賈永利，楊新明，張培楠，孟憲勇，胡長波

(河北北方學院附屬第一醫(yī)院骨外科，河北 張家口 075000)

布魯氏菌病是一種常見的人畜共患病，因布魯氏菌感染引起。布魯氏菌為革蘭陰性胞內寄生菌，主要有消化道、呼吸道及皮膚接觸等多種感染途徑，可導致動物不育、流產，嚴重降低畜牧業(yè)經濟效益，并可造成患者心、肝、腦及泌尿等全身器官和或(系統)病變，導致盜汗、渾身無力和發(fā)熱，極大威脅人們的生命健康[1-3]。布魯氏菌能引發(fā)人類機體嚴重的免疫炎癥反應，細胞免疫及體液免疫均參與其中，布魯氏菌感染機體后，可激活免疫細胞，促使其合成分泌炎癥因子，引發(fā)炎癥；還可誘導機體免疫系統生成免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)，形成免疫復合物，進一步激發(fā)免疫效應，促使炎癥進展[4-6]。免疫炎癥反應是機體受到外界刺激時發(fā)生的復雜病理過程，活性氧(ROS)/硫氧還蛋白結合蛋白(TXNIP)通路是參與介導該過程的主要信號，減少ROS的產生，可下調TXNIP表達，抑制炎癥反應，預防細菌感染引起的急性肺損傷，因此，抑制ROS/TXNIP通路可作為布魯氏菌病的潛在治療手段[7]。紫草素是提取自紫草的天然活性成分，具有良好的抗菌、消炎作用，能顯著抑制金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌及白色念珠菌等多種常見菌的生長，并可減少炎癥因子釋放，減輕炎癥損傷，緩解脂多糖誘導的小鼠肺損傷[8-9]。因此，推測紫草素對布魯氏菌病也可能有較好的治療作用。本研究基于ROS/TXNIP通路對紫草素保護布魯氏菌感染小鼠的作用進行探討，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器：Multiskan FC型酶標儀購自上海騰名生物科技有限公司；Mini-PROTEAN Tetra型蛋白電泳儀、Trans-Blot Turb型蛋白快速轉膜儀購自美國Bio-Rad公司；TD-4M型低溫高速離心機購自濟南來寶醫(yī)療器械有限公司；GenoSens 2000 Touch型系列凝膠成像系統購自上海勤翔科學儀器有限公司。

1.1.2 實驗細菌：布魯氏菌購自美國菌種保藏中心，批號25840。

1.1.3 藥品與試劑：紫草素(原料藥，純度≥98%)購自上海喬羽生物科技有限公司，批號為QY-0022；布魯氏菌液體培養(yǎng)基、選擇性培養(yǎng)基購自青島海博生物技術有限公司，批號為HB7027、HB0315-1；ROS抑制劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)(批號為ab143032)、小鼠IgG酶聯免疫吸附試劑盒(批號為ab151276)、小鼠IgM酶聯免疫吸附試劑盒(批號為ab215085)、小鼠γ干擾素(IFN-γ)酶聯免疫吸附試劑盒(批號為ab100689)、小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯免疫吸附試劑盒(批號為ab100713)、小鼠白細胞介素6(IL-6)酶聯免疫吸附試劑盒(批號為ab222274)、兔源GAPDH一抗(批號為ab9485)、兔源TXNIP一抗(批號為ab263899)及羊抗鼠二抗(批號為ab188865)購自美國Abcam公司；ROS測定試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司，批號為E004；全血總蛋白提取試劑盒購自上海貝博生物試劑公司，批號為BB-31967-1；BCA試劑盒、化學發(fā)光試劑購自上海經科化學科技有限公司，批號為JK-201、JK-305；RIPA裂解液購自上海碧云天公司，批號為P0013K。

1.1.4 實驗動物：SPF級BALB/C小鼠購于河北省實驗動物中心，雌雄不限，10周齡，體重22～26 g，動物生產許可證號為SCXK(冀)2019-0001，動物使用許可證號為SYXK(冀)2019-0009，動物質量合格證號為LD501134。在河北北方學院附屬第一醫(yī)院動物實驗室中飼養(yǎng)，室內溫度約25 ℃、相對濕度約50%，保持安靜，良好通風。

1.2 方法

1.2.1 小鼠模型的建立及分組處理：將BALB/C小鼠隨機分為對照組、模型組、紫草素組(50 mg/kg)、NAC組(ROS抑制劑NAC 20 mg/kg)、紫草素+NAC組(紫草素50 mg/kg+ROS抑制劑NAC 20 mg/kg)，每組16只。除對照組外，其余組構建布魯氏菌感染小鼠模型。參照文獻[10]操作，將布魯氏菌菌種涂布接種在布魯氏菌選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，72 h后挑取單個、光滑的菌落，接種在液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，吸取菌液1 ml，以12 000 r/min離心后以PBS緩沖液漂洗布魯氏菌沉淀，以PBS緩沖液重懸，采用麥氏比濁法計數，并稀釋菌液為5.0×106CFU/ml，每只小鼠腹腔注射該菌液200 μl建立感染小鼠模型，對照組16只小鼠腹腔注射PBS緩沖液200 μl。以0.9%氯化鈉溶液溶解紫草素和NAC，分別制備成5 mg/ml的紫草素溶液[11]、2 mg/ml的NAC溶液[12]、紫草素和NAC的混合溶液(紫草素、NAC質量濃度分別為5、2 mg/ml)，紫草素組、NAC組和紫草素+NAC組小鼠每日以10 ml/kg劑量的相應溶液灌胃，模型組和對照組小鼠每日以相同劑量的0.9%氯化鈉溶液灌胃，均每日灌胃1次，共進行14 d。

1.2.2 標本采集及小鼠肝脾指數測定：末次灌胃給藥24 h后，稱量五組小鼠體重后，脫頸處死，從腹主動脈取血5 ml，其中每組8只小鼠的血液于4 ℃下，以3 000 r/min離心15 min，吸取上清液置于Ep管中；剩余8只小鼠的血液，取2 ml進行ROS水平檢測；剩余3 ml以全血總蛋白提取試劑盒提取總蛋白后，采用BCA試劑盒測量其濃度(步驟按照各自試劑盒說明書進行)，血清與血中總蛋白均放置于-80 ℃儲存，以備后續(xù)實驗使用。取血后，每組隨機選擇8只小鼠取出肝臟和脾臟，稱其重量，計算肝脾指數，臟器指數=臟器濕重/體重×100%；剩余8只小鼠吸取腹腔積液1 ml，稱重后，然后取脾臟組織1 g，加入RIPA裂解液2 ml，勻漿后，以3 000 r/min離心，取上清液，和腹腔積液一起置于4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 小鼠腹腔積液、脾臟載菌量測定：取“1.2.2”項下腹腔積液和脾臟組織樣品液各10 μl涂布接種在布魯氏菌選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，72 h后觀察菌落形成情況，進行細菌計數，載菌量以CFU/g表示。

1.2.4 血清IFN-γ、IL-6、TNF-α、IgG及IgM水平測定：取“1.2.2”項下血清，4 ℃下解凍，以酶聯免疫吸附法按照試劑盒的操作步驟測定血清IFN-γ、IL-6、TNF-α、IgG及IgM水平。

1.2.5 血液中ROS水平、TXNIP蛋白水平檢測：使用ROS測定試劑盒測量“1.2.2”項下全血ROS水平，具體步驟按照試劑盒說明書進行。取出血液蛋白樣品液，各樣本分別取20 μl，110 V恒定電壓下電泳，然后以同樣電壓濕轉，將分離蛋白轉印至聚偏二氟乙烯膜上，采用5%濃度的脫脂奶粉室溫孵育2 h，行封閉處理，以稀釋比為1∶2 000的兔源TXNIP、GAPDH一抗溶液于4 ℃下孵育過夜，以TBST緩沖液漂洗3次，加入稀釋比為1∶5 000的羊抗鼠二抗溶液室溫孵育2 h，以TBST緩沖液漂洗3次，使用化學發(fā)光試劑使蛋白條帶顯色，使用凝膠成像儀拍照，最終以Quantity One軟件分析圖像，得出TXNIP蛋白的相對表達量。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 五組小鼠肝脾指數比較

與對照組比較，模型組小鼠的肝臟和脾臟指數明顯升高；與模型組比較，紫草素組、NAC組及紫草素+NAC組小鼠的肝臟和脾臟指數明顯降低；與紫草素組及NAC組分別比較，紫草素+NAC組小鼠的肝臟和脾臟指數均明顯降低，上述差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 五組小鼠肝脾指數比較Tab 1 Comparison of liver and spleen indicators of

2.2 五組小鼠腹腔積液載菌量比較

與對照組比較，模型組小鼠腹腔積液載菌量明顯升高；與模型組比較，紫草素組、NAC組及紫草素+NAC組小鼠腹腔積液載菌量明顯降低；與紫草素組及NAC組分別比較，紫草素+NAC組小鼠腹腔積液載菌量均明顯降低，上述差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 五組小鼠腹腔積液載菌量比較Tab 2 Comparison of bacterial load in peritoneal effusion of mice among 5 group

2.3 五組小鼠脾臟載菌量比較

與對照組比較，模型組小鼠脾臟載菌量明顯升高；與模型組比較，紫草素組、NAC組及紫草素+NAC組小鼠脾臟載菌量明顯降低；與紫草素組及NAC組分別比較，紫草素+NAC組小鼠脾臟載菌量均明顯降低，上述差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 五組小鼠脾臟載菌量比較Tab 3 Comparison of bacterial load in spleen of mice

2.4 五組小鼠血清IFN-γ、IL-6及TNF-α水平比較

與對照組比較，模型組小鼠血清IFN-γ、IL-6、TNF-α水平明顯升高；與模型組比較，紫草素組、NAC組及紫草素+NAC組小鼠血清IFN-γ、IL-6及TNF-α水平明顯降低；與紫草素組及NAC組分別比較，紫草素+NAC組小鼠血清IFN-γ、IL-6、TNF-α水平均明顯降低，上述差異均有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 五組小鼠血清IFN-γ、IL-6及TNF-α水平比較Tab 4 Comparison of serum IFN-γ, IL-6 and TNF-α levels of mice among 5 group

2.5 五組小鼠血清IgG、IgM水平比較

與對照組比較，模型組小鼠血清IgG、IgM水平明顯升高；與模型組比較，紫草素組、NAC組及紫草素+NAC組小鼠血清IgG、IgM水平明顯降低；與紫草素組及NAC組分別比較，紫草素+NAC組小鼠血清IgG、IgM水平均明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 五組小鼠血清IgG、IgM水平比較Tab 5 Comparison of serum IgG and IgM levels of mice

2.6 五組小鼠血液中ROS水平和TXNIP蛋白表達水平比較

與對照組比較，模型組小鼠血液中ROS水平和TXNIP蛋白表達水平明顯升高；與模型組比較，紫草素組、NAC組及紫草素+NAC組小鼠血液中ROS水平和TXNIP蛋白表達水平明顯降低；與紫草素組及NAC組分別比較，紫草素+NAC組小鼠血液中ROS水平和TXNIP蛋白表達水平均明顯降低，上述差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖1、表6。

A.對照組；B.模型組；C.紫草素組；D.NAC組；E.紫草素+NAC組A. control group; B. model group; C. Shikonin group; D. NAC group; E. Shikonin+NAC group圖1 蛋白免疫印跡檢測五組小鼠血液中TXNIP蛋白表達Fig 1 Expression of TXNIP protein in blood of mice in 5 groups detected by protein immunoblotting

表6 五組小鼠血液中ROS水平和TXNIP蛋白表達水平比較Tab 6 Comparison of ROS level and expression level of TXNIP protein in blood of mice among 5 group

3 討論

本研究通過腹腔注射布魯氏菌菌液制備布魯氏菌感染小鼠模型，結果顯示，感染小鼠的肝臟指數、脾臟指數、腹腔積液載菌量及脾臟載菌量顯著升高，血清IFN-γ、IL-6、TNF-α、IgG和IgM水平顯著升高，表明布魯氏菌在小鼠體內生長，并引發(fā)免疫炎癥反應，造成肝脾腫大受損，說明模型建立成功。

紫草素為天然藥物紫草的主要活性成分，具有抑菌、抗炎、抗腫瘤和抗病毒等多種藥理作用，可破壞細菌細胞膜完整性，抑制白色念珠菌、大腸埃希菌和蠟狀芽孢桿菌等多種菌株生長，并可阻止心肌缺血再灌注引發(fā)的炎癥發(fā)生，降低機體氧化應激水平，減輕心肌梗死小鼠的心肌損傷[11，13-14]。由此推測，紫草素也可能抑制布魯氏菌生長，并通過減輕炎癥改善布魯氏菌病的臨床癥狀。本研究以紫草素灌胃布魯氏菌感染模型小鼠，結果顯示，紫草素可降低布魯氏菌感染小鼠的肝臟指數、脾臟指數、腹腔積液載菌量和脾臟載菌量，降低布魯氏菌感染小鼠血清IFN-γ、IL-6、TNF-α、IgG和IgM水平，表明紫草素可抑制布魯氏菌在小鼠體內生長繁殖，降低炎癥因子及抗體水平，減輕細胞和體液免疫應答，抑制炎癥發(fā)生及進展，緩解肝脾器官損傷。

ROS/TXNIP通路是機體中調控炎癥反應的重要信號通路，機體受到細菌感染、缺血及缺氧等外界刺激時，ROS大量產生，促進TXNIP表達，誘導下游NOD樣受體蛋白3炎癥信號激活，導致炎癥發(fā)生；NAC是ROS清除劑，可降低ROS水平，下調TXNIP蛋白表達，進而抑制炎癥反應發(fā)生及進展[15-17]。因此，ROS/TXNIP可作為布魯氏菌病的潛在治療靶點。本研究結果顯示，小鼠感染布魯氏菌后，體內ROS/TXNIP處于激活狀態(tài)，而紫草素可下調ROS水平和TXNIP蛋白表達水平，表明ROS/TXNIP通路參與調控布魯氏菌感染的病理過程，下調該通路蛋白表達，可減輕感染小鼠的臨床癥狀；NAC與紫草素作用相似，均可抑制ROS/TXNIP激活，減輕炎癥，降低小鼠肝脾損傷；進一步研究結果顯示，紫草素及NAC聯合應用，可進一步降低布魯氏菌感染小鼠的肝臟指數、脾臟指數、腹腔積液載菌量和脾臟載菌量，降低血清IFN-γ、IL-6、TNF-α、IgG和IgM水平，降低血液中ROS水平、TXNIP蛋白表達水平，相比紫草素、NAC單獨處理，作用更強，表明兩者聯合應用具有協同作用，可更有效地抑制小鼠體內布魯氏菌繁殖生長，減少炎癥因子及抗體合成分泌，抑制細胞和體液免疫應答，減輕炎癥，改善小鼠癥狀。

綜上所述，紫草素具有明顯的抗布魯氏菌作用，可抑制布魯氏菌在動物體內生長，減輕機體免疫應答，抑制炎癥反應，緩解肝脾器官損傷，改善細菌感染癥狀，為布魯氏菌病的臨床治療提供了新的思路，抑制ROS/TXNIP通路激活可能是其藥理機制之一。但本研究還未使用該通路激動劑進行對照驗證，需后續(xù)深入研究，改善其不足。