伍 超，黃志鴻，陸 珊，劉鑫馗，范嘯天，譚影影，巫志姍，李佳霖，張曉朦，王苗苗，吳嘉瑞

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488)

小兒急熱驚風(fēng)為中醫(yī)兒科常見急危癥，多由外感時邪、濕熱內(nèi)蘊、痰蒙熱閉及熱極生風(fēng)等病因引起，以高熱、四肢抽搐、牙關(guān)緊閉和意識障礙等為主要臨床表現(xiàn)。若治療不及時，可嚴(yán)重影響患兒腦部及身體生長發(fā)育，甚至誘發(fā)癲癇等疾病，給患兒及其家庭的未來生活造成巨大的物質(zhì)及身心負(fù)擔(dān)[1-2]。中醫(yī)臨床治療小兒急熱驚風(fēng)，以清熱豁痰、開竅醒神、息風(fēng)鎮(zhèn)驚和補益和中為原則[3-4]。小兒清熱化積散由川貝母、大黃、全蝎、琥珀、僵蠶(麩炒)、牛黃、冰片、天麻、黃連、膽南星及甘草等11味中藥組成，具有化積、鎮(zhèn)驚息風(fēng)和清熱豁痰的功效，契合治療原則，臨床上常用于治療小兒急熱驚風(fēng)、四肢抽搐、痰雍盛以及發(fā)熱咳嗽。但是，尚無小兒清熱化積散相關(guān)的藥理作用機制報道。中藥及其復(fù)方均存在活性成分復(fù)雜、作用靶點及途徑多樣的現(xiàn)象，常規(guī)單一靶標(biāo)研究方法較難全面闡釋中藥及其復(fù)方的藥理作用機制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整合系統(tǒng)生物學(xué)、生物信息學(xué)及計算機科學(xué)等多學(xué)科技術(shù)方法，構(gòu)建并分析生物分子網(wǎng)絡(luò)，其研究方法具有高通量、整體性的特點，已被廣泛應(yīng)用于中藥及中藥復(fù)方的活性成分預(yù)測及作用機制研究[5-6]。本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的技術(shù)方法，整體性研究小兒清熱化積散治療小兒急熱驚風(fēng)的作用機制，并利用分子對接技術(shù)核查重要化合物與關(guān)鍵靶點的結(jié)合能力，以期為小兒清熱化積散的基礎(chǔ)研究及臨床合理應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1 小兒清熱化積散活性化合物的收集

將小兒清熱化積散中11味中藥分別進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索和文獻(xiàn)閱讀，以獲得相關(guān)活性化合物。檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(https://tcmspw.com/index.php)，檢索限制條件為口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、腸道吸收Caco-2≥-0.4和類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18；檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)成分分析平臺(bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine，BATMAN-TCM)(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm)，檢索限制條件為Score cutoff≤20、P<0.05；檢索中藥綜合數(shù)據(jù)庫(traditional Chinese medicine integrated database，TCMID)(http://119.3.41.228∶8000/tcmid)。上述數(shù)據(jù)庫缺失的中藥化合物信息通過閱讀文獻(xiàn)找回。除TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得的化合物外，其余途徑獲得的化合物均通過瑞士洛桑大學(xué)生物信息學(xué)研究所Swiss ADME數(shù)據(jù)庫(http://www.swissadme.ch)進(jìn)行藥物吸收度和DL的篩選。

1.2 潛在生物靶點數(shù)據(jù)的收集

1.2.1 小兒清熱化積散潛在靶點的預(yù)測：通過瑞士洛桑大學(xué)生物信息學(xué)研究所Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)，對“1.1”項下所有潛在活性化合物進(jìn)行作用靶點預(yù)測，取可能性(probability)>0.1的靶點。對于TCMSP、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫中化合物對應(yīng)的靶點經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫Uniprot(https://www.uniprot.org)，選擇物種“智人(Homosapiens)”，進(jìn)行名稱校正，再合并收集上述所有靶點作為小兒清熱化積散的預(yù)測靶點。

1.2.2 小兒急熱驚風(fēng)相關(guān)疾病靶點的收集：現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中驚厥、熱性驚厥和癲癇等疾病均屬于小兒急熱驚風(fēng)范疇。故分別以“convulsion”“infantile convulsion”“febrile convulsions”和“infantile epilepsy”為關(guān)鍵詞，檢索疾病靶點DisGeNET數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)及治療靶點數(shù)據(jù)庫(therapeutic target database，TTD)(https://db.idrblab.org/ttd)，獲得驚厥、熱性驚厥、小兒驚厥及小兒癲癇等小兒急熱驚風(fēng)相關(guān)疾病的靶點。

1.3 生物網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)提供可以直觀反映蛋白質(zhì)之間相互作用和預(yù)測作用的信息[7]。將上述收集的所有靶點信息上傳至STRING數(shù)據(jù)庫，選擇物種“智人(Homosapiens)”，獲得相關(guān)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)數(shù)據(jù)。運用Cytoscape 3.6.1軟件對PPI數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理，并通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)度值(degree)、緊密中心性(closeness-centrality)分析網(wǎng)絡(luò)中的靶點。使用Cytoscape軟件中的MCODE功能對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊化處理，選取評分>10分的模塊作為重要模塊進(jìn)行分析。

1.4 關(guān)鍵靶點生物信息學(xué)分析

提取小兒清熱化積散與小兒急熱驚風(fēng)網(wǎng)絡(luò)中的交集子網(wǎng)絡(luò)，將子網(wǎng)絡(luò)中的度值為平均值以上的靶點作為重要靶點。再把重要靶點與重要模塊中的靶點的交集作為關(guān)鍵靶點。借助R軟件包中的clusterProfiler包對上述靶點進(jìn)行基因本體(gene ontology, GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，限定分析條件為“Pvalue Cutoff=0.05，Qvalue Cutoff=0.05”。

1.5 分子對接驗證

分子對接技術(shù)可以評價潛在靶點與其相關(guān)聯(lián)化合物的結(jié)合能力[8]。采用AutoDock 4.2和AutoDock Vina軟件對關(guān)鍵靶點與其相關(guān)聯(lián)化合物進(jìn)行分子對接模擬。大分子蛋白靶受體從結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)研究合作組織(research collaboration for structural bioinformatics，RCSB)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(protein data bank，PDB)(https：//www.rcsb.org)獲得；小分子化合物組分的二維結(jié)構(gòu)從PubChem數(shù)據(jù)庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)獲得。密切系數(shù)越低(結(jié)合能<0 kcal/mol)則認(rèn)為化合物與生物分子靶點之間越能自發(fā)結(jié)合[9]。

2 結(jié)果

2.1 小兒清熱化積散活性化合物及其預(yù)測靶點網(wǎng)絡(luò)

通過TCMSP、BATMAN-TCM和TCMID數(shù)據(jù)庫和相關(guān)文獻(xiàn)報道[10-13]，收集到活性化合物：牛黃15個，冰片18個，全蝎7個，僵蠶15個，天麻13個，川貝母8個，膽南星4個，大黃8個，黃連13個，琥珀10個，甘草16個。整理去重后，共有122個潛在活性化合物。為清楚展示活性化合物與預(yù)測靶點之間的關(guān)系，選取度值排序居前20位的活性化合物，結(jié)合其預(yù)測的作用靶點構(gòu)建“化合物-靶點”網(wǎng)絡(luò)，見圖1。該網(wǎng)絡(luò)由682個節(jié)點、1 976條邊組成，節(jié)點越大表示度值越高，說明該節(jié)點越重要。

圖1 “化合物-靶點”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖Fig 1 Relation diagram of “compound-target” network

2.2 小兒急熱驚風(fēng)相關(guān)疾病靶點分析

從DisGeNET、GeneCards和TTD數(shù)據(jù)庫中共收集得到小兒急熱驚風(fēng)疾病相關(guān)靶點1 023個。經(jīng)R軟件clusterProfiler包對疾病靶點進(jìn)行GO和KEGG分析發(fā)現(xiàn)，小兒急熱驚風(fēng)與膜電位調(diào)節(jié)、對金屬離子的反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、化學(xué)突觸傳遞的調(diào)節(jié)、跨突觸信號的調(diào)節(jié)以及神經(jīng)元死亡等生物過程相關(guān)；與神經(jīng)元細(xì)胞體、轉(zhuǎn)運體復(fù)合體、跨膜轉(zhuǎn)運蛋白復(fù)合物、離子通道復(fù)合體以及突觸前膜等細(xì)胞組成相關(guān)；涉及PI3K-AKT、阿爾茨海默病、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、MAPK、人巨細(xì)胞病毒感染、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、Ras、cAMP、人類免疫缺陷病毒1型感染以及惡性腫瘤中的蛋白多糖等信號通路，見圖2。提示對于小兒急熱驚風(fēng)的治療很可能與神經(jīng)元膜電位調(diào)節(jié)、神經(jīng)調(diào)節(jié)等生物功能相關(guān)。

圖2 疾病靶點GO和KEGG分析圖Fig 2 Diagram of GO and KEGG analysis on disease targets

2.3 “化合物-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)與重要靶點分析

通過STRING數(shù)據(jù)庫獲得化合物預(yù)測靶點與疾病靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)信息，利用Cytoscape軟件中Merge功能合并“化合物-靶點”和“疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)，得到“化合物-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)。從該網(wǎng)絡(luò)中獲得304個“化合物-靶點”和“疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)共有靶點，見圖3(A)。將共有靶點視作小兒清熱化積散對小兒急熱驚風(fēng)的療效潛在作用靶點。經(jīng)拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)參數(shù)分析，取度值>39.366、緊密中心性>0.487的83個靶點為重要靶點，見圖3(B)。通過R軟件clusterProfiler包對療效潛在作用靶點進(jìn)行GO和KEGG富集分析，結(jié)果顯示，上述靶點的生物過程包括膜電位調(diào)節(jié)、對抗菌藥物的反應(yīng)、化學(xué)突觸傳遞的調(diào)節(jié)、跨突觸信號的調(diào)節(jié)、膜去極化以及離子跨膜轉(zhuǎn)運的調(diào)控等；細(xì)胞組成包括離子通道復(fù)合體、跨膜轉(zhuǎn)運蛋白復(fù)合物、轉(zhuǎn)運體復(fù)合體以及神經(jīng)元細(xì)胞體等；分子功能包括門控通道活動、離子通道活性、被動跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性以及陽離子通道活性等；涉及神經(jīng)活性配體-受體相互作用、阿爾茨海默病、MAPK、Ras、惡性腫瘤中的蛋白多糖以及cAMP等信號通路，見圖3(C)。

A.“化合物-靶點”與“疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)交集韋恩圖；B.重要靶點網(wǎng)絡(luò)圖；C.重要靶點GO與KEGG分析A.Venn diagram of the intersection of “compound-target” and “disease-target” networks；B.important targets network；C. Go and KEGG analysis of important targets圖3 “化合物-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)相關(guān)分析Fig 3 Correlation analysis on “compound-disease-target”network

2.4 網(wǎng)絡(luò)模塊和關(guān)鍵靶點分析

從網(wǎng)絡(luò)模塊分析中獲得的聚類模塊可能代表PPI網(wǎng)絡(luò)的一些關(guān)鍵特征，并且可能具有特定的生物學(xué)意義。使用Cytoscape軟件中的MCODE插件對PPI網(wǎng)絡(luò)中的目標(biāo)進(jìn)行模塊分析，結(jié)果顯示，有2個模塊的MCODE評分>10分，模塊1為41.375分[見圖4(A)]，模塊2為10.080分[見圖4(B)]；分別對2個模塊進(jìn)行生物學(xué)注釋，發(fā)現(xiàn)模塊2所涉及的生物功能與小兒急熱驚風(fēng)病理表現(xiàn)相關(guān)，見圖4(C)。通過R軟件clusterProfiler包對模塊2的靶點進(jìn)行GO和KEGG富集分析，歸納總結(jié)小兒清熱化積散治療小兒急熱驚風(fēng)的重要作用機制與神經(jīng)活性配體-受體相互作用、cAMP、cGMP-PKG以及Rap1等信號通路相關(guān)，見圖5。其中，15個靶點源自潛在療效作用靶點，將其與83個重要靶點取交集，即得到5個關(guān)鍵靶點DRD2、HTR1A、OPRK1、GABBR2及PIK3CA。

A.模塊1靶點網(wǎng)絡(luò)圖；B.模塊2靶點網(wǎng)絡(luò)圖；C.模塊2靶點GO和KEGG分析A.module 1 network；B.module 2 network；C.Go and KEGG analysis in module 2圖4 網(wǎng)絡(luò)模塊分析Fig 4 Network module analysis

圖5 “通路-效應(yīng)”示意圖Fig 5 Interpretation of “pathway-effect”

2.5 分子對接分析

將上述關(guān)鍵靶點與其對應(yīng)的化合物進(jìn)行分子對接模擬，以Affinity等參數(shù)展示結(jié)果，見表1。由于HTR1A沒有足夠解析度的晶體結(jié)構(gòu)，故本研究只對DRD2、OPRK1、GABBR2及PIK3CA等4個靶點進(jìn)行分子對接驗證。一般認(rèn)為，結(jié)合能<0 kcal/mol是配體與受體之間有自發(fā)結(jié)合的可能，結(jié)合能<-5 kcal/mol指配體與受體之間有很好的自發(fā)結(jié)合能力。選取關(guān)鍵靶點與化合物最優(yōu)結(jié)合構(gòu)象(結(jié)合能最低)，借助PyMol軟件對其可視化，見圖6。

圖6 關(guān)鍵靶點分子對接最優(yōu)構(gòu)象Fig 6 Optimal conformation of molecular docking of key target

表1 分子對接結(jié)果Tab 1 Result of molecular docking

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，小兒急熱驚風(fēng)相關(guān)疾病靶點的生物學(xué)功能與膜電位調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、化學(xué)突觸傳遞的調(diào)節(jié)、跨突觸信號的調(diào)節(jié)、對抗菌藥物的反應(yīng)、神經(jīng)元死亡的調(diào)控、門控通道活動、被動跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性、電壓門控離子通道活性以及離子通道活性等密切相關(guān)。這些靶點涉及的神經(jīng)活性配體-受體相互作用、PI3K-Akt、cAMP、cGMP-PKG、MAPK、人巨細(xì)胞病毒感染、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染以及Rap1等信號通路可形成通路串話而介導(dǎo)機體發(fā)熱、神經(jīng)系統(tǒng)異常興奮、神經(jīng)元凋亡、鈣離子失調(diào)及平滑肌收縮等效應(yīng)[14-17]。其中，高富集指數(shù)的神經(jīng)活性配體-受體相互作用、cAMP、cGMP-PKG、PI3K-Akt、Rap1及MAPK等6條信號通路的紊亂已被報道可引發(fā)炎癥因子增多、異常發(fā)熱、神經(jīng)系統(tǒng)高興奮性和驚厥抽搐等現(xiàn)象[18-21]，甚至與帕金森病、抑郁癥及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)病相關(guān)[22-24]。因此，針對性干預(yù)上述6條信號通路可能是較優(yōu)的治療策略。

小兒清熱化積散功專小兒急驚、痰熱蒙蔽，效以開竅定驚、清熱豁痰，且其“化合物-靶點-疾病”生物網(wǎng)絡(luò)中的療效潛在作用靶點均顯著富集于神經(jīng)活性配體-受體相互作用、cAMP、cGMP-PKG、PI3K-Akt、Rap1及MAPK等6條信號通路(見圖5)，從而肯定了小兒清熱化積散在退熱、鎮(zhèn)靜、抗驚厥和抗炎等方面的療效。再者，通過分子對接技術(shù)進(jìn)一步驗證4個關(guān)鍵靶點(DRD2、OPRK1、GABBR2及PIK3CA)。多巴胺受體D2(DRD2)是多巴胺G蛋白偶聯(lián)受體中的D2亞型，其活性由抑制腺苷酸環(huán)化酶的G蛋白介導(dǎo)。研究結(jié)果表明，DRD2是調(diào)控睡眠-覺醒活動的重要受體，與神經(jīng)系統(tǒng)興奮性密切相關(guān)[25]。DRD2可以通過調(diào)節(jié)下游抗炎蛋白α-crystallin維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)下游β-arrestins蛋白發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。此外，DRD2還與實驗動物出現(xiàn)驚嚇反應(yīng)相關(guān)[26]。κ型阿片受體(OPRK1)通過鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白(G蛋白)觸發(fā)信號，并調(diào)節(jié)下游效應(yīng)物(如腺苷酸環(huán)化酶)的活性，發(fā)揮鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等作用。OPRK1還可通過減少鈣離子電流和增加鉀離子電導(dǎo)來抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放；作用于多巴胺轉(zhuǎn)運蛋白，阻斷多巴胺的突觸前攝取，使累贅巴胺信號傳遞至突出后神經(jīng)元[27]。γ-氨基丁酸B型受體亞單位2(GABBR2)主要在腦組織表達(dá)，編碼中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸的代謝型受體組成部分的GABAB2亞基。據(jù)報道，GABBR2基因突變與重度抑郁癥、自閉癥和癲癇性腦病等多種神經(jīng)類疾病相關(guān)[28]。磷脂酰肌醇4,5-二磷酸3-激酶催化亞單位α亞型(PIK3CA)編碼PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中Ⅰ類磷脂酰肌醇3激酶(PI3Ks)的p110催化亞單位PI3Kp110α。PIK3CA及PI3K/AKT信號通路的過度激活是兒童局灶性頑固性癲癇、局灶性腦皮質(zhì)異常發(fā)育的常見原因[29-30]。由此可見，DRD2、OPRK1、GABBR2及PIK3CA等靶點介導(dǎo)的生物功能確切與小兒急熱驚風(fēng)發(fā)病和小兒清熱化積散的療效相關(guān)。

綜上所述，小兒清熱化積散可能通過神經(jīng)活性配體-受體相互作用、cAMP、cGMP-PKG及Rap1等信號通路網(wǎng)絡(luò)調(diào)控下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞、神經(jīng)元興奮性、平滑肌活動性、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞生存以及增殖等功能治療小兒急熱驚風(fēng)，DRD2、OPRK1、GABBR2及PIK3CA可能是其關(guān)鍵作用靶點。