楊 謙，張 軍，馬玉泉，譚雪敏

(邯鄲市中心醫(yī)院胸外二科，河北 邯鄲 056000)

食管癌是指來源于食管上皮的惡性腫瘤，常伴有體重嚴重下降、嘔血及便血等不良癥狀，是世界范圍內(nèi)發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，若發(fā)生轉(zhuǎn)移或侵襲臨近器官，將會對患者的生命健康造成威脅[1]。目前，臨床常用手術(shù)、化療和放療等方法緩解食管癌，但預后效果較差，生存率較低[2]。惡性腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲是惡性腫瘤發(fā)展的重要因素，因此，探討新型藥物對于食管癌的治療具有重要意義。胡黃連苷是中藥胡黃連中的一種有效成分，為環(huán)烯醚萜類化合物，具有肝臟保護[3]、神經(jīng)保護[4]和抗炎[5]等多種生物活性。胡黃連苷Ⅱ是胡黃連苷單體有效成分之一，資料顯示其能顯著抑制乳腺癌細胞的遷移、侵襲及腫瘤血管生成，并認為胡黃連苷Ⅱ具有潛在的惡性腫瘤治療作用[6]。但關(guān)于其具體機制尚不清晰。研究結(jié)果表明，絲裂原活化的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(mitogen extracellular signal regulated kinase，MEK)/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)信號通路在細胞的增殖、分化、侵襲和遷移過程中發(fā)揮重要作用，激活的MEK可使ERK磷酸化，進而調(diào)節(jié)細胞功能，加速細胞增殖，最終導致腫瘤的形成與發(fā)展[7-8]。推測胡黃連苷Ⅱ和MEK/ERK通路之間可能存在一定的關(guān)聯(lián)。目前關(guān)于胡黃連苷Ⅱ?qū)κ彻馨┑闹委熥饔醚芯枯^少，本研究通過培養(yǎng)人食管癌細胞，探討胡黃連苷Ⅱ抑制食管癌細胞增殖、侵襲及遷移的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器：MCO-15AC型CO2細胞培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)；XElx800型酶標儀(美國Perkin Elmer公司)；NC-100型細胞計數(shù)器(丹麥Chemimetec公司)；Accuri C6型流式細胞儀(美國BD公司)；TS100型倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；GIS-500型凝膠成像儀(杭州米歐儀器有限公司)。

1.1.2 實驗細胞及藥物：人食管癌Eca109細胞(批號：XY-XB-1075)購自美國菌種保藏中心。

1.1.3 藥品與試劑：胡黃連苷Ⅱ(原料藥，純度≥98%，批號：39012-20-9)購自上海同田生物技術(shù)有限公司；MEK/ERK信號通路激活劑(美國MedChemexpress公司，批號：HY-12028)；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)細胞凋亡雙染試劑盒、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)試劑(武漢普諾賽生命科技有限公司，批號分別為P-CA-201、SA-209)；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶及四唑鹽(MTT)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號分別為P1400、T1300、R1200及M1020)；RIPA裂解液、蛋白提取試劑盒及BCA蛋白測定試劑盒(上海碧云天公司，批號分別為P0013C、P0027及P0011)；鼠抗人B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、細胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)、MEK、磷酸化MEK(p-MEK)、ERK、磷酸化ERK(p-ERK)及β-肌動蛋白(β-actin)一抗(武漢菲恩生物科技有限公司，批號分別為FNab00809、FNab00840、FNab09147、FNab03527、FNab01553、FNab05113、FNab02844及FNab00032)；鼠抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、細胞周期蛋白D1(cyclinD1)、細胞周期蛋白D3(cyclinD3)、磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(p-c-Raf)一抗及鼠抗人IgG二抗(美國Abcam公司，批號分別為ab13847、ab16663、ab183338、ab42596及ab150077)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及含藥培養(yǎng)液制備：將食管癌Eca109細胞株快速融化，在離心管中反復吹打至細胞充分懸浮后接種于培養(yǎng)瓶，用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；細胞長滿培養(yǎng)瓶后進行消化傳代，用0.25%胰蛋白酶進行消化，消化至細胞變圓、即將從瓶壁脫落時停止消化并繼續(xù)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。胡黃連苷Ⅱ用無血清培養(yǎng)液溶解，配置成濃度為0、5、10、20、40及60 μmol/L的含藥培養(yǎng)液。

1.2.2 胡黃連苷Ⅱ?qū)κ彻馨〦ca109細胞增殖的影響：收集對數(shù)生長期細胞，分別用0、5、10、20、40及60 μmol/L的含藥培養(yǎng)液培養(yǎng)食管癌Eca細胞48 h，用MTT試劑盒檢測細胞增殖情況，每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μl，培養(yǎng)4 h后吸去上清液，加入二甲基亞砜150 μl，搖勻后于酶標儀中測定吸光度記為A實驗，同時設置對照孔(含細胞、培養(yǎng)基及MTT溶液，不含藥物)及空白孔(含培養(yǎng)基、MTT溶液，不含藥物和細胞)，計算細胞增殖抑制率(%)=[(A對照-A實驗)/(A對照-A空白)]×100%。每組5個復孔，實驗重復3次(n=3)。選取對食管癌Eca109細胞增殖抑制率較強的含藥培養(yǎng)液進行后續(xù)實驗。

1.2.3 細胞分組及處理：收集對數(shù)生長期細胞，分為正常培養(yǎng)組(不加藥物，常規(guī)培養(yǎng))、胡黃連苷Ⅱ組(20 μmol/L胡黃連苷Ⅱ含藥培養(yǎng)液200 μl)、激活劑組(等量20 μmol/L MEK/ERK信號通路激活劑)及胡黃連苷Ⅱ+激活劑組(等量20 μmol/L胡黃連苷Ⅱ含藥培養(yǎng)液+20 μmol/L MEK/ERK信號通路激活劑)，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)48 h后，收集四組細胞進行實驗。

1.2.4 MTT法檢測細胞增殖活性：采用MTT法檢測四組食管癌Eca109細胞增殖情況，測定方法同“1.2.2”項。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡及周期情況：參考文獻[9]并按照AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒中的要求進行操作，將四組食管癌Eca109細胞加入胰蛋白酶進行消化，加入FBS培養(yǎng)基終止消化，調(diào)整細胞密度為1×106個/ml并收集于1.5 ml EP管中，每管1 ml，用預冷PBS緩沖液清洗2次后離心，加入70%的乙醇溶液在4 ℃固定過夜，用PBS緩沖液清洗細胞后離心，重懸于PBS緩沖液中，加入2 μl RNA酶去除內(nèi)源性RNA，加入1 μl Triton X-100增加細胞膜通透性，靜置45 min后加入2 μl PI溶液，避光下染色1 h，用細胞流式儀觀察并分析細胞凋亡及周期情況。每組5個復孔，實驗重復3次(n=3)。

1.2.6 Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力：收集四組食管癌Eca109細胞，調(diào)整細胞密度至2×105個/ml，各取細胞液200 μl加入預鋪設稀釋Matrigel膠的上室，用RPMI-1640培養(yǎng)液補至1 ml，下室加入含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液600 μl，培養(yǎng)24 h，擦拭膠上細胞及Matrigel膠，將小室于4%多聚甲醛中固定20 min并室溫(25 ℃)風干，接著用結(jié)晶紫染液浸染20 min，室溫風干后去除聚碳酸酯膜，置于載玻片上，以樹膠封片，于光學顯微鏡下觀察小室細胞侵襲情況，計算穿過Matrigel基質(zhì)的平均細胞數(shù)[10]。實驗重復3次(n=3)。

1.2.7 劃痕實驗檢測細胞遷移能力：收集四組食管癌Eca109細胞，將細胞置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞融合率約90%時，用200 μl槍頭垂直于6孔板底部做橫線劃痕，之后繼續(xù)置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，于倒置顯微鏡下拍照觀察，利用Image J軟件測量劃痕區(qū)域?qū)挾?，并計算細胞劃痕愈合?%)=[(0 h劃痕區(qū)域?qū)挾?12 h劃痕區(qū)域?qū)挾?/0 h劃痕區(qū)域?qū)挾萞×100%[11]。實驗重復3次(n=3)。

1.2.8 蛋白免疫印跡法檢測細胞凋亡相關(guān)蛋白、周期相關(guān)蛋白和MEK/ERK通路相關(guān)蛋白表達情況：收集四組食管癌Eca109細胞，吸去培養(yǎng)基后置于滅菌離心管中，加入RIPA裂解液提取其中蛋白質(zhì)，用BCA蛋白試劑盒測定細胞中總蛋白含量，用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量蛋白質(zhì)后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，在4 ℃下添加Caspase-3、Bax、Bcl-2、cyclinD1、cyclinD3、CDK2、p-c-Raf、p-MEK、MEK、p-ERK、ERK與β-actin一抗(均為1∶1 000稀釋)孵育過夜，用TBST緩沖液洗滌后添加二抗(1∶5 000稀釋)常溫下孵育2 h，采用凝膠成像儀對蛋白水平進行定量分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 胡黃連苷Ⅱ?qū)κ彻馨〦ca109細胞增殖的影響

與0 μmol/L組(0%)相比，5、10、20、40和60 μmol/L的胡黃連苷Ⅱ?qū)κ彻馨〦ca109細胞增殖抑制率[(14.06±1.69)%、(19.44±2.21)%、(25.71±2.59)%、(23.04±2.38)%和(21.25±2.25)%]顯著升高(F=25.922，P=0.000)，其中20 μmol/L胡黃連苷Ⅱ?qū)κ彻馨〦ca109細胞增殖抑制率最高，因此，選擇20 μmol/L胡黃連苷Ⅱ用于后續(xù)實驗。

2.2 四組食管癌Eca109細胞增殖情況比較

與正常培養(yǎng)組[食管癌Eca109細胞增殖抑制率為(11.59±1.21)%]相比，胡黃連苷Ⅱ組食管癌Eca109細胞增殖抑制率[(25.68±1.68)%]升高，激活劑組細胞增殖抑制率[(8.01±1.20)%]降低；與胡黃連苷Ⅱ組相比，胡黃連苷Ⅱ+激活劑組食管癌Eca109細胞增殖抑制率[(15.30±1.27)%]降低；與激活劑組相比，胡黃連苷Ⅱ+激活劑組食管癌Eca109細胞增殖抑制率升高，上述差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3 四組食管癌Eca109細胞凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白表達比較

與正常培養(yǎng)組相比，胡黃連苷Ⅱ組細胞凋亡率、Caspase-3及Bax蛋白表達升高，Bcl-2蛋白表達降低；激活劑組細胞凋亡率、Caspase-3及Bax蛋白表達降低，Bcl-2蛋白表達升高，上述差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與胡黃連苷Ⅱ組相比，胡黃連苷Ⅱ+激活劑組細胞凋亡率、Caspase-3及Bax蛋白表達降低，Bcl-2蛋白表達升高；與激活劑組相比，胡黃連苷Ⅱ+激活劑組細胞凋亡率、Caspase-3及Bax蛋白表達升高，Bcl-2蛋白表達降低，上述差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1、圖1—2。

表1 四組食管癌Eca109細胞凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白表達比較Tab 1 Comparison of apoptosis rate and expression of apoptosis-related protein among 4 group of esophageal

A.正常培養(yǎng)組；B.胡黃連苷Ⅱ組；C.激活劑組；D.胡黃連苷Ⅱ+激活劑組A. normal culture group; B. picroside Ⅱ group; C. activator group; D. picroside Ⅱ+activator group圖1 四組食管癌Eca109細胞凋亡率比較Fig 1 Comparison of apoptosis rate among 4 group of esophageal cancer Eca109 cells

A.正常培養(yǎng)組；B.胡黃連苷 Ⅱ 組；C.激活劑組；D.胡黃連苷 Ⅱ +激活劑組A. normal culture group; B. picroside Ⅱ group; C. activator group; D. picroside Ⅱ+activator group圖2 四組食管癌Eca109細胞凋亡相關(guān)蛋白表達比較Fig 2 Comparison of expression of apoptosis-related protein among 4 groups of esophageal cancer Eca109 cells

2.4 四組食管癌Eca109細胞周期分布情況比較

與正常培養(yǎng)組相比，胡黃連苷Ⅱ組G0/G1期、S期比例升高，G2/M期比例降低；激活劑組G0/G1期、S期比例降低，G2/M期比例升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與胡黃連苷Ⅱ組相比，胡黃連苷Ⅱ+激活劑組G0/G1期、S期比例降低，G2/M期比例升高；與激活劑組相比，胡黃連苷Ⅱ+激活劑組G0/G1期、S期比例升高，G2/M期比例降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 四組食管癌Eca109細胞周期分布情況比較Tab 2 Comparison of distribution of cell cycle among 4 groups of esophageal cancer Eca109 cells n=3，%)

2.5 四組食管癌Eca109細胞侵襲及遷移能力比較

與正常培養(yǎng)組相比，胡黃連苷Ⅱ組侵襲細胞數(shù)、劃痕愈合率降低，激活劑組侵襲細胞數(shù)、劃痕愈合率升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與胡黃連苷Ⅱ組相比，胡黃連苷Ⅱ+激活劑組侵襲細胞數(shù)、劃痕愈合率升高；與激活劑組相比，胡黃連苷Ⅱ+激活劑組侵襲細胞數(shù)、劃痕愈合率降低，上述差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3、圖3—4。

表3 四組食管癌Eca109細胞侵襲及遷移能力比較Tab 3 Comparison of invasive and metastasizing ability among 4 groups of esophageal cancer Eca109 cells n=3)

A.正常培養(yǎng)組；B.胡黃連苷Ⅱ組；C.激活劑組；D.胡黃連苷Ⅱ+激活劑組A. normal culture group; B. picroside Ⅱ group; C. activator group; D. picroside Ⅱ+activator group圖3 四組食管癌Eca109細胞侵襲能力比較(結(jié)晶紫染色，×200)Fig 3 Comparison of invasive ability among 4 groups of esophageal cancer Eca109 cells (crystal violet staining, ×200)

A.正常培養(yǎng)組；B.胡黃連苷Ⅱ組；C.激活劑組；D.胡黃連苷Ⅱ+激活劑組A. normal culture group; B. picroside Ⅱ group; C. activator group; D. picroside Ⅱ+activator group圖4 四組食管癌Eca109細胞遷移能力比較Fig 4 Comparison of metastasizing ability among 4 groups of esophageal cancer Eca109 cells

2.6 四組食管癌Eca109細胞周期相關(guān)蛋白、MEK/ERK通路相關(guān)蛋白表達比較

與正常培養(yǎng)組相比，胡黃連苷Ⅱ組食管癌Eca109細胞周期相關(guān)蛋白(cyclinD1、cyclinD3和CDK2)、MEK/ERK通路相關(guān)蛋白(p-c-Raf、p-MEK和p-ERK)表達降低；激活劑組細胞周期相關(guān)蛋白、MEK/ERK通路相關(guān)蛋白表達升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與胡黃連苷Ⅱ組相比，胡黃連苷Ⅱ+激活劑組食管癌Eca109細胞周期相關(guān)蛋白、MEK/ERK通路相關(guān)蛋白表達升高；與激活劑組相比，胡黃連苷Ⅱ+激活劑組食管癌Eca109細胞周期相關(guān)蛋白、MEK/ERK通路相關(guān)蛋白表達降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4、圖5—6。

表4 四組食管癌Eca109細胞周期及MEK/ERK通路相關(guān)蛋白表達比較Tab 4 Comparison of cell cycle and MEK/ERK pathway related protein expression of esophageal cancer Eca109 cells in each group n=3)

A.正常培養(yǎng)組；B.胡黃連苷 Ⅱ 組；C.激活劑組；D.胡黃連苷 Ⅱ +激活劑組A. normal culture group; B. picroside Ⅱ group; C. activator group; D. picroside Ⅱ+activator group圖5 四組食管癌Eca109細胞周期相關(guān)蛋白表達比較Fig 5 Comparison of expression of cell cycle-related protein among 4 groups of esophageal cancer Eca109 cells

A.正常培養(yǎng)組；B.胡黃連苷Ⅱ組；C.激活劑組；D.胡黃連苷Ⅱ+激活劑組A. normal culture group; B. picroside Ⅱ group; C. activator group; D. picroside Ⅱ+activator group圖6 四組食管癌Eca109細胞MEK/ERK通路相關(guān)蛋白表達比較Fig 6 Comparison of expression MEK/ERK pathway-related protein among 4 groups of esophageal cancer Eca109 cells

3 討論

食管癌是常見的惡性腫瘤，我國是食管癌高發(fā)區(qū)，食管癌的發(fā)病與吸煙、喝酒及不良飲食習慣等多種因素密切相關(guān)，常有手術(shù)、化療和放療等多種治療方法，但仍表現(xiàn)出較低的存活率[12]。因此，尋找有效的藥物對于治療食管癌具有重要意義。資料顯示，胡黃連苷Ⅱ是中藥胡黃連的有效成分之一，具有抗氧化、抗凋亡、抗炎、抗腫瘤、神經(jīng)保護、護肝和抗膽固醇等多種藥理作用[13]，可在緩解急性胰腺炎[14]、心肌梗死[15]等方面發(fā)揮重要作用；且胡黃連苷Ⅱ具有誘導腎癌細胞凋亡的作用，通過改變Bax、Bcl-2等細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達來發(fā)揮作用[16]。Caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白表達與細胞凋亡密切相關(guān)，Caspase-3、Bax是介導細胞凋亡的關(guān)鍵水解酶，是細胞凋亡過程中的重要調(diào)控因子；Bcl-2是一種抗凋亡因子，可側(cè)面反應細胞凋亡狀態(tài)[17]。本研究結(jié)果顯示，與正常培養(yǎng)組相比，胡黃連苷Ⅱ組食管癌Eca109細胞增殖抑制率、凋亡率升高，Caspase-3、Bax蛋白表達升高，Bcl-2蛋白表達降低，細胞侵襲、遷移能力降低，表明胡黃連苷Ⅱ具有一定的誘導人食管癌Eca109細胞凋亡、抑制細胞侵襲、遷移的作用，推測其具有潛在的食管癌治療作用，但其作用機制尚不明確。

細胞周期是由細胞周期蛋白(cyclins)及細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)調(diào)控的，CDK4是CDK家族重要成員，在細胞周期調(diào)控過程中起到關(guān)鍵作用，當細胞受到不良刺激時，CDK4與cyclins D1結(jié)合形成復合物，進而引起細胞周期發(fā)生紊亂，使細胞分化減弱、異常增殖、功能紊亂，最后發(fā)展為腫瘤細胞[18]。MEK/ERK信號通路的過度激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展聯(lián)系密切，ERK信號通路在血管內(nèi)皮細胞增殖及新血管生成過程中發(fā)揮重要作用，持續(xù)性激活的ERK信號通路可正向調(diào)控細胞周期，推動細胞由G1期進入S期，進而促進細胞異常增殖與分化[19]。資料顯示，活化的cyclins D可激活MEK/ERK信號通路，使得p-ERK表達增加，導致cyclins D等細胞周期相關(guān)蛋白的表達增加，加速細胞周期進程，促進細胞增殖，進而導致腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[20]。本研究結(jié)果顯示，胡黃連苷Ⅱ處理過的食管癌Eca109細胞周期相關(guān)蛋白、MEK/ERK通路相關(guān)蛋白表達較正常培養(yǎng)細胞降低，表明胡黃連苷Ⅱ具有一定的調(diào)節(jié)細胞周期并抑制MEK/ERK通路激活的作用；用胡黃連苷Ⅱ和MEK/ERK通路激活劑共同處理食管癌Eca109細胞后，藥物的抑制增殖及抗凋亡能力減弱，進一步表明胡黃連苷Ⅱ抑制MEK/ERK通路是其發(fā)揮抗食管癌作用的重要機制之一。

綜上所述，胡黃連苷Ⅱ具有抑制食管癌細胞增殖、遷移和侵襲的作用，與調(diào)節(jié)細胞凋亡、周期相關(guān)蛋白的表達密切相關(guān)，其中抑制MEK/ERK通路在抗食管癌細胞增殖過程中起到重要作用，但其作用機制較為復雜，仍需深入研究。