楊薈玉，張遠英，周恩慧，龔美源，孔令建，劉冰熔

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)華大基因?qū)W院 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450052

肝功能衰竭(肝衰竭)是嚴重的進行性肝病。肝衰竭時大量肝細胞壞死、凋亡，殘存的肝細胞不能滿足機體需求，導(dǎo)致相關(guān)代謝功能紊亂，紊亂的代謝產(chǎn)物在體內(nèi)堆積對肝細胞造成二次損傷，即“二次打擊”學(xué)說，這被認為是肝衰竭發(fā)生發(fā)展的重要機制之一[1-2]。高氨血癥是肝衰竭最常見的代謝紊亂[3]。我們前期的研究[4-6]結(jié)果表明，血氨升高可以誘導(dǎo)細胞凋亡而致肝細胞損傷，對肝細胞造成“二次打擊”，但機制尚不完全清楚，因此迫切需要新的策略進行機制研究，從而為治療奠定理論基礎(chǔ)。

長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA，LncRNA)長度通常超過200個核苷酸，無蛋白編碼能力。越來越多的證據(jù)[7-8]表明，LncRNA參與了許多重要的生物學(xué)過程，其表達失調(diào)已被證明與許多人類疾病相關(guān)。我們應(yīng)用人凋亡通路LncPathTM芯片篩選出高氨誘導(dǎo)肝細胞中的差異表達LncRNA，通過GO和KEGG通路分析預(yù)測這些差異表達LncRNA的生物學(xué)作用和涉及的信號通路，并對LncRNA及與其相關(guān)的mRNA進行整合分析，探究差異表達LncRNA在高氨誘導(dǎo)肝細胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞來源及分組人正常肝細胞LO2購自中國科學(xué)院細胞庫(上海)。胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司。氯化銨購自上海生工生物工程有限公司。細胞用含青/鏈霉素、體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37 ℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。然后將細胞分為3組：對照組按上述方法常規(guī)培養(yǎng)；高氨1組、高氨2組參考文獻[9]的方法分別用10 mmol/L氯化銨溶液誘導(dǎo)24、48 h，以制備高氨肝細胞模型。

1.2 差異表達LncRNA和mRNA的篩選應(yīng)用Trizol試劑(美國Invitrogen公司)分別常規(guī)提取3組細胞的總RNA，使用NanoDrop2000對每個樣品進行定量分析。人凋亡通路LncPathTM芯片由上?？党缮锟萍加邢薰局谱鞑y序完成：使用安捷倫芯片平臺，用Arraystar Flash RNA標記擴增總RNA并轉(zhuǎn)錄，將產(chǎn)物雜交到人凋亡通路LncPathTM芯片上，用Axon GenePix 4000B微陣列掃描儀掃描芯片，記錄LncRNA或mRNA表達變化比值(FC)。應(yīng)用R limma軟件包對原始數(shù)據(jù)進行分位數(shù)歸一化處理，然后采用兩獨立樣本的t檢驗比較兩組間LncRNA或mRNA的表達水平。以log2FC≥2且P<0.05為差異表達。

1.3 3組細胞中部分差異表達LncRNA表達水平的檢測隨機挑取在3組中均差異表達的5個LncRNA進行實時熒光定量PCR檢測。采用Primer Express 5.0(美國Applied Biosystems)對所選差異表達LncRNA和管家基因GAPDH進行引物設(shè)計，序列見表1,由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 引物序列

第一鏈cDNA合成試劑盒及PCR試劑盒購自美國Invitrogen公司。PCR反應(yīng)體系：2×Master Mix 5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O補足至20 μL。 采用ABI 7 PCR系統(tǒng)，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃10 s，60 ℃60 s,40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，95 ℃10 s，60 ℃60 s，95 ℃15 s，建立熔解曲線。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因表達水平。3組間目的基因表達水平的比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

1.4 GO注釋和KEGG通路分析應(yīng)用GO注釋(http://www.geneontology.org)和KEGG通路分析(http://www.genome.jp/kegg/)探索3組細胞中差異表達LncRNA和mRNA參與的生物學(xué)過程及通路。

1.5 LncRNA與mRNA整合分析通過平行量化LncRNA及其潛在靶基因，得到具有共表達關(guān)系的LncRNA-mRNA關(guān)系對，從中篩選受到共同差異表達miRNA調(diào)控的LncRNA-mRNA關(guān)系對，使用Cytoscope構(gòu)建ceRNA網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 差異表達LncRNA和mRNA的篩選LncRNA和mRNA的表達變化散點圖見圖1。3組間差異表達的LncRNA有8個，差異表達的mRNA有13個，見圖2、表2和表3。

圖2 3組間差異表達的LncRNA(A)和mRNA(B)

表2 3組差異表達LncRNA

表3 3組差異表達mRNA

2.2 差異表達LncRNA表達的驗證5個差異表達LncRNA XLOC_008935、MEG3、DKFZP43410714、AC006978.6和SNAR-A2的實時熒光定量PCR檢測結(jié)果與測序結(jié)果一致，表達水平見表4。

表4 LncRNA XLOC_008935、MEG3、DKFZP434I0714、AC006978.6和SNAR-A2在3組細胞中的表達

2.3 GO注釋和KEGG通路分析見圖3。GO注釋結(jié)果顯示，3組的差異表達LncRNA及mRNA主要參與了細胞凋亡、細胞程序性死亡、細胞死亡、細胞程序性死亡負調(diào)控、生物過程負調(diào)控、凋亡過程調(diào)控等生物學(xué)過程。KEGG分析結(jié)果顯示，3組的差異表達mRNA參與的信號通路包括孕激素介導(dǎo)的卵母細胞成熟通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、卵母細胞減數(shù)分裂和MAPK信號通路；差異表達mRNA MAPK12和RPS6KA3均參與了這4條通路。

圖3 GO注釋(左)和KEGG通路分析(右)結(jié)果

2.4 LncRNA與mRNA整合分析結(jié)果高氨1組與對照組差異表達的LncRNA有60個，差異表達的mRNA有84個；其中LncRNA靶向的mRNA有63個，mRNA對應(yīng)的LncRNA有39個。高氨2組與對照組差異表達的LncRNA有87個，差異表達的mRNA有66個；其中LncRNA靶向的mRNA有33個，mRNA對應(yīng)的LncRNA有33個。高氨2組與高氨1組差異表達的LncRNA共153個，差異表達的mRNA有114個；其中LncRNA靶向的mRNA有62個，mRNA對應(yīng)的LncRNA有65個。ceRNA網(wǎng)絡(luò)圖見圖4。3組細胞中，LncRNA BAIAP3與MAPK12 mRNA關(guān)聯(lián)。

長方形代表LncRNA，三角形代表miRNA，橢圓代表蛋白質(zhì)

3 討論

肝衰竭可引起肝細胞大量壞死和凋亡，由于“殘留”的肝細胞不能滿足機體的需要，機體會出現(xiàn)一系列代謝功能障礙，其中最常見的是血氨增高。D氨基半乳糖和脂多糖誘導(dǎo)的急性肝衰竭大鼠模型顯示，肝細胞凋亡是模型大鼠重要的病理改變，降低血氨可以預(yù)防肝細胞損傷和凋亡[10]。研究[9]發(fā)現(xiàn)10 mmol/L氯化銨溶液是體外高氨肝細胞模型建模的理想濃度；氯化銨能明顯誘導(dǎo)人肝細胞凋亡，但對其他細胞類型影響不大，可能與氨能顯著影響肝細胞RHCG、AQP8的表達有關(guān)。

在本研究中，我們用10 mmol/L氯化銨溶液誘導(dǎo)24、48 h建立高氨肝細胞模型，以分析高氨誘導(dǎo)肝細胞凋亡過程中LncRNA表達譜的變化。 結(jié)果顯示，對照組、高氨1組(誘導(dǎo)24 h)和高氨2組(誘導(dǎo)48 h)共有8個LncRNA和13個mRNA表達有顯著差異。與對照組相比，高氨1組LncRNA AF520792、CYCSP55、DKFZP434I0714、AC006978.6表達下調(diào)，而其在高氨2組表達上調(diào)；MEG3在高氨1組表達上調(diào)，而在高氨2組表達下調(diào)；兩組SNAR-A2表達均下調(diào)，XLOC_008935、CRNDE均上調(diào)。與對照組相比，高氨1組RPS6KA3、BUB1B、SON、USP9X mRNA表達下調(diào)，而其在高氨2組表達上調(diào)；SSTR3、EDAR、CRYAB、DCC、TNFSF12、SST mRNA在高氨1組表達上調(diào)，而在高氨2組表達下調(diào)；兩組MAPK12 mRNA表達均下調(diào)，TSC22D3、DHCR24 mRNA表達均上調(diào)。這些結(jié)果表明，隨著氯化氨處理時間的變化，肝細胞LncRNA和mRNA的表達譜也隨之發(fā)生變化。短期的氯化銨誘導(dǎo)后，肝細胞開始啟動防御機制，防止細胞凋亡；隨著誘導(dǎo)時間的延長，防御被破壞，肝細胞凋亡加??；這也與早期降氨治療肝衰竭患者預(yù)后良好相對應(yīng)。我們選出5個失調(diào)的LncRNA進行實時熒光定量PCR檢測，結(jié)果證實了芯片測序的結(jié)果。本研究結(jié)果提示LncRNA SNAR-A2、XLOC_008935、CRNDE和MAPK12、TSC22D3、DHCR24 mRNA可能在高氨誘導(dǎo)的肝細胞凋亡中起重要作用。

我們對篩選出的LncRNA及相關(guān)的mRNA進行了GO注釋和KEGG通路分析。結(jié)果顯示，在這些基因參與的多條信號通路中MAPK12和RPS6KA3這兩個基因均有異常表達，表明MAPK12和RPS6KA3可能在高氨誘導(dǎo)的肝細胞凋亡中起重要作用；氨可能通過靶向MAPK12對肝細胞造成損傷。ceRNA網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明LncRNA BAIAP3與MAPK12 mRNA關(guān)聯(lián)，提示LncRNA BAIAP3可能通過靶向MAPK12參與MAPK信號通路，從而在高氨誘導(dǎo)的肝細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，其確切機制還需要進一步探索。

本研究僅對肝細胞模型進行了分析，具有一定的局限性，肝衰竭患者血液和肝臟中的整體LncRNA和mRNA變化還需進一步的研究確定，以更準確地反映高氨誘導(dǎo)肝細胞凋亡的病理生理機制。