劉景云，李婷婷，王當(dāng)豐，楊亞茹，勵(lì)建榮*，謝 晶，王明麗，周小敏，郭曉華

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州 121013 2大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遼寧大連 116600 3 江南大學(xué)食品學(xué)院 江蘇無錫 214122 4 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海 201306 5 蓬萊京魯漁業(yè)有限公司 山東煙臺(tái) 265600 6 浙江興業(yè)集團(tuán)有限公司 浙江舟山 316120 7 山東美佳集團(tuán)有限公司 山東日照 276800）

格氏沙雷菌（Serratia grimessi，SG-05），腸桿菌科沙雷菌屬，革蘭陰性菌，是一種常見的食源性病原菌。SG-05 廣泛分布于水、土壤和動(dòng)植物中，能分泌蛋白酶、核酸酶等胞外物質(zhì)，造成水產(chǎn)品等高蛋白食品的腐敗變質(zhì)。從淡水魚類和海水魚類的腐敗微生物中均能分離到沙雷氏菌[1]。如Christensen 等[2]從腐敗牛奶中分離出變形斑沙雷氏菌，并證明該菌能夠分泌N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯類（N-Acyl-homoserine lactone，AHLs）信號(hào)分子。

群體感應(yīng)（Quorum sensing，QS）是細(xì)菌內(nèi)或細(xì)菌間進(jìn)行信息交流的通訊機(jī)制，細(xì)菌通過自身合成并釋放到胞外的信號(hào)分子或者與之共存的細(xì)菌產(chǎn)生的信號(hào)分子感知周圍環(huán)境變化，同時(shí)啟動(dòng)相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)節(jié)細(xì)菌群體行為[3-5]。如生物被膜的形成、毒力因子的表達(dá)。Liu 等[6]發(fā)現(xiàn)液化沙雷氏菌QS 相關(guān)基因編碼的內(nèi)酯酶能降解自身合成的AHLs 信號(hào)分子，進(jìn)而影響液化沙雷氏菌的黏附和生物被膜的形成。Srinivasan 等[7]研究了蔞葉提取物植醇對黏質(zhì)沙雷氏菌群體感應(yīng)AHLs 介導(dǎo)的毒力因子和生物被膜的抑制作用，發(fā)現(xiàn)黏質(zhì)沙雷氏菌的毒力因子表達(dá)和生物被膜形成均受到QS 系統(tǒng)的調(diào)控，且植醇能有效干擾QS 系統(tǒng)，進(jìn)而調(diào)控毒力因子的表達(dá)。

群體感應(yīng)抑制劑（Quorum sensing inhibitors，QSIs），是一種通過干擾或者抑制QS 現(xiàn)象阻礙細(xì)菌信息交流，且不對細(xì)菌正常生長產(chǎn)生影響的物質(zhì)[8]。相比于傳統(tǒng)的食品保鮮劑，QSIs 不會(huì)殺死病原菌，而是通過QS 系統(tǒng)干擾病原菌生物被膜的形成和致腐基因的表達(dá)，最終影響細(xì)菌間的生物行為。篩選QSIs 作為食品保鮮劑是控制食品腐敗的有效策略之一。孫曉佳[9]通過富馬酸鈉抑制了水產(chǎn)品優(yōu)勢腐敗菌熒光假單胞菌的QS 現(xiàn)象，為控制水產(chǎn)品腐敗過程提供了新思路。中草藥是篩選QSIs的重要寶庫，目前部分中草藥粗提物被證明有抑制QS 系統(tǒng)的能力[10-11]。中草藥成分復(fù)雜，何種有效成分能發(fā)揮抑制QS 現(xiàn)象的作用，研究者尚未給出明確的解釋。丹皮酚，又稱牡丹酚，是一種從牡丹的干燥根皮提取的活性成分。藥理研究表明丹皮酚有抗菌、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗心律失常和心腦血管保護(hù)作用[12-13]。吳曉慧等[14]發(fā)現(xiàn)經(jīng)磺化的丹皮酚對蘋果斑枯病菌和玉米紋枯病菌均有顯著地抑制作用。李學(xué)鵬等[15]發(fā)現(xiàn)丹皮提取物和茶多酚聯(lián)用對冷藏大菱鲆魚肉的腐敗過程有減緩作用，使魚肉品質(zhì)得到保持。然而，丹皮提取物成分多樣，不能確定發(fā)揮抑制作用的單一化合物，這增加了后期研究其抑制機(jī)制的難度。

本文以丹皮酚（丹皮提取物的主要成分）為研究對象，研究了丹皮酚對格氏沙雷菌QS 和生物被膜形成的抑制作用，以期增加丹皮酚的實(shí)際利用價(jià)值，同時(shí)也為中草藥來源的活性物質(zhì)作為水產(chǎn)品保鮮劑提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

格氏沙雷菌，分離自腐敗大菱鲆。生物報(bào)告菌株紫色桿菌 （Chromobacterium violaceum 026，CV026），該菌株攜帶有硫酸卡那霉素抗性，本身不會(huì)產(chǎn)生AHLs 信號(hào)分子，能夠感知環(huán)境中的AHLs，產(chǎn)生紫色菌素，顯現(xiàn)紫色反應(yīng)。檢測AHLs信號(hào)分子類型為C4-HSL～C8-HSL。以上2 種菌株均保藏于渤海大學(xué)水產(chǎn)品貯藏加工研究所。

丹皮酚（純度99%）、脫脂奶粉，上海源葉生物科技股份有限公司；LB 肉湯、LB 營養(yǎng)瓊脂、瓊脂粉、蛋白胨、胰蛋白胨，北京索萊寶科技有限公司；硫酸卡那霉素、結(jié)晶紫、冰乙酸、氯化鈉、十二烷基磺酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS），上海阿拉丁生化科技有限公司；AHLs 信號(hào)分子標(biāo)準(zhǔn)品（C4-HSL，C6-HSL，C8-HSL，C10-HSL，C12-HSL，C14-HSL），美國Sigma 公司；正丁醇、濃硫酸、苯酚，上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司；D（+）-葡萄糖，上海麥克林生化科技有限公司；載玻片、蓋玻片 江蘇飛舟玻塑有限公司；鋅片，上海邁砷化工有限公司；硫酸肼，生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

W-CJ-2FD 超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；MS105UD 電子分析天平，瑞士梅特勒-托利儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；imark 酶標(biāo)儀，美國BIO-RAD 公司；LRH 系列生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；Biofuge Stratos 冷凍高速離心機(jī)，美國Thermo Fisher 公司；Nikon80i 顯微鏡，日本尼康公司；SS-4800 場發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本日立公司；Czone 系列抑菌圈測定及菌落計(jì)數(shù)儀，杭州迅數(shù)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 最小抑菌濃度確定及QSIs 檢測 參照劉勝帥等[16]的方法略加修改。通過牛津杯打孔法測定丹皮酚對SG-05 的最小抑菌濃度。將菌種CV026 和SG-05 過夜活化，28 ℃、160 r/min 培養(yǎng)至OD600nm為1 左右。分別以1∶100 的接種比接種于LB 營養(yǎng)瓊脂中，待LB 營養(yǎng)瓊脂凝固后用牛津杯打孔，將預(yù)先配制好的不同質(zhì)量濃度丹皮酚（1，2，4，6，8 mg/mL）加入孔中，添加去離子水作為空白對照。平板置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h，肉眼觀察抑菌圈情況，并記錄抑菌圈直徑大小。

將CV026 過夜活化至OD600nm為1 左右，以1∶100 的比例接種于LB 營養(yǎng)瓊脂中混勻后倒板，待其凝固后牛津杯打孔。將預(yù)先配制的丹皮酚（500，250，125，62.5 μg/mL）加入孔中，以去離子水作為空白對照，以20 μg/mL C6-HSL 為陽性對照組。平板置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h，肉眼觀察抑制紫色菌素情況。

1.3.2 紫色菌素產(chǎn)量測定 參照Ganesh 等[17]的方法略加修改。將CV026 過夜活化，以1∶100 的比例接種于10 mL LB 肉湯中，添加丹皮酚使其終質(zhì)量濃度分別為500，250，125，62.5 μg/mL。以去離子水為空白對照，C6-HSL 信號(hào)分子 （終質(zhì)量濃度為20 μg/mL）為陽性對照，28 ℃、160 r/min 搖床培養(yǎng)48 h。

取300 μL 培養(yǎng)后的菌液于1.5 mL 離心管，室溫下加入150 μL 10% SDS 裂解15 s，裂解后加入600 μL 正丁醇提取紫色菌素5 s。最后于8 000 r/min 離心5 min，并在波長595 nm 下測定上清液吸光度。

1.3.3 丹皮酚對SG-05 信號(hào)分子產(chǎn)量的影響參考梅永超等[18]的方法進(jìn)行AHLs 粗提液制備。將SG-05 過夜活化至OD600nm為1 左右，以1∶100 比例接種于10 mL LB 肉湯中，添加丹皮酚使其終質(zhì)量濃度分別為500，250，125，62.5 μg/mL，以去離子水作為空白對照，20 μg/mL 的C6-HSL 信號(hào)分子為陽性對照，28 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)48 h。以轉(zhuǎn)速10 000 r/min 離心15 min，將上清液取出，加入等體積經(jīng)過冰乙酸酸化的乙酸乙酯提取2 次，向提取液中加入適量的無水硫酸鈉。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙酸乙酯，取1 mL 甲醇溶解殘留物，-20 ℃保存待用。

LB 營養(yǎng)瓊脂中以1∶100 比例接種過夜活化的CV026，倒平板，待瓊脂凝固后用預(yù)先滅菌好的牛津杯打孔。分別取200 μL 上述保存的AHLs 粗提液打入孔中，28 ℃生化培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)48 h，觀察并測定紫色菌素直徑大小。

制備以甲醇為溶劑的6 種AHLs 標(biāo)準(zhǔn)品的混合溶液，利用GC-MS 檢測各類信號(hào)分子標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間，同時(shí)測定上述AHLs 粗提液中的信號(hào)分子類型與產(chǎn)量。測定參數(shù)參考馮杰[19]的方法。

1.3.4 丹皮酚對SG-05 胞外蛋白酶活性的影響將過夜活化的SG-05（OD600nm為1 左右）以1∶100比例分別接種于含有丹皮酚（500，250，125，62.5，0 μg/mL），和C6-HSL（終質(zhì)量濃度20 μg/mL）的肉湯中，28 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h。用無菌濾器將各菌液過濾，取濾液待用。

參照Sacherer 等[20]的培養(yǎng)基配方，配制牛奶瓊脂固體培養(yǎng)基，使用牛津杯打孔，向孔中加入200 μL 濾液。平板置于生化培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為28 ℃、24 h。以平板中透明圈直徑來反映胞外蛋白酶的產(chǎn)量。

1.3.5 丹皮酚對SG-05 群集的影響 參照Li等[21]的方法，配制群集培養(yǎng)基。配方為：0.5% D-（+）葡萄糖、1%蛋白胨、0.5%瓊脂粉、0.5%氯化鈉。將5 μL 過夜活化的SG-05 （OD600nm為1 左右）打在含有不同丹皮酚質(zhì)量濃度的群集培養(yǎng)基上，待其風(fēng)干后置于生化培養(yǎng)箱中在28 ℃培養(yǎng)48 h 后，測量運(yùn)動(dòng)直徑，并且以添加去離子水和C6-HSL 為空白和陽性對照。

1.3.6 丹皮酚對格氏沙雷菌SG-05 胞外多糖的影響 參考Kalpana 等[22]的方法。將蓋玻片為載體的生物被膜培養(yǎng)后（處理?xiàng)l件與1.3.7.2 節(jié)相同），取出蓋玻片用500 μL 0.9% NaCl 沖洗，加入等體積的5%的苯酚，培養(yǎng)5 min 后，再加入5 倍體積的含有0.2%硫酸肼的濃硫酸溶液，黑暗中反應(yīng)1 h 后，10 000 r/min 離心10 min，上清液在波長490 nm 處測定吸光度。

1.3.7 丹皮酚對SG-05 生物被膜的影響

1.3.7.1 丹皮酚對SG-05 生物被膜形成量的影響

參考付嬌嬌等[23]和Lipsy 等[24]的方法并稍加修改。

將過夜活化的SG-05（OD600nm為1 左右）以1∶100 的比例接種于LB 肉湯，加入終質(zhì)量濃度為500，250，125，62.5 μg/mL 的丹皮酚，以去離子水為空白，C6-HSL 信號(hào)分子作陽性對照。取1 mL 培養(yǎng)后的菌液分裝于無菌離心管中，在28 ℃下靜置培養(yǎng)48 h。取培養(yǎng)液測定波長595 nm 下的菌液密度后，棄去離心管中的培養(yǎng)液，用無菌水清洗，風(fēng)干30 min 后添加1 mL 0.2%結(jié)晶紫染色20 min。棄染液，用無菌水沖洗3～5 次，直至沖洗的無菌水干凈透明，而后利用33%冰乙酸將固著在管壁的染色液溶解后，使用酶標(biāo)儀測定溶解液在波長595 nm 下的吸光度，并通過公式計(jì)算生物被膜的相對形成量。計(jì)算公式[18]如下：

式中，OD595nm處理組——丹皮酚處理后測得的結(jié)晶紫溶解液的OD595nm值；OD595nm空白對照組——添加去離子水后測得的結(jié)晶紫溶解液OD595nm值。

1.3.7.2 丹皮酚對SG-05 生物被膜形態(tài)的影響

參考嚴(yán)羽萍等[25]的方法并稍加修改。

1）光學(xué)顯微鏡分析 使用前，將載玻片置于無水乙醇和去離子水中先、后超聲30 min，干燥滅菌后備用。無菌培養(yǎng)皿中加入10 mL 含有不同質(zhì)量濃度丹皮酚 （500，250，125，62.5 μg/mL）的LB肉湯，并以1∶100 比例接種SG-05，混合均勻后靜置于28 ℃生化培養(yǎng)箱72 h。以去離子水和C6-HSL 信號(hào)分子為空白和陽性對照。

2）掃描電子顯微鏡分析 將鋅片用拋光機(jī)除去表面的氧化層，而后剪切成10 mm×10 mm 大小的正方形，置于無水乙醇和去離子水中先、后超聲30 min，烘干后滅菌備用[18]。后續(xù)操作與光學(xué)顯微鏡相同。培養(yǎng)后將鋅片取出，用無菌水沖洗3～5次后置于4 ℃預(yù)冷的2.5%戊二醛溶液中浸泡4 h，而后用50%，70%，80%，90%乙醇進(jìn)行梯度洗脫，100%無水乙醇脫水2 次，乙酸異戊酯置換2次。干燥后噴金處理進(jìn)行掃描電子顯微鏡的觀察[26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 最小抑菌濃度的確定及QSIs 檢測結(jié)果

通過牛津杯打孔法確定丹皮酚對CV026 和SG-05 的最小抑菌濃度。當(dāng)?shù)てし淤|(zhì)量濃度為1～8 mg/mL 時(shí)，丹皮酚對CV026 和SG-05 的最小抑菌濃度分別是1 mg/mL 和2 mg/mL。綜合考慮，選取亞抑菌濃度為0.5 mg/mL。試驗(yàn)中選取丹皮酚質(zhì)量濃度為500，250，125，62.5 μg/mL 進(jìn)行后期試驗(yàn)。從圖1可以看出添加丹皮酚的孔周圍有不透明的抑紫圈出現(xiàn)，初步表明丹皮酚沒有抑制CV026 正常生長，但具有抑制CV026 產(chǎn)生紫色菌素的能力，說明了丹皮酚能干擾生物報(bào)告菌株CV026 的QS 系統(tǒng)，進(jìn)而影響紫色菌素的產(chǎn)量。

圖1 丹皮酚對CV026 產(chǎn)紫色菌素的抑制性Fig.1 Inhibition effect of paeonol against the secretion of violacein from CV026

2.2 紫色菌素產(chǎn)量測定結(jié)果

如圖2所示，當(dāng)生物傳感器CV026 處于亞抑菌濃度下時(shí)，紫色菌素的產(chǎn)量因丹皮酚質(zhì)量濃度的增加而明顯下降，而CV026 的菌液密度幾乎不受影響。與空白對照組（去離子水）相比，丹皮酚質(zhì)量濃度為500 μg/mL 時(shí)，紫色菌素的產(chǎn)量下降近57.95%。結(jié)果表明，亞抑菌濃度下，丹皮酚能在不影響CV026 正常生長的前提下，通過干擾CV026的QS 系統(tǒng)進(jìn)而抑制CV026 產(chǎn)生紫色菌素的能力。這充分表明了作為中草藥來源的丹皮酚提取物的主要成分丹皮酚對抑制CV026 產(chǎn)生紫色菌素有良好的效果。同樣，Odilon[27]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)100 μg/mL 的五倍子和黃連處理的CV026，其紫色桿菌素產(chǎn)量分別下降了50.44%和34.50%。

圖2 不同質(zhì)量濃度丹皮酚對CV026 產(chǎn)紫色菌素和菌液密度的影響Fig.2 Effects of different mass concentration paeonol on the production of violacein and bacterial density of CV026 strain

2.3 丹皮酚對SG-05 信號(hào)分子產(chǎn)量的影響

在外源短鏈AHLs 類信號(hào)分子存在的前提下，紫色桿菌CV026 產(chǎn)生紫色圈的直徑大小能間接地衡量SG-05 AHLs 的產(chǎn)量。如圖3a所示，經(jīng)丹皮酚處理后，紫色圈直徑下降。隨著丹皮酚質(zhì)量濃度的增加，紫色圈直徑呈下降趨勢。圖3b 表示不同質(zhì)量濃度丹皮酚處理后紫色圈的直徑大小。由圖可知，經(jīng)500 μg/mL 丹皮酚處理的紫色圈直徑抑制率為17.43%。當(dāng)添加外源信號(hào)分子C6-HSL 后紫色圈直徑增加，這間接表明丹皮酚能干擾紫色桿菌CV026 的QS 系統(tǒng)，最終影響紫色菌素的產(chǎn)量。

圖3 丹皮酚對SG-05 分泌AHLs 的影響Fig.3 Effects of paeonol on the secretion of AHLs in SG-05

6 種AHLs 標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間和順序如圖4所示，信號(hào)分子混合標(biāo)準(zhǔn)品分離效果明顯。C4-HSL，C6-HSL，C8-HSL，C10-HSL，C12-HSL，C14-HSL，分別在保留時(shí)間4.408，6.254，8.305，10.685，13.374，16.882 min 出現(xiàn)特征峰?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間與孫曉佳等[5]的結(jié)果一致。由圖5可知，菌株SG-05 的乙酸乙酯提取物經(jīng)GC-MS 分析可在C6-HSL 和C10-HSL 處出現(xiàn)特征峰，表明兩者為SG-05 產(chǎn)生的主要信號(hào)分子。李婷婷等[28]發(fā)現(xiàn)格氏沙雷菌能誘導(dǎo)根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）A136 水解5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷（X-gal）產(chǎn)生藍(lán)色。這與GC-MS 分析SG-05 能產(chǎn)生長鏈信號(hào)分子C10-HSL 的結(jié)果一致。圖6所示為GC-MS 分析得到的C6-HSL 和C10-HSL 2 種主要信號(hào)分子經(jīng)不同質(zhì)量濃度丹皮酚處理后的含量變化。經(jīng)丹皮酚處理后，信號(hào)分子峰面積下降。該結(jié)果與本試驗(yàn)中紫色菌素抑制試驗(yàn)的結(jié)果相一致，進(jìn)一步表明丹皮酚能有效地降低SG-05 分泌信號(hào)分子的能力，推測這可能是丹皮酚能作為QSIs 降低信號(hào)分子的活性，進(jìn)而影響信號(hào)分子的產(chǎn)量。Ding 等[29]通過分子模擬和GCMS 分析發(fā)現(xiàn)苯甲醇能抑制熒光假單胞菌P07 信號(hào)分子產(chǎn)量。

圖4 GC-MS 測定AHLs 混合標(biāo)準(zhǔn)品Fig.4 The mixture of different AHLs standards detected by GC-MS

圖5 GC-MS 測定SG-05 的信號(hào)分子種類及含量Fig.5 Types and contents of AHLs in SG-05 detected by GC-MS

圖6 丹皮酚對SG-05 分泌AHLs 的影響Fig.6 Effects of paeonol on the secretion of AHLs in SG-05

2.4 丹皮酚對SG-05 胞外蛋白酶活性的影響

胞外蛋白酶能快速分解魚類蛋白質(zhì)導(dǎo)致魚類腐敗變質(zhì)，因而胞外蛋白酶是檢驗(yàn)水產(chǎn)品新鮮度的重要指標(biāo)。Abinaya 等[30]研究發(fā)現(xiàn)從擬南芥分離到的3，5，7-三羥基黃酮具有干擾銅綠假單胞菌產(chǎn)生胞外蛋白酶的能力。Zhou 等[31]研究表明黏質(zhì)沙雷氏菌胞外蛋白酶的分泌量受到AHLs 介導(dǎo)的QS 系統(tǒng)的調(diào)控。本試驗(yàn)通過SG-05 在牛奶瓊脂平板上產(chǎn)生透明圈直徑的大小作為檢驗(yàn)其產(chǎn)生胞外蛋白酶能力的標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果如圖7所示。由圖可知，相比空白對照組，添加丹皮酚能顯著降低蛋白酶水解圈直徑的大小，且丹皮酚質(zhì)量濃度和蛋白酶水解圈直徑的大小呈負(fù)相關(guān)。并且，當(dāng)向培養(yǎng)基中補(bǔ)充外源信號(hào)分子C6-HSL 時(shí)，蛋白酶的水解透明圈直徑明顯增大，表明SG-05 分泌蛋白酶的能力能夠受到QS 系統(tǒng)的調(diào)控，上述試驗(yàn)結(jié)果表明丹皮酚處理能干擾該系統(tǒng)進(jìn)而抑制蛋白酶水解圈直徑的大小。

圖7 丹皮酚對SG-05 胞外蛋白酶的影響Fig.7 Effects of paeonol on extracellular protease activity of Serratia grimessi

2.5 丹皮酚對SG-05 群集現(xiàn)象的影響

圖8 丹皮酚對SG-05 群集運(yùn)動(dòng)的影響Fig.8 Effect of paeonol on swarming motility of Serratia grimessi

鞭毛介導(dǎo)的群集運(yùn)動(dòng)能力能調(diào)節(jié)SG-05 和接觸面（如食品機(jī)械表面）的附著能力，且通過形成生物被膜促進(jìn)食品污染。因此，本文研究了丹皮酚對SG-05 群集能力的影響。表1所示為不同質(zhì)量濃度丹皮酚處理SG-05 遷移直徑的大小和群集能力的抑制率。經(jīng)500 μg/mL 丹皮酚處理后，SG-05的遷移能力被顯著抑制，其抑制率高達(dá)50.94%。這表明丹皮酚干擾了SG-05 鞭毛介導(dǎo)的遷移能力。與添加去離子水相比，添加終質(zhì)量濃度為20 μg/mL C6-HSL 后，SG-05 群集的直徑有所增加，這表明外源信號(hào)分子C6-HSL 能促進(jìn)格氏沙雷菌的群集能力，進(jìn)一步表明SG-05 鞭毛介導(dǎo)的群集能力可能受到AHLs 介導(dǎo)的QS 系統(tǒng)調(diào)控。Asif等[32]研究異腈官能團(tuán)修飾的酪氨酸對銅綠假單胞菌QS 系統(tǒng)和群集能力的影響，發(fā)現(xiàn)添加外源的、經(jīng)異腈功能修飾的酪氨酸后，銅綠假單胞菌能通過增強(qiáng)鼠李糖脂的產(chǎn)量或通過QS 系統(tǒng)間接增強(qiáng)銅綠假單胞菌的群集能力，與本文研究結(jié)果具有一致性。

表1 丹皮酚對SG-05 群集運(yùn)動(dòng)直徑的影響Table 1 Effect of paeonol on swarming motility diameters of Serratia grimessi

2.6 丹皮酚對SG-05 胞外多糖的影響

SG-05 自身能夠分泌包括蛋白質(zhì)、核酸、多糖等胞外多聚物，而這種胞外多聚物的聚集有利于其生物被膜在初級階段的形成及黏附。研究表明，胞外多糖是細(xì)菌生物被膜的重要成分，在保持其內(nèi)聚力、獲取營養(yǎng)和阻止抗生素進(jìn)入細(xì)胞等方面發(fā)揮重要的作用[33]。Zhou 等[31]發(fā)現(xiàn)大麥芽堿能干擾黏質(zhì)沙雷氏菌的QS 系統(tǒng)，進(jìn)而影響?zhàn)べ|(zhì)沙雷氏菌胞外多糖的形成。表2所示為丹皮酚對SG-05胞外多糖的影響。由表可知，丹皮酚對SG-05 胞外多糖的產(chǎn)生具有質(zhì)量濃度依賴性抑制作用。經(jīng)500 μg/mL 丹皮酚處理時(shí)，SG-05 胞外多糖的抑制率高達(dá)44.35%。該結(jié)果與本試驗(yàn)中丹皮酚對SG-05 生物被膜形成量的抑制結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了胞外多糖在生物被膜形成中的重要作用。

表2 丹皮酚對SG-05 胞外多糖的影響Table 2 Effect of paeonol on exopolysaccharides in Serratia grimessi

2.7 丹皮酚對SG-05 生物被膜的影響

2.7.1 丹皮酚對SG-05 生物被膜形成量的影響生物被膜是由相關(guān)微生物細(xì)胞組成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。一般情況下，生物膜具有三維結(jié)構(gòu)，擁有充足的通道和孔隙，以此實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的相互作用和生物群落狀態(tài)的維持[34]。生物被膜的形成是一個(gè)高度自發(fā)的過程，在此過程中細(xì)菌生長和消亡交替是進(jìn)行的，并且隨著生存環(huán)境的變化發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，一般將其分為5 個(gè)階段：定殖階段、可逆吸附階段、不可逆吸附階段、生物膜形成階段、脫落階段。Singh 等[35]研究了QS 系統(tǒng)和生物被膜間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)從微生物代謝物中提取獲得的某些物質(zhì)可以干擾QS 系統(tǒng)，進(jìn)一步影響細(xì)菌生物被膜形成能力。因此，本文基于QS 機(jī)制，通過丹皮酚作用抑制SG-05 生物被膜的形成。

酶標(biāo)法被廣泛應(yīng)用于測定微生物生物被膜的相對形成率，其吸光值的相對下降量可反應(yīng)丹皮酚對SG-05 生物被膜形成率的抑制程度。如圖9所示，在亞抑菌濃度下，隨著丹皮酚質(zhì)量濃度的升高，SG-05 生物被膜相對形成率呈下降趨勢，與此同時(shí)，菌液密度幾乎呈現(xiàn)平穩(wěn)狀態(tài)，表明亞抑菌濃度下格氏沙雷菌的正常生長幾乎不受影響。與空白對照組（生物被膜相對形成率為100%）相比，經(jīng)500 μg/mL 丹皮酚處理后樣品的生物被膜相對形成率僅為48.89%，而添加信號(hào)分子C6-HSL 時(shí)，其生物被膜相對形成率高達(dá)113.74%，表明丹皮酚可能通過干擾AHLs 介導(dǎo)的QS 系統(tǒng)調(diào)控SG-05 生物被膜的形成，這與李學(xué)鵬等[36]的研究結(jié)果基本一致。

圖9 丹皮酚對SG-05 生物被膜相對生成率的影響Fig.9 Effects of paeonol on biofilm relative formation rate of SG-05

2.7.2 丹皮酚對SG-05 生物被膜形態(tài)的影響 通過光學(xué)顯微鏡和電子掃描顯微鏡研究丹皮酚對SG-05 生物被膜形態(tài)的影響，其結(jié)果如圖10a所示，經(jīng)過結(jié)晶紫染色后的菌體成紫色片狀分布，隨著信號(hào)分子C6-HSL 的添加，紫色成片的膜狀物有疊加的效果，即觀察到有層次感。相比于空白對照組，丹皮酚處理后，載玻片表面僅有少量菌體聚集，片狀膜狀物相對減少。隨著丹皮酚質(zhì)量濃度的增加，載體表面膜狀物呈濃度依賴性降低，這與Li等[37]研究的香蘭素對蜂房哈夫尼亞菌生物被膜形態(tài)的影響具有一致性。

由圖10b 可知，相比于空白對照組，添加信號(hào)分子C6-HSL 后鋅片表面形成的生物被膜濃厚且致密，這表明SG-05 生物被膜的形成可能受到AHLs 介導(dǎo)的QS 系統(tǒng)的調(diào)控。Thomson 等[38]研究表明QS 機(jī)制控制著病原菌毒力因子和生物被膜的表達(dá)。丹皮酚處理后，鋅片上形成的生物被膜稀疏松散，僅有少量的菌體聚集，這與光學(xué)顯微鏡的分析結(jié)果一致。這2 種生物被膜形態(tài)分析均表明丹皮酚能抑制SG-05 生物被膜的形成，這可能是丹皮酚影響了細(xì)菌菌體的聚集和相連或者使其生物被膜斷裂，最終影響生物被膜的形成。

圖10 丹皮酚對SG-05 生物被膜影響的光學(xué)顯微鏡圖（a）和掃描電子顯微鏡圖（b）Fig.10 Optical microscopic images（a）and scanning electron microscopic images（b）of effects of paeonol on biofilm of Serratia grimessi

3 結(jié)論

近年來，以中草藥成分作為QSIs 的研究成為干擾或阻礙QS 途徑的主要方向之一。文章以紫色桿菌CV026 為報(bào)告菌株檢測SG-05 群體感應(yīng)現(xiàn)象，進(jìn)一步探究了丹皮酚對SG-05 群體感應(yīng)表型的影響。當(dāng)500 μg/mL 丹皮酚處理后，紫色圈直徑抑制率為17.43%，GC-MS 分析結(jié)果也表明丹皮酚能顯著降低SG-05 中C6-HSL 和C10-HSL 產(chǎn)量；胞外蛋白酶也受到抑制作用；群集運(yùn)動(dòng)性和胞外多糖產(chǎn)生量抑制率分別為50.94%和44.35%。此外，丹皮酚降低了生物被膜相對生成率，破壞了生物被膜結(jié)構(gòu)。綜上，丹皮酚作為丹皮主要成分，能通過干擾格氏沙雷菌SG-05 群體感應(yīng)系統(tǒng)，進(jìn)而抑制其腐敗表型。