張陽洋，范金波，麻 奧，周素珍，呂長鑫

（渤海大學食品科學與工程學院 遼寧省食品安全重點實驗室生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州 121013）

牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）是一種包含583 個氨基酸殘基的心形單體球蛋白，由3 個同源結構域構成（I～III），每個結構域包含2 個亞結構域（如IA 和IB）[6]。2 個重要結合位點分別位于亞結構域IIA 和IIIA 的疏水腔中，即結合位點Sudlow’s sites I 和II[7]。BSA 可與活性成分形成復合物，增加其溶解度、穩(wěn)定性、生物利用度，從而提高其作用效率[8]。BSA 能夠結合多種化合物，包括藥物、脂肪酸、類固醇、染料、金屬、維生素、多酚和類胡蘿卜素[6，9-10]。

槲皮素（Quercetin，QUE）屬于黃酮醇類，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等生物活性，水溶性差限制了其應用[11]。槲皮素與BSA 結合常數(shù)為7.60×105～8.38×106L/mol，結合位點為Sudlow’s sites I[12]。Precupas 等[13]研究表明中性形式槲皮素以非平面構象與Sudlow’s sites I 結合，降低了BSA 熱穩(wěn)定性，而陰離子形式槲皮素以平面構象的形式結合到蛋白亞結構域IIA Sudlow’s sites II 位點上，增加了蛋白質(zhì)相應結構域的熱穩(wěn)定性。白藜蘆醇（Resveratrol，RES）是兩性物質(zhì)，與BSA 結合常數(shù)為2.52×104～1.60×105L/mol，主要結合位點位于結構域I[14-15]?？Х人幡?苯乙醇酯（Caffeic acid phenethyl ester，CAPE）是天然蜂膠的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等生物活性，CAPE與HSA 的結合常數(shù)為8.88×105～2.76×106L/mol，結合位點為Sudlow’s sites I[16]。

目前大部分研究集中在單一活性成分與BSA相互作用，然而同時結合多種活性成分提供多種健康作用的功能食品越來越受到市場的青睞。因此以BSA 為載體，研究BSA 同時裝載多種活性成分的意義重大，目前相關的研究還非常有限[17]。本文以BSA 為模型蛋白，以QUE、RES 和CAPE 為配體分子，通過熒光光譜結合分子模擬技術研究BSA-多配體復合物形成機理及多酚保護作用，為以BSA 為基礎的多種活性成分共裝載的蛋白載體的制備提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

QUE（98%）、RES（反式，98%）、CAPE（98%）、布洛芬 （Ibuprofen，IBU，98%）、華法林（Warfarin，WARF，98%），生工生物工程（上海）有限公司；牛血清白蛋白（99%），北京百靈威科技有限公司；無水乙醇、濃鹽酸等均為分析純級，天津市風船化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

F-7000 熒光分光光度計，日本日立高新技術公司；FE20 實驗室PH 計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-2700 紫外-可見光分光光度計，日本SHIMADZU 公司；WD-9403C 紫外儀（波長為365 nm 的紫外燈，功率為28 W），北京六一儀器廠；Milli-Q Reference 型超純水機，德國默克密理博有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 儲備液的配制 配制0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.4），并以此為溶劑配制1.2×10-4mol/L BSA 儲備液，以及濃度為7.2×10-4mol/L QUE、RES 和CAPE 儲備液。

1.3.2 多酚與BSA 相互作用的熒光光譜 準確移取2 mL Tris-HCl 緩沖液和30 μL 1.2×10-4mol/L BSA 標準溶液于3.5 mL 石英比色皿中，再加入一定量的7.2×10-4mol/L QUE（RES/CAPE）溶液，添加緩沖液至3 mL。待反應15 min 后以波長280 nm 為激發(fā)波長，激發(fā)和發(fā)射狹縫設定為2.5 nm 和5 nm，分別在298 K 和310 K 下測定波長290～450 nm 的熒光光譜并記錄。

在校門口問過門衛(wèi)，學校建筑除了翻新了表面之外基本內(nèi)部結構沒有改動。而門衛(wèi)說還沒看到馬老師下班，應該要么在教室要么在辦公室。我正準備走向教學樓時，門衛(wèi)喊住我，叫我把傘放在門口就行。

1.3.3 多酚與BSA 結合位點分析 準確移取2 mL Tris-HCl 緩沖液和30 μL 1.2×10-4mol/L BSA標準溶液于3.5 mL 石英比色皿中，再加入25 μL 7.2×10-4mol/L IBU 溶液，充分搖勻反應15 min 后加入一定量的7.2×10-4mol/L QUE（RES/CAPE）溶液，添加緩沖液至3 mL，搖勻后反應15 min。以波長280 nm 為激發(fā)波長，激發(fā)和發(fā)射狹縫設定為2.5 nm 和5 nm，在298 K 下測定290～450 nm 的熒光光譜并記錄。將標記物換成WARF 重復上述步驟。

1.3.4 添加順序對多酚與BSA 結合的影響 準確移取2 mL Tris-HCl 緩沖液和30 μL 1.2×10-4mol/L BSA 標準溶液于3.5 mL 石英比色皿中，再加入20 μL 7.2×10-4mol/L QUE 溶液，搖勻反應15 min 后加入一定量的7.2×10-4mol/L RES 溶液，添加緩沖液至3 mL。待反應15 min 后以波長280 nm 為激發(fā)波長，激發(fā)和發(fā)射狹縫設定為2.5 nm和5 nm，在298 K 下測定波長290～450 nm 的熒光光譜并記錄，3 種多酚兩兩互作共進行6 組試驗。

1.3.5 3 種酚同時與BSA 結合的熒光光譜 準確移 取2 mL Tris-HCl 緩沖液和30 μL 1.2×10-4mol/L BSA 標準溶液于3.5 mL 石英比色皿中，按1.3.4 節(jié)所推測結果依次加入20 μL 7.2×10-4mol/L 3 種酚溶液，每次加入后搖勻反應15 min，添加緩沖液至3 mL，以波長280 nm 為激發(fā)波長，激發(fā)和發(fā)射狹縫設定為2.5 nm 和5 nm，在298 K 下測定波長290～450 nm 的熒光光譜并記錄。

1.3.6 分子模擬 采用AutoDock vina 4.0 軟件研究多酚與BSA 分子對接。BSA（ID：4OR0）來源于RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫，去除b 鏈和水，QUE（Pub-Chem CID：5280343）、RES （PubChem CID：445154）和CAPE（PubChem CID：5281787）3D 結構來源于PubChem，通過默認設置與Gasteiger 電荷計算準備，BSA 和多酚結構都加入了氫原子[18]。為了探索BSA 中所有位點，設置了一個足夠大網(wǎng)格框（x=82 ?、y=45 ? 和z=67 ?，間距為1.0 ?），以覆蓋整個鏈A。對接過程中BSA 剛性對接配體柔性對接，并選擇遺傳算法設置搜索參數(shù)，所有其它參數(shù)都使用默認值。以最低能量對接構象選擇最合適的結合模式，BSA 與多酚相互作用力由Discovery Studio v17.2.0 軟件分析，分子對接3D 圖由Pymol 2.2.0 軟件呈現(xiàn)。

1.3.7 多酚的光穩(wěn)定性研究 配制一系列與多酚相關的溶液，其中BSA、QUE、RES 和CAPE 濃度均為10 μmol/L，使用UV 燈（UVL-21，λ=365 nm）將待測液放置于離UV 燈約8～10 cm 遠照射2 h，每隔0.5 h 使用紫外-可見分光光度計測定待測液中多酚含量。CAPE 含量（324 nm）根據(jù)標準曲線y=54.927x+0.0011 （R2=0.9992，0～0.015 mg/mL）計算；QUE 含量（374 nm）根據(jù)標準曲線y=0.0074x-0.0067（R2=0.9996，0～0.14 mg/mL）計算；RES 含量（306 nm）根據(jù)標準曲線y=0.134x+0.0486（R2=0.9994，0～0.016 mg/mL）計算。

1.4 統(tǒng)計分析

每個試驗重復3 次，結果表示為x±s。采用Origin V 8.0 做圖。采用SAS 8.0 軟件（SAS Institute Inc.，NC，美國）的一般線性模型（GLM）進行方差分析。鄧肯氏多重檢驗用來確定數(shù)據(jù)間的差異，顯著水平為P＜0.05。

2 結果與討論

2.1 多酚對BSA 的熒光猝滅作用

熒光團的光物理特性對周圍環(huán)境的極性較敏感，蛋白-多酚結合的三級結構常用蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光表征[14]。BSA 為內(nèi)源性熒光物質(zhì)，當激發(fā)波長為280 nm 時，熒光主要來源于色氨酸和酪氨酸殘基[19]。圖1為298 K 和310 K 下，分別存在3 種酚時BSA 的熒光發(fā)射光譜，由圖中可知3 種酚均出現(xiàn)了熒光猝滅現(xiàn)象，但是猝滅程度不同。固定BSA濃度為1.2 μmol/L，隨著加入的酚類物質(zhì)的濃度增加（0～7.2 μmol/L），BSA 熒光強度呈現(xiàn)濃度依賴關系（見內(nèi)插圖），說明3 種活性成分與BSA 形成了蛋白-多酚復合物[3]。BSA 熒光強度最大吸收峰為340 nm，QUE 加入后最大吸收峰發(fā)生微弱藍移（337 nm），RES 加入后最大吸收峰發(fā)生紅移（348 nm），而CAPE 加入后最大吸收峰未發(fā)生移動。最大吸收峰的移動表明活性成分的加入改變了熒光團的微環(huán)境，紅移極性增強藍移疏水性增強，進一步說明形成了蛋白-多酚復合物，從而影響了蛋白質(zhì)三級結構[20]。

圖1 QUE（a，b）、RES（c，d）和CAPE（e，f）對BSA 的熒光猝滅作用Fig.1 Fluorescence quenching of BSA by QUE（a，b），RES（c，d）and CAPE（e，f）

2.2 熒光猝滅機理與熱力學性質(zhì)

有機分子猝滅的蛋白質(zhì)的結合模式通常是動態(tài)猝滅或靜態(tài)猝滅。動態(tài)猝滅意味著較高的溫度會導致更快的擴散和更大數(shù)量的碰撞。相反，靜態(tài)猝滅會產(chǎn)生穩(wěn)定的配合物，并導致配合物在較高溫度下發(fā)生解離[21]。Stern-Volmer 方程（1）和Hill方程（2）是分析熒光猝滅機理最常采用的方法[22]。

式中，F(xiàn)0——未加猝滅劑時的熒光強度峰值；F——加入猝滅劑時的熒光強度峰值；[Q]——猝滅劑濃度，mol/L；τ0——熒光分子的平均壽命，BSA 的τ0約為10 ns；Kq——雙分子猝滅速率常數(shù)，L/mol·s；Ksv——Stern-Volmer 猝滅常數(shù)，L/mol；Ka為結合常數(shù)，L/mol；n——結合位點數(shù)，個。

由表1可知，3 種活性成分的Kq均大于1012L/mol·s（最大散射猝滅常數(shù)1010L/mol·s），說明均產(chǎn)生了靜態(tài)猝滅，猝滅與形成BSA-多酚復合物有關[23]。當結合常數(shù)在1×104～15×104L/mol 范圍時，配體以可逆的方式與蛋白質(zhì)結合[24]，從Ka可以看出3 種活性成分與BSA 結合能力均較強，其中QUE 結合能力最強，RES 次之，CAPE 最弱，該結果與熒光發(fā)射光譜結果一致。

表1 多酚與BSA 相互作用的熒光猝滅常數(shù)Table 1 Fluorescence quenching constants of interaction between polyphenols and BSA

小分子與蛋白質(zhì)等生物大分子之間的作用力包括氫鍵、范德華力、靜電引力、疏水作用力等。當溫差較小時，反應的焓變可看作常數(shù)。由Van's Hoff 方程（3）和熱力學方程（4）可分別計算出吉布斯自由能ΔG、焓變ΔH 和熵變ΔS。

式中，R——摩爾氣體常數(shù)，8.314 J/mol·K；T——溫度，K；T1——溫度1，K；T2——溫度2，K；K——T 時的結合常數(shù)，L/mol；K1——T1時的結合常 數(shù)，L/mol；K2——T2時的結合常數(shù)，L/mol；ΔG——吉布斯自由能，kJ/mol；ΔH——焓變，kJ/mol；ΔS——熵變，J/mol·K。

由表2可知，3 種酚與BSA 的結合是自發(fā)進行（ΔG＜0）。QUE 的ΔH＜0，說明QUE 與BSA 的結合是放熱過程，同時ΔS＜0 表明結合主要驅動力為為氫鍵和范德華力。RES 的ΔH＜0，說明RES 與BSA 的結合反應是放熱反應，且ΔS＜0 表明分子間作用力主要為氫鍵和范德華力。CAPE 的ΔH＞0，說明CAPE 與BSA 結合反應是吸熱反應，且ΔS＞0 表明分子間作用力主要為疏水相互作用，該結合是由熵驅動的過程。

表2 多酚與BSA 結合的熱力學常數(shù)Table 2 Thermodynamic constants of the interactions between polyphenols and BSA

2.3 多酚與BSA 的結合位點分析

WARF 和IBU 與BSA 的亞結構域ⅡA（Sudlow’s sites I）和亞結構域ⅢA（Sudlow’s sites II）特異性結合，可作為位點標記物研究活性成分與BSA 的結合位點，因此通過比較位點標記物加入前、后淬滅率的變化就可以判斷結合位點的位置[25]。

圖2表示2 個位點Marker 對QUE、RES 和CAPE 與BSA 結合熒光光譜的影響。從圖2a、2c和2e 可以看出，IBU 加入后3 種活性成分引起熒光猝滅變化規(guī)律相似，從內(nèi)插圖可以看出IBU的加入對BSA 淬滅率影響不大，表明3 種活性成分與BSA 的結合位點與IBU 結合位點不同，即它們與BSA 的結合不在亞結構域ⅢA 附近。從圖2b、2d 和2f 可以看出，WARF 加入后3 種活性成分引起熒光猝滅變化規(guī)律不同，從內(nèi)插圖可以看出WARF 的加入對QUE 與BSA 的結合影響不大，而大大降低了RES 和CAPE 與BSA 的結合，表明QUE 與BSA 的結合位點不在WARF 結合位點附近，而RES、CAPE 與BSA 結合位點在WARF結合位點附近，即在亞結構域ⅡA 附近（Sudlow’s sites I）。

圖2 IBU（6.0 μmol/L）或WARF （6.0 μmol/L）對QUE、RES 和CAPE 與BSA 結合熒光光譜的影響Fig.2 Effects of IBU （6.0 μmol/L） or WARF （6.0 μmol/L） on the fluorescence spectra of QUE，RES and CAPE binding to BSA

2.4 添加順序對多酚與BSA 結合的影響

3 種酚與BSA 結合過程涉及到3 種活性成分的添加順序。試驗設計固定一種酚，然后添加另外2 種酚考察其對與BSA 結合的影響，最終結果如圖3所示。

圖3 QUE、RES 和CAPE 添加順序對多酚與BSA 結合的影響Fig.3 Effects of addition sequence of QUE，RES and CAPE on binding of polyphenols to BSA

圖3a 和3b 分別為RES 和CAPE 存在時對QUE 與BSA 結合的影響，從內(nèi)插圖可以看出兩者的影響很相似，顯著降低了QUE 對BSA 的熒光淬滅率（P＜0.05），因此推斷RES 和CAPE 不能先于QUE 加入。圖3e 和3f 分別為RES 和QUE 存在時對CAPE 與BSA 結合的影響，同樣可以看出兩者對于CAPE 與BSA 的結合沒有顯著的影響（P＞0.05），因此推斷RES 和QUE 可以先于CAPE加入。圖3c 和3d 分別為QUE 和CAPE 存在時對RES 與BSA 結合的影響，從內(nèi)插圖可以看出QUE的加入顯著增強兩者的結合（P＜0.05），而CAPE對于兩者的結合沒有顯著的影響（P＞0.05），因此推斷QUE 應先于RES 加入。綜上考慮3 種酚的最佳加入順序為QUE、RES、CAPE 或者RES、QUE、CAPE。

2.5 BSA-多酚復合物的形成

3 種多酚加入順序對其與BSA 的結合影響如圖4所示。從圖4a 和4b 可以看出2 種加入順序下熒光光譜的變化規(guī)律很相似，隨著3 種多酚依次加入，熒光強度逐漸降低，終產(chǎn)物最大吸收波長均為342 nm。2 種添加順序下形成產(chǎn)物分別為BSA+QUE+RES+CAPE 和BSA+RES+QUE+CAPE，它們對于BSA 熒光淬滅率分別為84.71%和79.55%，說明先加入QUE 更有利于酚與BSA 的結合。文獻報道視黃醇、RES 和EGCG 可以同時結合到BSA 上形成多配體復合物[15]。綜上說明BSA 可以同時結合RES/QUE/CAPE 中2 種或3 種多酚，形成了多配體-多酚復合物。

圖4 BSA-多酚復合物熒光光譜Fig.4 Fluorescence spectra of BSA-polyphenols complexes

2.6 分子模擬

本文采用Autodock 4.0 軟件進行分子模擬研究，結果見圖5。如圖5a所示，按照QUE、RES 和CAPE 添加順序得到BSA-三酚復合物最佳對接構象，結合ΔG 分別為-35.17，-36.43 kJ/mol和-34.33 kJ/mol。BSA 包含多個疏水腔，成為許多配體潛在的結合位點[26]。3 種酚可以同時結合到BSA 分子不同位點，由圖5b 可知，RES 結合到Sudlow’s sites I 位點上，在主熒光氨基酸Trp213附近，由7 個氨基酸包圍，分別與SER343 和TRP213 形成氫鍵和疏水相互作用，該結果與位點Marker 試驗（圖2c 和2d）結果一致。由圖5d 可知，QUE 結合位點位于亞結構域IB 和IIIA 之間，遠離Sudlow’s sites I 位點，而部分結合到Sudlow’s sites II位點的右側氨基酸GLU424 和ARG458 上，分別與THR190、SER192 和GLU424形成氫鍵，位點Marker 試驗（圖2a 和2b）證明了這個結論。由圖5c 可知，CAPE 結合位點位于IA和IIA 之間的疏水腔內(nèi)，被TYR156、GLU152、TYR149、LEU259、ALA260、ILE289 和ALA290 包圍，位點部分結合于Sudlow’s sites I，而不與Sudlow’s sites II 位點結合，該結果同樣可以被位點Marker 試驗（圖3e 和3f）證實。

圖5 CAPE、RES 和QUE 與BSA 的結合位點氨基酸及作用力Fig.5 The binding sites of amino acids and forces of interaction between CAPE，RES，QUE and BSA

2.7 多酚光穩(wěn)定性研究

QUE 的穩(wěn)定性受溶劑、溫度、酸堿性、光照等多方面影響[27]。由圖6a所示，隨著紫外暴露時間的延長，保留率逐漸下降，與BSA 結合后保留率顯著提高，2.0 h 由52.2%提高到71.4%（BSA+QUE+RES+CAPE），而沒有與BSA 結合，同時存在RES 或CAPE 時對于提高保留率無顯著作用，說明BSA-多酚復合物的形成有效的保護了QUE。

RES 在光、溫度和pH 條件下容易發(fā)生降解和異構化，研究表明反式RES 經(jīng)光照后可轉換成順式RES，自然界中主要以反式為主[28]。圖6b 為光處理后RES 的保留率，光處理0.5 h 后游離RES 損失近50%，到2.0 h 保留率降為31.5%，當僅存在QUE、CAPE 時RES 保留率變化不大，而與BSA 結合后有3 組RES 保留率顯著的高于其它組，最高達到83.2%，說明BSA-多酚復合物的形成有效地保護了RES 增強了光穩(wěn)定性。

由圖6c 可知，各組CAPE 保留率隨著紫外暴露時間的延長而逐漸降低。與游離CAPE 相比，RES、QUE 的加入使得保留率小幅度提高，而與BSA 結合的各組與其它組相比顯著提高了保留率，并隨著時間的延長效果更明顯，2.0 h BSA+QUE+CAPE 保留率最高可達75.7%，BSA+QUE+RES+CAPE （75.1%）與其無顯著性差異。說明BSA-多酚復合物的形成有效地保護了CAPE，增強了光穩(wěn)定性。

圖6 BSA 對QUE、RES 和CAPE 紫外處理后保留率的影響Fig.6 Effects of BSA on retention rates of QUE，RES and CAPE by UV treatments

3 結論

論文采用熒光光譜法研究了QUE、RES 和CAPE 單獨或同時與BSA 結合的熒光猝滅機制，通過Stern-Volmer 方程和Hill 方程分析了結合常數(shù)和結合位點數(shù)，通過熱力學分析確定了作用力類型，通過位點Marker 競爭試驗結合分子模擬確定了結合位點關鍵氨基酸及相互作用力。結果表明，BSA 可以同時結合2 個或3 個配體形成蛋白-多酚復合物，多酚添加順序影響其結合能力。復合物的形成改善了游離多酚的穩(wěn)定性，兩配體和三配體復合物對多酚的保護作用優(yōu)于單配體復合物。論文結果表明，開發(fā)基于蛋白基載體實現(xiàn)多種活性成分的共裝載是可行的且具有重要意義。