賈逸林，楊冬晗，李可欣，張文龍，王朝亮，戈 娜*

（1 包頭醫(yī)學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品健康研究所 內(nèi)蒙古包頭 014040 2 包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨外科 內(nèi)蒙古包頭 014010 3 包頭醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院 內(nèi)蒙古包頭 014040）

世界衛(wèi)生組織（WHO）2019年報(bào)道，全球飲酒人數(shù)多達(dá)24 億，酗酒已成為世界性重大公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。酒中所含的主要成分酒精及其代謝產(chǎn)物是導(dǎo)致消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和骨質(zhì)疏松等多種疾病和傷害的共同原因[2-3]。肝臟作為代謝酒精的主要場(chǎng)所，長(zhǎng)期和/或過(guò)量飲酒會(huì)導(dǎo)致酒精性肝損傷，又稱酒精性肝病 （Alcohol liver disease，ALD）?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，腸道黏膜屏障和ALD 的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)。ALD 患者腸黏膜屏障穩(wěn)定性降低，通透性增加，腸道菌群組成發(fā)生變化[4]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明，ALD 大鼠的腸上皮細(xì)胞受損嚴(yán)重，絨毛高度明顯縮短；血漿內(nèi)毒素水平增高，腸黏膜屏障功能被破壞[5]。此外，由于過(guò)量飲酒導(dǎo)致小腸黏膜通透性增加，使得腸腔中革蘭氏陰性菌過(guò)度繁殖產(chǎn)生的過(guò)量?jī)?nèi)毒素穿越腸黏膜屏障滲漏入血，形成腸源性內(nèi)毒素血癥，進(jìn)而通過(guò)Toll樣受體激活肝巨噬細(xì)胞，分泌大量促炎細(xì)胞因子，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)和肝臟損傷[6]。有效改善腸黏膜損傷，成為目前防治ALD 的新思路。

熊果酸（UA）是一種天然的α-香樹(shù)脂烷型五環(huán)三萜類化合物，廣泛存在于山楂、熊果、女貞子等植物中[7]。它不僅具有抗炎、抗癌、抗氧化及抑菌等多種生物學(xué)活性[8-10]，還具有安全性高、毒性低（口服LD50為8 330 mg/kg）的優(yōu)點(diǎn)[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，UA 可減輕ALD 嚙齒動(dòng)物的脂質(zhì)過(guò)氧化，抑制氧化應(yīng)激和炎性因子的大量釋放[12-13]。本課題組前期發(fā)現(xiàn)，UA 可通過(guò)改善腸道菌群失調(diào)，調(diào)節(jié)腸道微環(huán)境，減少內(nèi)毒素的產(chǎn)生和釋放，從而緩解ALD大鼠肝臟損傷[14]。然而，UA 是否可通過(guò)保護(hù)腸黏膜機(jī)械屏障進(jìn)而發(fā)揮其肝臟保護(hù)作用鮮有報(bào)道。本研究探討UA 對(duì)酒精致大鼠小腸黏膜屏障損傷的保護(hù)作用，為應(yīng)激狀態(tài)下腸黏膜屏障保護(hù)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

2月齡雄性SD 大鼠，SPF 級(jí)，40 只，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自北京市中國(guó)食品藥品鑒定研究院（大興），動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2017-0005。

1.2 材料與試劑

熊果酸（純度98%），長(zhǎng)沙麓園生物科技有限公司；谷氨酰胺；日本壽制藥株式會(huì)社；無(wú)水乙醇（純度99.9%），天津市凱通化學(xué)試劑有限公司（灌胃前用生理鹽水稀釋至50%純度）；D-乳酸 （DLA）試劑盒；江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司；腸脂肪酸結(jié)合蛋白（FABP2）試劑盒，武漢Elabscience 生物公司，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）試劑盒，依科賽生物公司。免疫印跡所需BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒、RIPA 裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGF）蛋白上樣緩沖液，江蘇碧云天生物研究所；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，美國(guó)Millpore 公司；一抗（兔抗）：叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O4（FOXO4）、磷酸化叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O4（p-FOXO4）、閉鎖小帶蛋白-1（ZO-1）；美國(guó)Abcam 公司，二抗：辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG；北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器

JEM1200EX 透射電鏡，日本電子株式會(huì)社；ELx808 型酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Tek 公司；電泳儀、UVP-GDS-8000 凝膠成像分析系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Red公司。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組及給藥方法 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行完全隨機(jī)分組。共分為4 組，每組10 只，分別是正常對(duì)照組、酒精模型組、熊果酸組和谷氨酰胺組。正常對(duì)照組每日給予生理鹽水灌胃；酒精模型組前2 周給予50%酒精8 mL/（kg bw·d）灌胃，第3 周把酒精劑量提高至12 mL/（kg bw·d），持續(xù)灌胃6 周；熊果酸組給予150 mg/（kg bw·d）熊果酸灌胃；谷氨酰胺組給予300 mg/（kg bw·d）谷氨酰胺灌胃，后2 組受試物灌胃1 h 后再給予酒精灌胃，熊果酸組和谷氨酰胺組酒精劑量同模型組，試驗(yàn)持續(xù)8 周。依據(jù)每周體重測(cè)量結(jié)果，及時(shí)調(diào)整灌胃量。末次灌胃并禁食12 h 后，用1%戊巴比妥鈉按0.5 mL/100 g 劑量進(jìn)行腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈取血，室溫下靜置30 min后，3 500 r/min 離心15 min，分離血漿，同時(shí)留取小腸組織，固定部分小腸組織用于觀察組織病理學(xué)變化，其余部分-80 ℃保存用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4.2 小腸組織HE 染色觀察 取回盲部小腸組織1 cm3于4%的多聚甲醛中固定過(guò)夜，經(jīng)石蠟包埋、切片、脫蠟、蘇木精-伊紅（Hematoxylin-eosin，HE）染色、中性樹(shù)膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察小腸組織形態(tài)學(xué)變化。

1.4.3 小腸組織超微結(jié)構(gòu)觀察 小腸分離為1 mm3于2.5%戊二醛固定4 h，用0.1 mol/L 磷酸緩沖液沖洗數(shù)遍后固定于1%的氧化鋨中，最后用環(huán)氧樹(shù)脂包埋，制成超薄切片（70 nm），2%乙酸鈾酰和3%檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡下觀察大鼠小腸超微結(jié)構(gòu)。

1.4.4 大鼠血漿中TNF-α、IL-1β、D-LA 和FABP2 水平檢測(cè) 采用ELISA 法檢測(cè)血漿TNFα、IL-1β、D-LA 和FABP2 含量，試驗(yàn)步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4.5 免疫印跡法檢測(cè)大鼠小腸組織ZO-1 和FOXO4/p-FOXO4 的蛋白表達(dá)量 裂解小腸組織并提取總蛋白，測(cè)定蛋白濃度，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，以5%脫脂奶粉封閉2 h，按操作步驟加入相應(yīng)一抗（抗體體積比為1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜。洗膜后再加入HRP 酶標(biāo)記的二抗稀釋液孵育。ECL 顯影，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析蛋白條帶灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0 軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料，采取單因素方差分析（one-way ANOVA）比較組間差異，結(jié)果以±s表示，不同組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 熊果酸對(duì)酒精誘導(dǎo)大鼠小腸組織病理學(xué)改變的影響

由圖1可知，正常對(duì)照組小腸絨毛排列整齊，未見(jiàn)水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而酒精模型組小腸絨毛萎縮、變短，黏膜層有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腺體數(shù)目減少，局部可見(jiàn)殘留的腺體。熊果酸組與谷氨酰胺組小腸絨毛排列情況有明顯改善，浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞不明顯，說(shuō)明UA 對(duì)酒精誘導(dǎo)的大鼠腸黏膜損傷具有一定的保護(hù)作用。

圖1 HE 染色法觀察大鼠小腸組織病理學(xué)改變（200×）Fig.1 The histopathological changes of small intestine observed by HE staining in rats（200×）

2.2 熊果酸對(duì)酒精誘導(dǎo)大鼠小腸組織超微結(jié)構(gòu)的影響

由圖2可知，正常對(duì)照組大鼠小腸微絨毛致密豐滿，排列有序，無(wú)損傷，緊密連接完整清晰，線粒體形態(tài)正常，內(nèi)嵴分明。酒精組模型組大鼠小腸微絨毛大量脫落，腫脹明顯，長(zhǎng)度縮短，緊密連接腫大，線粒體結(jié)構(gòu)受損。熊果酸組與谷氨酰胺組大鼠小腸微絨毛排列較為齊整，緊密連接腫大及線粒體病變也有所緩解，再次印證UA 能夠保護(hù)酒精所致的小腸黏膜損傷。

圖2 各組大鼠小腸黏膜細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)Fig.2 Ultrastructure of intestinal mucosal cells of each group

2.3 熊果酸對(duì)酒精誘導(dǎo)大鼠血漿D-LA 和FABP2 含量的影響

由表1可知，酒精模型組大鼠血漿D-LA 和FABP2 質(zhì)量濃度較正常對(duì)照組顯著升高（P≤0.05）。與酒精模型組相比，熊果酸組和谷氨酰胺組D-LA 和FABP2 質(zhì)量濃度明顯降低（P≤0.05）。雖然熊果酸組D-LA 和FABP2 質(zhì)量濃度在數(shù)值上較正常對(duì)照組和谷氨酰胺組略高，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。上述結(jié)果表明，酒精的攝入可以導(dǎo)致腸黏膜通透性的增加，而UA 與谷氨酰胺一樣，具有保護(hù)腸黏膜的作用。

表1 熊果酸對(duì)大鼠血漿中D-LA 和FABP2含量的影響Table 1 Effects of UA on contents D-LA and FABP2 in rats plasma

2.4 熊果酸對(duì)酒精誘導(dǎo)大鼠血漿TNF-α 和IL-1β 含量的影響

由表2可知，酒精模型組大鼠血漿TNF-α 和IL-1β 質(zhì)量濃度較正常對(duì)照組明顯升高（P＜0.05），而UA 和谷氨酰胺干預(yù)顯著抑制了酒精所致的TNF-α 和IL-1β 質(zhì)量濃度升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同時(shí)，正常對(duì)照組、熊果酸組及谷氨酰胺組三者間的TNF-α 和IL-1β 質(zhì)量濃度并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），提示UA 能夠調(diào)節(jié)促炎因子表達(dá)，減輕酒精導(dǎo)致的大鼠腸道炎癥反應(yīng)。

表2 熊果酸對(duì)大鼠血漿中TNF-α 和IL-1β含量的影響Table 2 Effects of UA on contents TNF-α and IL-1β in rats plasma

2.5 熊果酸對(duì)酒精誘導(dǎo)大鼠ZO-1、FOXO4 和p-FOXO4 蛋白表達(dá)的影響

如圖3所示，與正常對(duì)照組相比，酒精模型組大鼠小腸組織中ZO-1 蛋白表達(dá)量顯著降低，p-FOXO4 的蛋白表達(dá)量明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與酒精模型組相比，熊果酸組和谷氨酰胺組大鼠小腸組織ZO-1 蛋白表達(dá)量明顯增加，而p-FOXO4 蛋白表達(dá)量明顯降低，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這也說(shuō)明UA 能明顯緩解酒精誘導(dǎo)引起的ZO-1 蛋白表達(dá)降低，減少FOXO4 的磷酸化表達(dá)。

圖3 熊果酸對(duì)酒精誘導(dǎo)大鼠ZO-1、FOXO4 和p-FOXO4 蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of UA on ZO-1，F(xiàn)OXO4 and p-FOXO4 protein expression in alcohol-treated rats

3 討論

肝臟與腸道在解剖結(jié)構(gòu)和生理功能上具有密切的聯(lián)系。腸道將富含水、各種營(yíng)養(yǎng)素和微生物分解產(chǎn)物的血液以不同的途徑通過(guò)門靜脈運(yùn)送至肝臟代謝，二者間各因素產(chǎn)生的信號(hào)相互作用形成“腸—肝軸”[15]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，大量飲酒不僅對(duì)肝臟造成損害，還會(huì)導(dǎo)致腸黏膜屏障受損。Shao等[16]發(fā)現(xiàn)酒精暴露小鼠體內(nèi)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶和內(nèi)毒素的水平升高，肝臟可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，TNF-α、IL-6 mRNA 表達(dá)量顯著增加，部分肝組織發(fā)生纖維化；同時(shí)，腸緊密連接蛋白表達(dá)降低，腸道屏障完整性遭到破壞。Antón 等[17]利用酒精喂養(yǎng)大鼠一段時(shí)間后發(fā)現(xiàn)，它們的結(jié)腸微絨毛缺失，緊密連接擴(kuò)大，炎性細(xì)胞增多，腸組織中TNF-α水平升高，ZO-1 表達(dá)下降，表明大量酒精攝入會(huì)降低腸黏膜屏障的完整性，引發(fā)腸道內(nèi)炎癥反應(yīng)增強(qiáng)。本文HE 染色結(jié)果顯示，腸組織正常對(duì)照組大鼠小腸絨毛排列整齊，未見(jiàn)水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而酒精模型組大鼠小腸絨毛萎縮、變短，黏膜層有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。熊果酸組大鼠小腸絨毛排列情況有明顯改善，浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞不明顯。電鏡結(jié)果顯示，正常對(duì)照組微絨毛致密豐滿，排列有序，緊密連接完整；酒精模型組微絨毛脫落腫脹，緊密連接受損；熊果酸組較酒精模型組損傷情況明顯改善。以上結(jié)果均說(shuō)明酒精破壞了小腸黏膜和緊密連接的完整性，而UA 對(duì)酒精引起的小腸黏膜損傷有保護(hù)作用。

眾所周知，腸黏膜通透性改變能準(zhǔn)確反映腸道屏障功能，而血漿D-LA 和FABP2 水平常作為腸道屏障損傷敏感評(píng)價(jià)指標(biāo)用于腸黏膜屏障功能的評(píng)價(jià)。當(dāng)腸上皮細(xì)胞脫落時(shí)，腸黏膜通透性增加，腸道菌群發(fā)酵產(chǎn)生的D-LA 從黏膜受損處入血[18]。FABP2 是僅存在于成熟的小腸黏膜微絨毛頂端的低分子蛋白物質(zhì)，具有較好的器官特異性[19]。正常生理狀態(tài)下，D-LA 和FABP2 水平較低，當(dāng)酒精刺激或其它應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致腸黏膜受損時(shí)，D-LA和FABP2 會(huì)釋放入血，導(dǎo)致血漿中二者水平升高[20-21]。本研究結(jié)果表明，酒精模型組相較于正常對(duì)照組大鼠血漿中D-LA 與FABP2 的質(zhì)量濃度明顯升高；UA 干預(yù)后，大鼠血漿中D-LA 與FABP2 的水平顯著降低，表明攝入U(xiǎn)A 可修復(fù)酒精對(duì)大鼠腸黏膜屏障造成的損傷。

腸道屏障主要由腸上皮細(xì)胞通過(guò)緊密連接蛋白和黏合連接蛋白與臨近細(xì)胞緊密結(jié)合構(gòu)成，是保護(hù)腸黏膜免受有害因素侵襲的重要保障[22]。細(xì)菌等大分子物質(zhì)主要通過(guò)腸上皮細(xì)胞的胞吞作用和細(xì)胞旁隙穿透腸黏膜上皮[23]，腸上皮細(xì)胞連接直接決定了細(xì)胞旁隙的緊密程度。在眾多連接方式中，緊密連接最為重要。ZO-1 作為膜結(jié)合鳥(niǎo)苷酸激酶家族中形成緊密連接所必需的多域支架蛋白，在維持緊密連接結(jié)構(gòu)和功能方面起著不可替代的作用[24]。隨著ZO-1 表達(dá)的變化，緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能也發(fā)生相應(yīng)的變化，因此，通過(guò)檢測(cè)ZO-1 蛋白，可間接反映腸道黏膜的完整性和通透性變化[25]。有學(xué)者通過(guò)研究腸上皮Caco-2 細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，加入乙醇可使Caco-2 細(xì)胞間的緊密連接蛋白遭到破壞，從而使腸上皮細(xì)胞屏障通透性增加[26]。免疫印跡結(jié)果顯示，酒精模型組大鼠ZO-1 表達(dá)量明顯低于其它3 組，熊果酸組ZO-1 表達(dá)量顯著增多，但仍低于正常對(duì)照組，這說(shuō)明大量酒精攝入后可能通過(guò)破壞腸上皮細(xì)胞間緊密連接，使腸道通透性增加，而適量補(bǔ)充UA 可修復(fù)腸上皮緊密連接，改善腸道通透性。

TNF-α 和IL-1β 作為促炎細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)中具有重要的調(diào)節(jié)作用。持續(xù)的酒精攝入會(huì)刺激腸上皮細(xì)胞釋放TNF-α、IL-1β 等促炎細(xì)胞因子[27]。有研究表明，TNF-α 和IL-1β 可通過(guò)肌球蛋白輕鏈激酶途徑引起Caco-2 細(xì)胞ZO-1 表達(dá)下降，增加腸上皮緊密連接通透性[28]。此外，腸黏膜對(duì)酒精及其代謝產(chǎn)物乙醛的氧化能力非常弱，長(zhǎng)期酒精攝入會(huì)使細(xì)胞間緊密連接蛋白和黏合連接蛋白重新分配，腸黏膜通透性進(jìn)一步增加，導(dǎo)致內(nèi)毒素大量釋放入血并通過(guò)門靜脈入肝，引起炎癥反應(yīng)，使得肝細(xì)胞損傷[29-30]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，大量酒精的攝入導(dǎo)致大量的內(nèi)毒素產(chǎn)生，而UA 干預(yù)能夠減少內(nèi)毒素的產(chǎn)生和釋放[14]。本次試驗(yàn)中可以看到酒精造成了大鼠血漿TNF-α、IL-1β 質(zhì)量濃度升高，病理切片也顯示腺體數(shù)目減少，部分腺體被破壞，可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；而UA干預(yù)后，能夠顯著降低TNF-α、IL-1β 水平，改善腸黏膜上皮形態(tài)及減輕炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。說(shuō)明UA能通過(guò)降低促炎因子TNF-α、IL-1β 的表達(dá)保護(hù)腸黏膜屏障。

叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O4 是叉頭框蛋白家族中“O”亞家族成員之一，主要分布于胃腸道，具有調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)功能[31-32]。研究表明，F(xiàn)OXO4 可能通過(guò)調(diào)節(jié)緊密連接蛋白表達(dá)從而保護(hù)腸黏膜屏障。Zhou 等[33]發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)FOXO4 缺失上皮細(xì)胞和體外培養(yǎng)FOXO4 缺失上皮細(xì)胞中緊密連接蛋白表達(dá)降低可能為FOXO4 缺失小鼠腸黏膜屏障受損提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。此外，F(xiàn)OXO4 還可能通過(guò)干擾核因子κB（NF-κB）進(jìn)入細(xì)胞核以及直接抑制NF-κB 的轉(zhuǎn)錄活性發(fā)揮腸黏膜保護(hù)作用。Chang 等[34]在ALD 大鼠模型中看到血清中TNF-α 水平升高，會(huì)使FOXO4 發(fā)生磷酸化出核而失去活性，磷酸化的FOXO4 無(wú)法抑制NF-κB 的轉(zhuǎn)錄活性，啟動(dòng)炎癥介質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄，使促炎細(xì)胞因子 （如TNF-α、IL-1β 和IL-6 等）分泌、釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)，致使腸緊密連接受損，最終導(dǎo)致腸黏膜屏障功能破壞，進(jìn)而加重肝臟損傷。本研究結(jié)果表明，與酒精模型組相比，補(bǔ)充UA 后大鼠小腸組織中p-FOXO4 蛋白表達(dá)量明顯降低，F(xiàn)OXO4 的磷酸化得到有效的抑制，提示UA 對(duì)酒精所致腸黏膜損傷具有改善作用，其機(jī)制可能與抑制FOXO4 的磷酸化，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期和/或大量的酒精攝入會(huì)造成腸黏膜屏障受損。UA 對(duì)酒精致腸上皮黏膜損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與改善腸黏膜通透性，減少促炎細(xì)胞因子釋放，抑制FOXO4 蛋白發(fā)生磷酸化有關(guān)。