水平基于FPKM(fragments per kilobase million)值來進行計算，其篩選條件則為FDR (false discovery rate)<0.05 以及｜log2 foldchange ｜≥1。

1.5 石蒜鱗莖RNA 的提取、反轉錄及qRT-PCR

石蒜鱗莖總RNA 的提取利用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit[寶生物工程(大連)有限公司]試劑盒進行，提取步驟參考試劑盒說明書。對提取出的總RNA 進行質量檢測，將檢驗合格后的RNA 利用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser[寶生物工程(大連)有限公司]試劑盒反轉錄成cDNA。

將新合成的cDNA 母液稀釋10 倍后用作實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)分析，反應體系的配置參照TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ[寶生物工程(大連)有限公司]試劑盒進行，反應體系中所需各基因引物序列如表1 所示，隨后的qRTPCR 反應利用ABI 7500 熒光定量PCR 儀(美國ABI公司)進行。

表1 用于qRT-PCR 分析的引物序列Table 1 Primers used for qRT-PCR analysis

2 結果與分析

2.1 石蒜鱗莖膨大過程中碳水化合物含量的變化

隨著石蒜鱗莖的膨大，鱗莖中蔗糖和可溶性糖含量不斷升高，而淀粉含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(圖1)。

圖1 石蒜鱗莖膨大過程中碳水化合物含量的變化Fig.1 Changes in carbohydrate contents in Lycoris radiata bulbs at different stages

2.2 石蒜鱗莖膨大過程中碳水化合物代謝相關酶活性的變化

對石蒜鱗莖膨大過程中蔗糖合酶SUS(分解方向)，淀粉合成酶AGPase、SSS 和GBSS，淀粉分解酶α－淀粉酶和β－淀粉酶活性的變化進行檢測，發(fā)現(xiàn)隨著石蒜鱗莖的膨大，鱗莖中碳水化合物代謝相關酶的活性都有升高的趨勢(圖2)，但除SUS 外，同一類型酶活性的變化存在一定差異。在淀粉合成相關酶中，以AGPase 活性的變化更為明顯，其次是SSS 和GBSS；而在淀粉分解酶中，β－淀粉酶活性的變化比α－淀粉酶更為明顯。

圖2 石蒜鱗莖膨大過程中碳水化合物相關酶活性的變化Fig.2 Changs in the activity of carbohydrate metabolism enzymes in Lycoris radiata bulbs at different stages

2.3 糖運輸相關差異基因的表達模式

對糖運輸相關差異基因進行了篩選，發(fā)現(xiàn)至少在1 個比較組中鑒定到10 個差異基因，包括糖轉運蛋白(sugar transport protein)STP基因、糖外排轉運蛋白(sugars will eventually be exported transporters)SWEET基因以及蔗糖轉運蛋白(sucrose transport protein)SUT基因(圖3)。除SWEET2a(CL11105_C1)和SUT3(Uni_24278)外，其他8 個基因的表達水平都在石蒜鱗莖膨大過程中上調，尤其以STP6(CL8401_C4)、SWEET13(CL1771_C2)和SUT2(CL4350_C1)基因的表達變化更為明顯。

圖3 各比較組中糖運輸相關基因的差異表達模式Fig.3 Differential expression patterns of genes related to sugar transport in three comparisons

2.4 蔗糖代謝相關差異基因的表達模式

植物體內蔗糖的分解主要有兩種途徑，并分別由蔗糖合酶SUS 和蔗糖轉化酶INV 催化[21]。SUS 可以催化蔗糖轉化為UDP－葡萄糖(uridine diphosphate glucose，UDPG)和果糖；INV 可以水解蔗糖為葡萄糖和果糖[22]，且其中的中性轉化酶(neutral invertase，NI)被證明是促進果糖積累的關鍵酶[23]。

在SUS 代謝途徑中，編碼SUS 的SUS1、SUS2、SUS4 基因和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDPglucose pyrophosphosphprylase，UGP)的UGPA基因基本都在石蒜鱗莖膨大過程中表達上調，尤其以SUS1(Uni_12780)、SUS2(Uni_5817)和UGPA(Uni_22303)基因的表達變化更為明顯(圖4)。

然而，與INV 途徑相關的基因中，除編碼堿性/中性轉化酶(也被稱為胞質轉化酶)(alkaline/neutral invertase，cytoplasmic invertases，CINs)的CIN4 基因以及編碼己糖激酶(hexokinase，HK)的HK1 和HK2(CL10879_C2)基因外，編碼這兩個酶的其他基因以及編碼果糖激酶(fructokinase，F(xiàn)RK)的FRK基因和編碼磷酸葡萄糖變位酶(phosphoglucomutase，PGM)的PGM基因基本都在石蒜鱗莖膨大過程中表達下調(圖4)。上述結果表明，SUS 途徑可能是石蒜鱗莖膨大過程中催化蔗糖分解的主要途徑。

圖4 各比較組中蔗糖代謝相關基因的差異表達模式Fig.4 Differential expression patterns of genes related to sucrose metabolism in three comparisons

2.5 淀粉合成相關差異基因的表達模式

對淀粉合成相關基因進行了篩選，包括編碼AGPase 大小亞基的AGPL1、AGPL2 和AGPS1、AGPS2基因，編碼SSS 的SS2、SS3 基因，編碼GBSS 的GBSS1基因以及編碼SBE 的SBE1、SBE2、SBE3 基因，這些基因大多在石蒜鱗莖膨大過程中表達上調，但同一類型不同Unigene 之間的表達模式存在一定差異(圖5)。

圖5 各比較組中淀粉合成相關基因的差異表達模式Fig.5 Differential expression patterns of genes related to starch synthesis in three comparisons

在編碼AGPase 大小亞基的相關基因中，AGPS1和AGPL1 基因表達的上調主要在S4/S1 比較組中更為明顯，而AGPS2 和AGPL2 基因在整個石蒜鱗莖膨大過程中都表達上調。另外，編碼SSS 和SBE 的相關基因中，除SS2(CL4231_C1)、SBE1(Uni_16598)外，其他基因都在石蒜鱗莖膨大過程中表達上調。然而，與SS和SBE相關基因的表達模式相反，GBSS基因中除GBSS1(Uni_27930)在此過程中表達上調外，其他4 個GBSS1 基因都表達下調。

2.6 淀粉代謝相關差異基因的表達模式

淀粉代謝相關基因中，包括編碼α－淀粉酶和β－淀粉酶的AMY和BAMY基因以及編碼異淀粉酶(isoamylase)的ISA基因，各同源基因的表達模式有所不同。其中，AMY3、BAMY7、BAMY8、BAMY9 以及2 個ISA2 基因都在石蒜鱗莖膨大過程中表達上調，而AMY1、AMY2、BAMY1、BAMY2、ISA1 和最后1 個ISA2 基因在此過程中表達下調(圖6)。

圖6 各比較組中淀粉分解相關基因的差異表達模式Fig.6 Differential expression patterns of genes related to starch metabolism in three comparisons

2.7 相關差異基因表達的qRT-PCR 驗證

基于轉錄組數(shù)據(jù)，在碳水化合物代謝相關基因中選擇了6 個具有代表性的基因，在石蒜鱗莖膨大過程中對這些基因的表達變化進行qRT-PCR 驗證(圖7)，包括蔗糖運輸基因SUT2(CL4350_C1)、編碼蔗糖合酶SUS 的SUS2(Uni_5817)基因、分別編碼AGPase 大小亞基的AGPL2(CL3324_C5)和AGPS2(Uni_18445)基因，以及編碼SSS 的SS3(CL11774_C2)和編碼GBSS的GBSS1(Uni_27930)基因。結果顯示這些基因的表達模式與轉錄組中基因的差異表達規(guī)律較為一致，表明轉錄組所得的結果是比較準確可靠的。

圖7 石蒜鱗莖膨大過程中碳水化合物代謝相關基因的相對表達量變化Fig.7 Changes in the expression levels of several genes involved in carbohydrate metabolism in Lycoris radiata bulbs at different stages

3 討論

隨著石蒜鱗莖的膨大，淀粉含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，這與之前的研究結果相似[4]。在百合中，淀粉能夠被分解為可溶性糖，為植株葉片與花芽的形成以及鱗莖發(fā)育等形態(tài)建成過程提供碳源和能量[24]。本研究中石蒜鱗莖膨大過程中，淀粉酶活性不斷升高，表明淀粉分解加劇，這可能是導致后期鱗莖中淀粉含量降低的一個重要原因。另外通過分析淀粉分解相關差異基因的表達變化后發(fā)現(xiàn)，石蒜鱗莖膨大過程中α－淀粉酶和β－淀粉酶活性的升高可能主要由編碼α－淀粉酶的AMY3 基因和編碼β －淀粉酶的BAMY7、BAMY8、BAMY9 基因所調控。

另外，本研究還發(fā)現(xiàn)隨著石蒜鱗莖的膨大，除淀粉分解速率加快外，淀粉合成速率也明顯加快，表現(xiàn)為3種淀粉合成相關酶AGPase、SSS 和GBSS 的活性都不斷升高，尤其以AGPase 活性的變化最為明顯。AGPase 是淀粉合成的關鍵酶，它催化淀粉合成的第一步關鍵反應[25]。植物AGPase 由兩個大亞基和兩個小亞基組成[26]，在玉米(Zea maysL.)和小麥(Triticum aestivumL.)中，過表達編碼AGPase 大小亞基的基因能夠顯著提高其籽粒中淀粉的含量，從而增加粒重[27－28]。另外，在唐菖蒲(Gladilolus hybridus)的研究中發(fā)現(xiàn)，利用VIGS(virus-induced gene silencing)技術沉默AGPase 大小亞基基因GhAGPL1 和GhAGPS1，使其表達受抑制后，唐菖蒲種球淀粉的合成受阻，導致新球重量和籽球數(shù)目顯著降低[29]。因此，石蒜鱗莖中AGPase 活性的增強可能與淀粉的積累以及鱗莖的膨大密切相關，而AGPase 的活性可能主要由編碼其大小亞基的基因所調控，如AGPL2 和AGPS2 等。另外，編碼其他淀粉合成酶SSS、GBSS 和SBE 的相關基因也在此過程中表達上調，如SS2、SS3、GBSS1、SBE1、SBE2、SBE3 等，從而提高了其對應淀粉合成酶的活性，這些淀粉合成酶協(xié)同作用，加快了石蒜鱗莖中淀粉的積累。新合成的淀粉一方面作為一種“庫”儲藏在鱗莖中，另一方面在淀粉分解相關酶的作用下分解成可溶性糖，并在STP6、SWEET13 等糖轉運基因的調控作用下運輸至各個鱗莖發(fā)育的部位，為細胞分裂、伸長等生理活動提供能量，從而加快石蒜鱗莖的膨大。

除由淀粉分解后得到的麥芽糖和葡萄糖外，蔗糖也在鱗莖發(fā)育過程中起重要作用。在百合和其他球根花卉鱗莖中，蔗糖是可溶性糖的主要形式，占可溶性糖含量的70%[30]。在本研究中，隨著石蒜鱗莖的膨大，蔗糖含量不斷升高，同時蔗糖轉運相關基因SUT的表達量也顯著提高。SUT 蛋白在蔗糖的轉運甚至積累過程中起著重要的作用[31]，且SUT 的轉錄水平已被證明能夠受外源糖含量的升高而表達上調[32]。因此，在石蒜鱗莖膨大過程中，SUT基因表達量的升高可能受蔗糖含量上升所引起的反饋調節(jié)作用，這也促進了蔗糖向鱗莖發(fā)育部位的轉運，為鱗莖的后續(xù)膨大過程提供能量。

有研究表明，蔗糖分解后的產物可作為淀粉合成的直接底物[33]，因此蔗糖含量的升高也可以在一定程度上促進淀粉的合成。在本研究中，石蒜鱗莖中蔗糖向淀粉合成轉變的起始主要在蔗糖合酶SUS 的催化下進行，并隨后在UGP 的作用下被進一步分解為淀粉合成的中間產物葡萄糖－1－磷酸(Glucose－1-P，Glc－1-P)，這一過程可能主要由編碼SUS 的SUS1、SUS2、SUS4 和編碼UGP 的UGPA基因所調控。隨后，中間產物Glc－1-P 分別在AGPase、SSS、GBSS 以及SBE 等淀粉合成酶的作用下，逐漸合成淀粉，而這一過程也與上述淀粉合成過程的研究結果相對應。

4 結論

本研究通過分析石蒜鱗莖膨大過程中碳水化合物含量、相關酶活性和碳水化合物代謝相關基因的表達變化，發(fā)現(xiàn)隨著石蒜鱗莖的膨大，蔗糖含量不斷升高，蔗糖轉運相關基因SUT的表達也顯著上調，并隨后在蔗糖代謝酶SUS 以及淀粉合成酶AGPase、SSS 和GBSS 活性增強的作用下，加速合成淀粉，這一過程受到編碼蔗糖代謝及淀粉合成相關酶基因的調控，如SUS1、SUS2、SUS4、UGPA、AGPS2、AGPL2、SS2、SS3、GBSS1、SBE1、SBE2、SBE3 等。另外，淀粉分解酶的活性也在分別編碼α－淀粉酶和β－淀粉酶的AMY3 和BAMY7、BAMY8、BAMY9 基因的正向調控作用下不斷升高，從而加速淀粉的分解，促進可溶性糖含量的積累，并可能在糖轉運相關基因STP6 和SWEET13 等的作用下加快向鱗莖發(fā)育部位的轉運，為鱗莖的膨大提供能量。