李宗顯，許麗亞，朱運(yùn)平1，*，酈金龍2，，李秀婷

（1 北京工商大學(xué) 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心 北京 100048 2 北京工商大學(xué) 食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室 北京 100048 3 北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院 北京 100048）

低聚半乳糖（GOS）是一種功能性低聚糖，具有提高腸道對(duì)鈣等礦物質(zhì)的吸收，改善脂質(zhì)代謝，防止便秘等益生功能[1-3]。因低聚半乳糖在天然的食物中含量較低，益生效果不明顯，故往往需要額外補(bǔ)充。酶法合成低聚半乳糖因反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物特異性好而備受關(guān)注，其中β-半乳糖苷酶為酶法合成過程中的關(guān)鍵酶[4-6]。

β-半乳糖苷酶，簡(jiǎn)稱乳糖酶，兼具水解及轉(zhuǎn)糖苷活性，于自然界中廣泛存在[7-10]，其在乳糖降解、GOS 酶法合成及生物傳感器等領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用。目前β-半乳糖苷酶來源主要有克魯維酵母菌、乳酸菌、環(huán)狀芽孢桿菌及米曲霉等[10-13]。依據(jù)氨基酸序列相似性，β-半乳糖苷酶分別屬于糖苷水解酶家族GH-1、GH-2、GH-35、GH-42、GH-59 和GH-147。一般來說GH-35 來源最豐富；GH-2 以嗜冷，嗜溫菌株為主，水解和轉(zhuǎn)糖苷作用均較好；GH-42 存在于嗜熱微生物中，對(duì)半乳糖相關(guān)多糖的利用效果良好[11，14]。

雖然研究者對(duì)β-半乳糖苷酶開展了大量研究，但是仍存在著表達(dá)力差，轉(zhuǎn)糖苷活力較低，不易獲取等問題[15-16]。本研究團(tuán)隊(duì)前期篩選獲得一株產(chǎn)β-半乳糖苷酶的克雷伯氏菌，該酶具有較好的轉(zhuǎn)糖苷活性。本文首次對(duì)克雷伯氏菌來源的β-半乳糖苷酶基因進(jìn)行重組表達(dá)，成功得到具有優(yōu)良轉(zhuǎn)糖苷活性的β-半乳糖苷酶，并探究其酶法轉(zhuǎn)化乳糖合成GOS 的工藝條件，為豐富β-半乳糖苷酶資源及低聚半乳糖制備提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

β-半乳糖苷酶基因（lacZ）由課題組前期從多地土樣中篩選出的克雷伯氏菌B5582Y 中分離得到。

限制性內(nèi)切酶 NcoI，XhoI，美國(guó)BioLabs 公司；質(zhì)粒pET28a（+），T4DNA 連接酶，La Tap 擴(kuò)增酶，2×GC Buffer I，日本TAKARA 公司；異丙基硫代半乳糖苷 （Isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG），5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 （5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactoside，Xgal），氨芐，卡那霉素，北京Biotopped 公司；細(xì)菌DNA 提取試劑盒 （100），膠回收試劑盒（200），美國(guó)OMEGA 公司；瓊脂糖，西班牙Biowest 公司；BL21 （DE3）感受態(tài)細(xì)胞，北京TIANGEN 公司；PCR 擴(kuò)增引物，由北京奧科鼎盛合成；色譜乙腈，美國(guó)Fisher Scientific；其它化學(xué)試劑都是分析純級(jí)，試驗(yàn)中所用的水均為Milli-Q 超純水。

1.2 設(shè)備與儀器

水平搖床，江蘇其林貝爾儀器制造有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱、壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；生物安全柜，青島海爾特種電器有限公司；高速離心機(jī)，英國(guó)BECKMAN COULTER；超聲波細(xì)胞破碎儀，南京南京先歐儀器制造有限公司；PCR 儀，德國(guó)Biometra 公司；凝膠成像儀，上海Tanon 公司；Multitemp III 恒溫循環(huán)水浴器、瓊脂糖凝膠電泳儀，美國(guó)GE 公司；Agilent 1260 高效液相色譜-示差折光檢測(cè)器，美國(guó)Agilent 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大腸桿菌重組表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 設(shè)計(jì)引物gal F2（CATGCCATGGAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGC）和gal R2（CCGCTCGAGTTACGCGAAATACGGGCAGACATGG）對(duì)lacZ 基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引入酶切位點(diǎn)NcoI 和XhoI。PCR 反應(yīng)體系：2×GC buffer I 25 μL，dNTP （2.5 mmol/L）8 μL，gal F2 （20 μmol/L）1 μL，gal R2 （20 μmol/L）1 μL，DNA 模板1 μL，LA-Taq 0.5 μL，用ddH2O 補(bǔ)至50 μL。PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸150 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

用NcoI 和XhoI 同時(shí)對(duì)表達(dá)載體pET28a 和帶有酶切位點(diǎn)β-半乳糖苷酶基因lacZ 進(jìn)行雙酶切，在37 ℃反應(yīng)3 h。用T4DNA 連接酶將lacZ和線性化的pET28a 以一定比例混勻，在16 ℃下連接過夜，完成重組質(zhì)粒pET28a-lacZ 的構(gòu)建。將上述構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET28a-lacZ 轉(zhuǎn)入BL21（DE3）細(xì)胞中，通過卡那霉素LB 抗性平板上篩選轉(zhuǎn)化子，利用菌落PCR 進(jìn)行驗(yàn)證，PCR 反應(yīng)體系和條件參考前述。

1.3.2 重組蛋白的表達(dá)及純化 將大腸桿菌重組菌株以1%的接種量轉(zhuǎn)接至100 mL 含卡那霉素的LB 培養(yǎng)基中，在37 ℃下培養(yǎng)3～4 h （OD600nm=0.6～1.0），以0.5 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)產(chǎn)酶，于20 ℃下，200 r/min 培養(yǎng)20 h。發(fā)酵液在4 ℃下以5 000 r/min 的轉(zhuǎn)速冷凍離心10 min，將菌體沉淀用pH 6.7 的PBS （鈉鹽）洗滌，重復(fù)2 次后，加入等體積pH 6.7 的PBS 緩沖液，冰水浴超聲處理（超聲1.5 s，間歇2 s）10 min，然后4 ℃、5 000 r/min 下冷凍離心10 min，上清液即為粗酶液。

1.3.3 β-半乳糖苷酶水解酶活力測(cè)定 參考陳真真等[2]的測(cè)定方法，利用HPLC 外標(biāo)法測(cè)定。取500 μL 0.5 mol/L 乳糖溶液 （0.1 mol/L、pH 6.7 的PBS 緩沖液配制），在50 ℃下保溫10 min 后加入1 000 μL 酶液，振蕩混勻繼續(xù)反應(yīng)4 h，沸水浴5 min 滅酶，并用0.22 μm 微孔過濾器過濾，用HPLC-示差檢測(cè)器檢驗(yàn)乳糖水解活性與低聚半乳糖的生成情況。

色譜測(cè)定條件：Agilent 1260 高效液相色譜-示差折光檢測(cè)器；柱溫30 ℃；色譜柱：氨基高效液相色譜柱 （Inertsil HPLC Column NH2）（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：V乙腈：V水=7∶3；流速1.0 mL/min。

1.3.4 低聚半乳糖的測(cè)定 取適量酶解液沸水浴5 min 滅酶，適當(dāng)稀釋經(jīng)0.22 μm 微孔過濾器過濾。將適當(dāng)濃度的樣品依次上樣于硅膠層析板上，將硅膠板置于在層析缸中經(jīng)過二次展開并顯色后，在105 ℃烘箱中烘烤至顯色。展開劑配制：V正丁醇∶V乙醇∶V高純水=5∶3∶2，顯色劑：V甲醇∶V濃硫酸=20∶1。

1.3.5 酶法合成低聚半乳糖工藝優(yōu)化 以優(yōu)化β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖（GOS）工藝為目標(biāo)，分別考察不同溫度，反應(yīng)時(shí)間，pH 值，底物添加量，加酶量對(duì)乳糖轉(zhuǎn)化率和低聚半乳糖合成的影響。

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)確定影響合成低聚半乳糖的主要因素，利用Design-Expert 軟件進(jìn)行Box-Behnken 三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 lacZ 基因的重組表達(dá)

帶有NcoI 和XhoI 酶切位點(diǎn)的β-半乳糖酶基因與pET28a 連接，構(gòu)成重組質(zhì)粒pET28a-lacZ。將重組質(zhì)粒pET28a-lacZ 通過熱擊導(dǎo)入大腸桿菌BL21（DE3）后，在37 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)長(zhǎng)出的克隆子進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖1。其中M 為1 kb Marker，泳道1～10 為菌落PCR 產(chǎn)物。

圖1 菌落PCR 電泳圖Fig.1 PCR products of colony PCR

對(duì)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行水解酶活力測(cè)定，其中轉(zhuǎn)化子pET28a-18 和pET28a-24 的水解酶活力分別為（99.067±0.12）U/mL 和（100.247±0.08）U/mL，較重組表達(dá)前的水解酶活力提高了近10 倍，因此B5582Y 產(chǎn)乳糖酶基因的克隆表達(dá)成功，與王元火等[17]將環(huán)狀芽孢桿菌β-半乳糖苷酶在大腸桿菌中的表達(dá)效率相比，高出了5 倍。同時(shí)因上清液中沒有酶活，可知重組蛋白以包涵體的形式存在于表達(dá)宿主大腸桿菌BL21（DE3）中。

2.2 不同工藝條件對(duì)合成GOS 的影響

不同工藝條件對(duì)合成GOS 的影響見圖2。由圖2可知，隨著溫度，pH 值的增大，GOS 產(chǎn)量呈先增大后減小的趨勢(shì)，最適溫度和pH 值分別為45℃、7.0～7.5。伴隨反應(yīng)時(shí)間的推進(jìn)，GOS 產(chǎn)量也逐漸增加，在10 h 趨勢(shì)開始平穩(wěn)；在16 h 時(shí)，因底物添加量降低，導(dǎo)致轉(zhuǎn)糖苷作用減弱，GOS 被水解，最終GOS 產(chǎn)量下降，故反應(yīng)時(shí)間定為10 h。初始底物添加量從0 升到90%時(shí)，GOS 產(chǎn)量不斷增加；當(dāng)超過100%時(shí)，因反應(yīng)體系的傳質(zhì)效果變差，致使GOS 產(chǎn)量降低，故初始底物添加量定為90%較為適宜。加酶量的增加能提高GOS 產(chǎn)量，然而加酶量超過120 U/mL 時(shí)，轉(zhuǎn)糖苷生成的GOS 便無法長(zhǎng)期存在，使得GOS 產(chǎn)量下降，故加酶量定為120 U/mL 較為合適。

圖2 不同工藝條件對(duì)合成GOS 的影響Fig.2 Effect of different process conditions on the synthesis of GOS

酶法合成GOS 的工藝中，β-半乳糖苷酶的來源不同，其合成GOS 的工藝條件也存在著差異。米曲霉（A.oryzae）來源的酶最適pH 值為4.5～6.0，溫度在40～60 ℃之間[18]；環(huán)狀芽胞桿菌（B.circulans）來源的最適pH 值為6.0～6.5，溫度在55～60 ℃之間[19-21]；克魯氏乳酸酵母（K.Lactis）來源的最適pH 值為6.5～7.0，溫度在35～40 ℃之間[22-24]。相比而言，本文研究的β-半乳糖苷酶與克魯氏乳酸酵母來源β-半乳糖苷酶合成GOS 條件更相近，而克魯氏乳酸酵母的GOS 產(chǎn)率在35%左右，略低于本研究中的β-半乳糖苷酶。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化確定最佳因素水平

由單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇關(guān)鍵控制因素：A（溫度），B （加酶量），C （底物添加量），運(yùn)用Box-Behnken 進(jìn)行三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)結(jié)果見表1。試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)Design-Expert 軟件分析，低聚半乳糖（GOS）占總糖含量的百分比為響應(yīng)值Y，得回歸方程：

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Experimental design of Box-Behnken and corresponding results

Y=46.4+2.63A-2.00B+2.88C+4.25AB-0.5AC+2.75BC-6.7A2-5.95B2-8.2C2。

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2，模型的P＞F 值為0.0047 小于0.01，表明模型極顯著。在一次項(xiàng)中因素A（溫度）和C（底物添加量）對(duì)GOS 產(chǎn)量的影響高于因素B（加酶量）。因此，推測(cè)因素A（溫度）和C（底物添加量）對(duì)該結(jié)果影響較大。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)回歸分析Table 2 Regression analysis of Box-Behnken experiment

圖3為響應(yīng)面分析圖，由圖可知各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值影響的大小。等高線反映了各變量間交互作用的情況，當(dāng)?shù)雀呔€越接近橢圓時(shí)，說明兩個(gè)因素間的交互作用越顯著，故從圖中也可知A、B、C 3 個(gè)因素間的交互作用顯著。

圖3 酶解溫度、加酶量和初始乳糖添加量對(duì)GOS 產(chǎn)量的影響Fig.3 The response surface curve of the combined effect of temperature、initial lactose concentration and enzyme concentration on yield of GOS

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)Design-Expert 軟件分析，得到當(dāng)A=44℃，B=130 U/mL，C=95%時(shí)，模擬回歸方程取最大值為46.9%，即加酶量130 U/mL，溫度為44 ℃，底物添加量為95%?？紤]到90%時(shí)乳糖已經(jīng)處于飽和狀態(tài)，故選取90%的乳糖作為最終底物添加量。在以上試驗(yàn)條件下進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果分別為41%，45%，46%，平均值44%，實(shí)際測(cè)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值接近，說明可以準(zhǔn)確地反映各變量因子對(duì)低聚半乳糖合成情況的影響。由于低聚半乳糖的生產(chǎn)與初始底物量、加酶量均有很大關(guān)系，因此在生產(chǎn)低聚半乳糖時(shí)應(yīng)注意乳糖的及時(shí)補(bǔ)充，以保證可以有較多的低聚半乳糖的產(chǎn)生。

Nguyen 等[25]報(bào)道保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）產(chǎn)β-半乳糖苷酶合成GOS 得率為50%；Frenzel 等[26]發(fā)現(xiàn)環(huán)狀芽孢桿菌來源的β-半乳糖苷酶合成GOS 得率為41%；Vera 等[27]研究的米曲霉來源的β-半乳糖苷酶合成GOS 得率不足30%；而Katrolia 等[28]報(bào)道的銅綠擬青霉（Paecilomyces aerugineus）來源的β-半乳糖糖苷酶在畢赤酵母中表達(dá)的重組酶合成GOS 的產(chǎn)率僅19.7%。相比而言，本研究中密歇根克雷伯菌（Klebsiella michiganens）來源的β-半乳糖苷酶經(jīng)重組后依然具有較好的轉(zhuǎn)糖苷活性。在最優(yōu)條件下酶法轉(zhuǎn)化乳糖產(chǎn)物通過TLC 薄層層析分析，結(jié)果如圖4所示。由圖可知，該重組酶在水解乳糖生成葡萄糖和半乳糖時(shí)，還生成了不同豐度的低聚糖。研究表明，常見的GOS 主要由β（1-4）糖苷鍵連接而成，而GH2 家族的β-半乳糖苷酶主要合成β（1-3）和β（1-6）糖苷鍵[11]，本研究所用的β-半乳糖苷酶即為GH2 家族酶，據(jù)此可推測(cè)該重組酶作用生成的產(chǎn)物中有較大比例的β（1-3）和β（1-6）糖苷鍵連接而成GOS，有別于一般的GOS 中的低聚糖組分，具有較好的研究?jī)r(jià)值。

圖4 以乳糖為底物時(shí)水解產(chǎn)物的薄層層析圖Fig.4 TLC of hydrolysate with lactose as substrate

3 結(jié)論

團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)的克雷伯氏菌B5582Y，所產(chǎn)的β-半乳糖苷酶具有較好的轉(zhuǎn)糖苷活性，豐富了β-半乳糖苷酶的天然來源。本研究中，經(jīng)重組表達(dá)后的β-半乳糖苷酶酶活力比野生菌株提高約10 倍，且轉(zhuǎn)糖苷活性保持在較高水平。酶法轉(zhuǎn)化乳糖過程中，最優(yōu)條件下可使GOS 得率達(dá)到44%，與已報(bào)道的β-半乳糖苷酶相比具有良好的轉(zhuǎn)糖苷作用。該研究結(jié)果表明克雷伯氏菌B5582Y來源的β-半乳糖苷酶及其重組酶在低聚半乳糖合成中具有較大的應(yīng)用潛力。