李 耘，孫秀蘭，王加生*

（1 江南大學(xué)食品學(xué)院 江蘇無錫 214122 2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所 北京 100081 3 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇無錫 214122）

肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是威脅全球公眾健康最嚴(yán)重的惡性腫瘤之一，每年大約60 萬人死于HCC[1-2]。在我國，HCC 死亡率高達(dá)14.56%[3-4]。HCC 前兆首先是肝損傷、肝炎癥以及肝功能異常（Abnormal liver function，ALF）等，其誘因也非常復(fù)雜。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查證實(shí)乙型肝炎感染、吸煙與嗜酒等不良習(xí)慣以及通過膳食途徑攝入多種真菌毒素等是主要原因，其中通過膳食途徑攝入多種真菌毒素誘發(fā)聯(lián)合風(fēng)險(xiǎn)（協(xié)同效應(yīng)）常常被忽略[5]，經(jīng)口攝入黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）污染的食品以及微囊藻毒素LR（Microcystin LR，MC-LR）污染的飲用水及水產(chǎn)品尤為突出[6]。

盡管有研究證實(shí)AFB1+MC-LR 之間存在肝毒性協(xié)同效應(yīng)[7]，然而相關(guān)報(bào)道還非常缺乏。本研究基于雄性野生型C57BL/6 小鼠，采用CI 模型模擬結(jié)合合理外推，預(yù)測低劑量、亞慢性下AFB1+MC-LR 誘發(fā)小鼠肝癌的聯(lián)合風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)結(jié)合5 項(xiàng)典型生化靶標(biāo)，評價(jià)AFB1+MC-LR 誘發(fā)早期肝損傷聯(lián)合效應(yīng)及其差異性，闡述膳食暴露場景下AFB1+MC-LR 誘導(dǎo)聯(lián)合肝毒性趨勢及閾值空間，結(jié)果對合理制修訂殘留限量標(biāo)準(zhǔn)及風(fēng)險(xiǎn)管控等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

小鼠堿性磷酸酶（AKP）試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT/GPT）試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST/GOT）試劑盒、小鼠甲胎蛋白（AFP）試劑盒，南京建成生物工程研究所；總膽紅素（TBIL）試劑盒，上海潤裕生物科技有限公司。

灌胃針（6202），日本Fuchigami 公司；ES-J 電子天平（精度0.1 mg），天津D&T 傳感技術(shù)有限公司；D1008/D1008E 臺式離心機(jī)，美國Scilogex 公司；Infinite 200 M/F Pro 酶標(biāo)儀，瑞士TECAN 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

由于雄性鼠較雌性鼠對肝毒性表達(dá)更為敏感[8-9]，本研究以3 周齡野生型雄性C57BL/6 小鼠為研究載體。體重差異不超過20%，重量為（17.5±3.5）g，每次給藥后1～3 h，進(jìn)行整籠觀察并記錄臨床癥狀。C57BL/6 小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，同時(shí)飼養(yǎng)和給藥試驗(yàn)均在該公司完成（動(dòng)物實(shí)驗(yàn)許可證號：SYXK （京）2019-0033）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 共暴露組設(shè)計(jì)

1）等發(fā)生率比組 共暴露組為AFB1+MCLR，將其設(shè)計(jì)為相對高、中和低3 組，分別為AFB1低+MC-LR低、AFB1中+MC-LR中、AFB1高+MC-LR高；以及AFB1低、AFB1中、AFB1高和MC-LR低、MC-LR中、MC-LR高等6 個(gè)單一組，共9 組，每組3 個(gè)平行，共27 只；

2）非等發(fā)生率比組 設(shè)計(jì)i=AFB1，j=MC-LR；劑量=i+j （i，j=低，中，高），共9 個(gè)共暴露組，每組3 個(gè)平行，共27 只。

每只小鼠最大給藥體積為0.4 mL/10 g 體重，試驗(yàn)周期為經(jīng)口灌胃21 d。

1.3.2 試驗(yàn)劑量設(shè)計(jì)

本研究遵循原則：1）依據(jù)中位等毒性法CI模型對劑量反應(yīng)數(shù)據(jù)要求，以誘導(dǎo)肝癌二分類質(zhì)效應(yīng)ED50為參考值；2）在低劑量范圍內(nèi)再設(shè)定相對高、中、低劑量等3 組，其中相對高劑量為誘導(dǎo)小鼠肝癌的ED5，相對中劑量為ED1，相對低劑量為糧油食品中AFB1最大殘留限量（MRL）（表1）；3）共暴露組的劑量比依據(jù)CI 模型等發(fā)生率比（Constant ratio model）原則和非等發(fā)生率比（Non-constant ratio model）設(shè)計(jì)。

表1 共暴露組的劑量設(shè)計(jì)方案（基于AFB1）Table 1 Experimental dose design of mycotoxin mixture

1.3.2.1 相對高、中劑量設(shè)計(jì) 基于Toxnet 數(shù)據(jù)庫檢索小鼠經(jīng)口暴露AFB1和MC-LR 的LD50分別為9.0～9.5 mg/kg 體重和5 mg/kg 體重[10]，Chen等[11]研究發(fā)現(xiàn)針對新生B6C3F1 轉(zhuǎn)基因小鼠連續(xù)在出生4，7 d 和10 d 時(shí)腹腔注射2 mg/kg 體重（共6 mg/kg 體重），肝癌發(fā)生率為70%；連續(xù)在小鼠出生120，123 d 和126 d 時(shí)腹腔注射2 mg/kg體重 （共6 mg/kg 體重），肝癌發(fā)生率為55%。Jeannot 等[12]發(fā)現(xiàn)7日齡C57BL/6J 雄性野生型小鼠經(jīng)口暴露AFB1，12 個(gè)月后誘導(dǎo)肝癌ED22.5大致為6.0 mg/kg 體重。Jeanne 等[13]研究發(fā)現(xiàn)雌性C57BL/6 野生型小鼠經(jīng)口灌胃50 mg/kg 體重，5日后患肝癌率為12%。綜上選擇與本研究同類模式小鼠及其給藥方式，并折中考慮中間劑量ED22.5=6.0 mg/kg 體重為最終參考依據(jù)。利用Hill 方程推測AFB1誘導(dǎo)野生型C57BL/6 雄性小鼠肝癌ED1和ED5的劑量：

式（1）中，R 表示誘發(fā)肝癌的發(fā)生率；ECmax——可誘導(dǎo)最大發(fā)生率；EC——導(dǎo)致R 發(fā)生率時(shí)含量水平，mg/kg 體重；m——?jiǎng)┝糠磻?yīng)關(guān)系曲線形狀參數(shù)；δ——背景發(fā)生率，一般默認(rèn)為0。C57BL/6 野生型雄性小鼠誘導(dǎo)肝癌的ED50按下式計(jì)算：

即ED1為0.32 mg/kg 體重，ED5為1.69 mg/kg體重，分別作為研究聯(lián)合誘導(dǎo)肝癌發(fā)生的相對高和相對中劑量。

1.3.2.2 相對低劑量設(shè)計(jì) 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Jha 等[14]和Feitah 等[15]模擬膳食暴露場景，小鼠暴露AFB1劑量依據(jù)糧油的MRL 設(shè)定，為44 μg/kg 體重。Mrdjen 等[16]采用MC-LR 的亞慢性試驗(yàn)劑量為2 000 μg/kg·d。綜上，AFB1最終取44 μg/kg 體重。

1.3.3 灌胃試驗(yàn)及樣本采集 對每只小鼠唯一標(biāo)識，試驗(yàn)前2 周小鼠預(yù)適養(yǎng)1 周，21 d 試驗(yàn)結(jié)束，通過吸入異氟醚麻醉對小鼠實(shí)施安樂死。采集血液滴入EP 管并離心，然后將小鼠用大頭針固定解剖盤中，剪開腹腔，生理鹽水沖洗后用鑷子捏住邊緣膜系結(jié)構(gòu)完整連同膽囊一并取出肝臟組織，放至干燥的EP 管中。

1.3.4 基于酶聯(lián)免疫法測定小鼠肝臟和血清中TBIL、ALT、AST、AKP 和AFP 水平 TBIL、ALT、AST、AKP 和AFP 測定步驟參考試劑盒使用說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

肝癌聯(lián)合效應(yīng)預(yù)測和估計(jì)采用CI 模型，等發(fā)生率比和非等發(fā)生率比共暴露組的生化指標(biāo)差異性分析基于配對比較 （Paried comparison）的Tukey 檢驗(yàn)（P＜0.05），其中P＜0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；非等發(fā)生率比共暴露組中單一組劑量對共暴露組生化指標(biāo)影響的差異性分析采用Two-way ANOVA 檢驗(yàn)的Tukey（P＜0.05）；等高圖繪制首先采用Random 的Renka Cline 算法對獲取的陣列數(shù)據(jù)進(jìn)行XYZ 的10 倍數(shù)據(jù)插值，然后進(jìn)行平滑轉(zhuǎn)換后繪制并生成；上述統(tǒng)計(jì)分析均采用Origin 2019b 軟件（OriginLab Corporation，USA）進(jìn)行分析。

CI 模型主要由Chou[17]提出，CI 模型也稱為CHOU 模型，模型如下：

式中，n（CI）x——AFB1+MC-LR 體系整體達(dá)到誘肝癌的發(fā)生率x%的聯(lián)合毒性效應(yīng)系數(shù)；（Dx）1-n——共暴露體系達(dá)到x%發(fā)生率下所具有的理論濃度，單位mg/kg 體重；表示體系誘導(dǎo)x%肝癌反應(yīng)率下毒素含量配比（Dm）j[（fax）j/1-（fax）j]1/mj表示單一毒素以單一組分存在下實(shí)現(xiàn)x%發(fā)生率的含量水平，單位mg/kg 體重；Dm——中位效應(yīng)；fax——x%發(fā)生率，單位；m——中位效應(yīng)的斜率。當(dāng)CI＜1，=1 以及＞1 時(shí)分別表示協(xié)同、拮抗和加和效應(yīng)。結(jié)果通過CompuSyn Software 2.0 軟件中等發(fā)生率比模型（Constant ratio model）進(jìn)行模擬分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 相對高、中劑量單一及共暴露AFB1+MCLR 誘導(dǎo)肝癌聯(lián)合風(fēng)險(xiǎn)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測

模擬數(shù)據(jù)構(gòu)造原則：1）依據(jù)CI 模型等發(fā)生率比原則；2）考慮誤差及不確定度，考察ED5和ED1相鄰的發(fā)生率的數(shù)據(jù)作為模擬空間組合（即ED1＜ED2；ED4＜ED5＜ED6），剔除加和作用模式組合（如單一與聯(lián)合效應(yīng)均一致情況），并盡量涵蓋可能的極限暴露情況，劑量及組合見表2和表3。

表2 模擬選擇劑量區(qū)間范圍Table 2 Interval range of simulated selected dose

表3 模擬組合數(shù)據(jù)集Table 3 Data set of simulation combination

聯(lián)合效應(yīng)評價(jià)最初應(yīng)用于藥物篩選及耐藥性阻控，旨在篩選可減少聯(lián)用藥物劑量，降低毒性、削減耐藥性還可增強(qiáng)藥效的用藥方式。衡量并判定該效應(yīng)的關(guān)鍵參數(shù)為劑量減少指數(shù)（Dose-reduction index，DRI），此處定義為表達(dá)等同毒性效應(yīng)，為單一組分在共暴露體系中的水平與單一存在條件下該組分水平的倍數(shù)。AFB1和MC-LR 的DRI 方程可分別表述為公式（7）和公式（8）：

式中，DRIAFB1——AFB1劑量減少指數(shù)；DRIMC-LR——MC-LR 劑量減少指數(shù)；Dm——形狀參數(shù)；fa——誘導(dǎo)肝癌的發(fā)生率。

如圖1中所示，在0.05＜fa＜0.5 區(qū)間，標(biāo)準(zhǔn)組與模擬組4，7，8 和10 的DRI 均大于1；fa≤0.05低水平情況下，除模擬組10 組外，其DRI 均大于1。通過模擬預(yù)測，AFB1+MC-LR 可更快且有效地通過肝損傷、炎癥反應(yīng)、肝功能障礙（ALF）或免疫應(yīng)激等在誘導(dǎo)肝癌上發(fā)揮主導(dǎo)作用，或提升關(guān)鍵作用靶點(diǎn)或受體結(jié)合的速率（fv）、電解離常數(shù)（pKa）等，而在相對高fa區(qū)間進(jìn)入阻滯期。作為有害化學(xué)物，當(dāng)模擬結(jié)果表現(xiàn)為DRI＞1，定義為有害效應(yīng)，另外即使肝癌/肝損傷聯(lián)合效應(yīng)不呈現(xiàn)顯著協(xié)同性，而表現(xiàn)為加和或弱拮抗效應(yīng)，肝癌/肝損傷有害效應(yīng)依然可能呈現(xiàn)疊加。

圖1 不同組合的DRI 值Fig.1 DRI values of different combinations

圖2可見，在fa=0.5 水平下，包括標(biāo)準(zhǔn)組及所有模擬組大多為弱協(xié)同、弱拮抗或加和效應(yīng)；在fa=0.75 水平下，標(biāo)準(zhǔn)組和模擬組1，2，4，7，8，9，10，11，12 大多呈現(xiàn)加和或弱協(xié)同效應(yīng)，而模擬組3，5，6 呈現(xiàn)弱拮抗或拮抗效應(yīng)；在fa=0.9 水平下，除標(biāo)準(zhǔn)組和模擬組4 和6 表現(xiàn)為拮抗效應(yīng)，模擬組1 和2 表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)，所有組合主要呈現(xiàn)加和效應(yīng)。因此共暴露組在不同劑量水平下呈現(xiàn)不同聯(lián)合效應(yīng)屬性及趨勢，此與fa-DRI 的表達(dá)結(jié)果一致。

圖2 不同組合的等值線圖Fig.2 Isobologram of different combinations

根據(jù)圖3所示，聯(lián)合劑量發(fā)生概率最高集中于0～20 mg/kg 體重區(qū)間，而CI 值概率最高出現(xiàn)在0～1.5 區(qū)域。因此，常規(guī)暴露水平下，聯(lián)合效應(yīng)主要呈現(xiàn)為弱拮抗、弱協(xié)同或加和效應(yīng)，而表現(xiàn)為強(qiáng)拮抗或強(qiáng)協(xié)同效應(yīng)可能性極低。另外，結(jié)合圖1中DRI 結(jié)果分析，即使肝癌/肝損傷聯(lián)合效應(yīng)不呈現(xiàn)明顯協(xié)同性，但表現(xiàn)為弱協(xié)同或加和聯(lián)合效應(yīng)的概率依然相對較高。

圖3 AFB1+MC-LR 標(biāo)準(zhǔn)組與模擬組復(fù)合誘導(dǎo)小鼠肝癌/肝損傷的聯(lián)合效應(yīng)情況Fig.3 Combined effects of AFB1+MC-LR standard group and simulation group on mice liver cancer/liver injury

2.2 等發(fā)生率比下單一及共暴露AFB1+MC-LR誘導(dǎo)肝損傷差異性分析

等發(fā)生率比下AFP、ALT、AST、AKP 和TBIL在AFB1+MC-LR 單一及共暴露組表達(dá)差異性見表4和表5。結(jié)果顯示，隨暴露劑量增加，生化指標(biāo)表達(dá)水平上升。除AKP 外，肝臟中生化指標(biāo)的表達(dá)水平大多均高于血清中表達(dá)水平（P＜0.05）。

表4 單一及共暴露組血清中生化指標(biāo)表達(dá)水平Table 4 Expression levels of biochemical indexes in serum induced by single and mixture mycotoxin

表5 單一及共暴露組肝臟中生化指標(biāo)表達(dá)水平Table 5 Expression levels of biochemical indexes in liver induced by single and mixture mycotoxin

（續(xù)表5）

如5 項(xiàng)生化指標(biāo)總體可代表每個(gè)樣本肝損傷效應(yīng)，總體結(jié)果顯示：1）共暴露組表達(dá)水平在MC-LR 和AFB1、空白對照組之間，結(jié)果解讀為弱加和、弱協(xié)同或加和效應(yīng)；2）由于血清及肝臟中CP1 均為低劑量下AKP 表達(dá)水平，據(jù)此，相對低劑量下呈現(xiàn)加和或弱拮抗效應(yīng)可能性較高，總體結(jié)論與采用CI 模擬分析結(jié)果基本一致，即所有共暴露組呈現(xiàn)加和或弱協(xié)同效應(yīng)概率更高。生化靶標(biāo)可反映肝損傷，AFB1+MC-LR 暴露時(shí)間及劑量水平?jīng)Q定了“時(shí)-量-效”響應(yīng)，有研究證明機(jī)體暴露低劑量AFB1后會(huì)抑制適應(yīng)性/獲得性免疫（Cell-mediated immunity，CMI）[18]，因此相對低劑量下暴露21 d，共暴露組表現(xiàn)為弱拮抗效應(yīng)可能由于CMI 占主導(dǎo)優(yōu)勢，而相對高劑量下CMI 被抑制，機(jī)體脆弱性增加，聯(lián)合效應(yīng)轉(zhuǎn)為協(xié)同趨勢（圖4）。

圖4 不同聯(lián)合暴露組隨時(shí)間表達(dá)聯(lián)合效應(yīng)趨勢示意圖Fig.4 Schematic diagram of joint effects of different combined groups with time

表6 血清和肝臟中生化指標(biāo)的主成分分析總方差Table 6 Interpretation of total variance of physiological & biochemical indexes in serum and liver using principal component analysis

表7 單一及共暴露組血清和肝臟主成分得分排序Table 7 Ranking of scores of serum and liver principal components

2.3 非等發(fā)生率比共暴露組血清及肝臟中肝損傷聯(lián)合效應(yīng)差異性分析

為規(guī)避CI 模型對非等發(fā)生率比共暴露組聯(lián)合效應(yīng)考察的不足，設(shè)計(jì)棋盤式聯(lián)合暴露試驗(yàn)考察5 項(xiàng)生化指標(biāo)在血清及肝臟中表達(dá)差異性，探明AFB1和MC-LR 單一組分對共暴露組貢獻(xiàn)差異性及其權(quán)重趨勢。

圖5 小鼠血清中生化指標(biāo)表達(dá)水平Fig.5 The expression level of biochemical indexes in the serum of mice

根據(jù)圖6和圖7所示：1）幾乎所有生化指標(biāo)表達(dá)量均隨組合劑量濃度水平提高而升高，最高劑量暴露組AFB1+MC-LR=0.85+0.47 mg/kg 體重與其它共暴露組，包括空白對照組大多具有顯著性差異（P＜0.05），肝臟中表達(dá)水平大多高于或略高于血清中表達(dá)水平；2）表達(dá)量與共暴露組劑量水平遞增的趨勢大多呈現(xiàn)一致；3）相對低劑量組與空白對照組大多呈現(xiàn)差異不顯著或無顯著性差異。4）文獻(xiàn)提示小鼠血清中ALT 和AST 活力均值正常范圍分別為16～42 IU/L 和1.32×102IU/L，TBIL 均值及范圍為0.15 mg/dL （0.1～0.3），Mrdjen等[19]報(bào)道CD-1 雄性小鼠血清中AST、ALT 和TBIL 正常對照組表達(dá)量分別為（49.00±2.15），（39.10±3.34）U/L 以及（0.15±0.01）mg/dL，本研究中空白對照分別為（39.21±1.34）mg/dL、（63.95±4.53）IU/L 和（2.54±0.22）mg/dL，可能由于品種差異性導(dǎo)致。

圖6 小鼠肝臟中生化指標(biāo)表達(dá)水平Fig.6 The expression level of biochemical indexes in the liver of mice

圖7 非等發(fā)生率比下共暴露組中AFB1 和MC-LR 單一含量對其生化指標(biāo)影響的顯著性分布Fig.7 Significant distribution of single concentration of AFB1 and MC-LR in the combined exposure group under the unequal effect ratio

根據(jù)表8所示：1）血清中5 項(xiàng)生化指標(biāo)，除TBIL 和AFP 外，暴露組中AFB1和MC-LR 單一劑量變化對TBIL 結(jié)果影響無顯著性差異（分別為P=0.108 和P=0.116），MC-LR 劑量變化同樣對AFP 結(jié)果影響無顯著性差異（P=0.277），其余指標(biāo)中，共暴露組中AFB1或MC-LR 任意劑量變化，會(huì)對另外單一組誘導(dǎo)生化指標(biāo)表達(dá)產(chǎn)生顯著性影響；2）對于肝臟樣本，共暴露組中任意單一劑量變化對最終共暴露組表達(dá)結(jié)果不具有顯著相關(guān)性，此結(jié)果與血清表達(dá)情況差別較大，即兩種真菌毒素劑量調(diào)整與肝臟中AKP、AFP、ALT、TBIL 和AST 表達(dá)量無太多相關(guān)性，但共暴露組中AFB1與MC-LR 任意單一組劑量變化，會(huì)極顯著影響另外一組作用于共暴露組的表達(dá)。

表8 非等發(fā)生率比下共暴露組中AFB1 或MC-LR 對其生化指標(biāo)影響的顯著性分析Table 8 Significance analysis of the influence of single concentration of AFB1 and MC-LR on biochemical indexes in the combined exposure group under unequal effect ratio

AKP 是一種膜結(jié)合酶，大多血清中AKP 病理性升高，主要由肝臟和膽道疾病引起，主要為膽管阻塞，因?yàn)锳KP 需經(jīng)過肝臟，然后由膽汁排出，當(dāng)排泄過程出現(xiàn)異常，引起AKP 偏高[20]。當(dāng)肝臟受到損傷或障礙時(shí)經(jīng)淋巴道和肝竇進(jìn)入血液，同時(shí)由于肝內(nèi)膽道膽汁排泄障礙，反流入血而引起血清AKP 明顯升高。AKP 升高較ALT 表達(dá)量升高快更可佐證此結(jié)論[21]。血清中AKP 在正常人水平大致為20～1.4×102U/L[22-23]，本研究中小鼠空白水平為（62.29±7.65）IU/L，低劑量聯(lián)合暴露組為（84.38±13.52）IU/L，肝臟表達(dá)極低，空白為（3.92±0.67）IU/L，低劑量聯(lián)合暴露組為（3.48±0.78）IU/L。所有小鼠組織理論均含有顯著AKP 活性，而BALB/c、FVB/N WT 小鼠肝臟檢出極低水平AKP，而ICR小鼠未檢出，因此小鼠之間、小鼠與人體之間具有差異。AFP 來源于胚胎內(nèi)胚層組織細(xì)胞，成人血清中AFP 含量低主要是由于成熟肝細(xì)胞合成AFP能力喪失，而轉(zhuǎn)化后的肝癌細(xì)胞可恢復(fù)合成AFP能力，70%肝癌患者均檢出AFP 異常高表達(dá)[24]。同時(shí)，外源性AFP 不僅可促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖及腫瘤血管形成，還能增強(qiáng)癌細(xì)胞的抗凋亡作用[25-28]。ALT 在肝臟中特異性高表達(dá)，因此在肝臟細(xì)胞質(zhì)中理論含量最高，不同肝損傷和炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肝細(xì)胞膜通透性增加，促使ALT 從細(xì)胞質(zhì)中釋放進(jìn)入血液中，引起ALT 升高，故血清中檢出ALT 升高表征肝臟受損。AST 主要存在肝細(xì)胞線粒體和胞漿，肝細(xì)胞受損后AST 從胞漿和線粒體內(nèi)釋放至血液中。ALT/AST 超過正常值說明肝細(xì)胞受損，然而轉(zhuǎn)氨酶的升高不一定代表肝細(xì)胞損傷。有研究發(fā)現(xiàn)小鼠同工酶ALT1 基因在大腸、肝臟、脂肪組織、肌肉和心臟等組織中由高至低廣泛分布和表達(dá)，而ALT2 基因表達(dá)受限制較多，主要分布在肝、肌肉、腦和白色脂肪組織中，同時(shí)雄性大鼠肝臟ALT2 蛋白大約是雌性大鼠的4 倍[29]。Haorah等[30]利用Leprdb/J 小鼠分別暴露于50 μg/kg 和100 μg/kg 的MC-LR，15 d 和20 d 取樣發(fā)現(xiàn)ALT水平未見特異性升高，而暴露100 μg/kg 的MCLR 小鼠血清中ALP 水平升具有非常顯著性的差異（P＜0.01），并在肝組織中觀察到炎性細(xì)胞浸潤和脂肪空洞。因此，ALT 被認(rèn)為是肝組織損傷的有效生物標(biāo)志物。MC-LR 為主要攻擊肝臟靶器官的活性單環(huán)七肽，Tang 等[33]研究MC-LA 時(shí)發(fā)現(xiàn)，對C57BL/6 野生型小鼠腹腔注射50 μg/kg 腹腔注射會(huì)引起急性肝毒性，血清中ALT 和AST 表達(dá)明顯上升，分別高達(dá)1.0×104IU/L 和1.25×104IU/L 左右。MC-LR 膜穿透能力較弱，其在器官中的全身分布取決于血液灌流程度、OATP 攜帶者的類型和表達(dá)水平。經(jīng)MC-LR 處理的野生型小鼠，其肝臟出現(xiàn)廣泛的出血性壞死，血清ALT 和ALP 水平升高，而OATP1B2 缺失小鼠表現(xiàn)出完全抵抗MCLR 誘導(dǎo)的肝毒性。TBIL 降解產(chǎn)物已被證實(shí)具有抗氧化性能，大鼠隨TBIL 水平升高，在其生理濃度范圍內(nèi)，可能抑制HSC 的激活，因此TBIL 可延緩肝臟纖維化進(jìn)程[34]。

AFB1在不同物種中敏感性具有差異性，其中猴子、雞和小鼠被認(rèn)為抗AFB1物種，同時(shí)報(bào)道小鼠LD50具有差異性，范圍為9～60 mg/kg 體重。有研究表明營養(yǎng)良好人群可降低AFB1誘導(dǎo)肝損傷概率[34]，因此肝損傷聯(lián)合效應(yīng)還會(huì)受到營養(yǎng)因素和品種和差異等因素影響。

3 結(jié)論

低劑量、亞慢性下共暴露組AFB1+MC-LR 誘導(dǎo)的肝癌及肝損傷聯(lián)合效應(yīng)主要表現(xiàn)為弱協(xié)同、弱拮抗或加和作用，其中弱協(xié)同效應(yīng)發(fā)生概率更高。同時(shí)在肝臟中，共暴露組中任意單一毒素的劑量變化會(huì)顯著影響另一毒素對共暴露組聯(lián)合效應(yīng)的表達(dá)。綜上，肝臟是AFB1和MC-LR 共同的作用靶點(diǎn)，其呈現(xiàn)的協(xié)同效應(yīng)可能與肝損傷及肝癌結(jié)局發(fā)生具有相關(guān)性，在真菌毒素殘留限量標(biāo)準(zhǔn)修訂、風(fēng)險(xiǎn)阻控和消費(fèi)引導(dǎo)上應(yīng)給予關(guān)注。