唐娜,鐘華,王臘梅,席冬梅,何芳

(石河子大學醫(yī)學院,新疆 石河子 832000)

高血壓是導致心血管并發(fā)癥的一種常見病、多發(fā)病,目前已成為最嚴重的公共衛(wèi)生問題,大約95%的高血壓為原發(fā)性高血壓(essential hypertension,EH)。迄今為止,EH的確切病因與發(fā)病機制仍未闡明。近年來,人們發(fā)現(xiàn)其致病因素不僅與遺傳和環(huán)境因素互作有關,還與人巨細胞病毒 (human cytomegalovirus,HCMV)感染有著密切的聯(lián)系:HCMV感染人體后可引起潛伏性感染和產毒性感染,以前者為主,而在機體抵抗力下降時可被激活,形成產毒性感染,引起明顯的臨床癥狀,與心血管病、動脈粥樣硬化、高血壓等疾病具有很大的相關性[1-3]。

HCMV是一種具有高度傳染性和流行的雙鏈DNA病毒。流行病學調查顯示全球范圍內HCMV感染率為40%～100%[4],是一種普遍感染的病原體。其膜糖蛋白有gB、gH等,結構蛋白包括pp 65、pp 150等。其中,gB擁有很強的免疫原性,在促進HCMV侵入細胞或在細胞之間傳播及感染細胞的融合中起重要作用。根據(jù)gB基因密碼子446-523區(qū)域核苷酸差異,可將HCMV分為gB1、gB2、gB3和gB4型4種亞型[5],不同種族易感gB亞型及不同疾病gB亞型分布特征不盡相同,gB基因型之間的差異可能影響其發(fā)病機制[6-7]。位于新疆地區(qū)的哈薩克族是代表新疆維吾爾自治區(qū)的主要少數(shù)民族群體之一,流行病學調查發(fā)現(xiàn),新疆哈薩克族人口的平均血壓和高血壓患病率明顯高于居住在同一地區(qū)的其他民族人口[8]。此外,我們先前的研究表明,HCMV與新疆哈薩克族EH有關[9]。因此確定gB基因型在新疆哈薩克族EH患者中的多態(tài)性及變異情況是本研究的目的。

1 資料與方法

1.1 研究對象來源

選擇2009年11月至2012年5月,在新疆天山北麓塔城地區(qū)沙灣縣多個牧區(qū)及村鎮(zhèn),14次流行病學共調查并采集隔夜空腹血(10 mL)全血樣本2 300例(離心,分離,冷凍,包裝在-80 ℃冷柜)。隨機選取哈薩克族800名(其中EH組467例,按照匹配原則抽取正常對照組333例)。抽提樣本外周血白細胞DNA并應用實時熒光定量PCR檢測外周血白細胞中HCMV-DNA。收集外周血白細胞中HCMV-DNA陽性者107例(高血壓患者70例、健康對照組37例)作為研究對象。

1.2 病例組與對照組診斷納入標準

1)病例組的選擇:按照中國高血壓防治指南。在未用抗高血壓藥的情況下,非同日測量3次,收縮壓≥140 mmHg和(或)舒張壓≥90 mmHg,可診斷為高血壓;患者既往有高血壓史,目前正在服用抗高血壓藥,血壓雖低于140/90 mmHg,也應診斷為高血壓。2)對照組納入標準:收縮壓＜140 mmHg和舒張壓＜90 mmHg,無服用降壓藥史及其它器質性心臟病史的健康人群。3)排除標準:繼發(fā)性高血壓:如原發(fā)性醛固酮增多癥、嗜鉻細胞瘤等;排除對HCMV血清學測定有影響的疾病或服用影響實驗的藥物;有器官移植病史、自身免疫功能缺陷或長期口服免疫抑制劑及HIV感染等;近4周患有急性感染或疾病以及近2周內應用抗生素及抗病毒藥物者。

1.3 提取外周血白細胞DNA

采用苯酚-氯仿法提取DNA(300 μL全血樣本),經核酸蛋白分析儀進行純度和濃度及瓊脂糖電泳鑒定檢測后于-20 ℃保存?zhèn)溆?。用于檢測HCMV-DNA。

1.4 實時熒光定量PCR診斷HCMV-DNA陽性

使用HCMV核酸定量檢測試劑盒檢測外周血HCMV-DNA(中山大學達安基因公司,中國)。使用ABI Prism 7300自動熒光PCR儀進行擴增。結果判定:1)模板最初拷貝數(shù)的對數(shù)與其循環(huán)閾值(Cycle threshold,CT)存在線性關系。2)檢測樣本CT＜30且呈典型的S型曲線時為陽性。3)檢測樣本Ct≥30為陰性。

1.5 HCMV gB基因型檢測

1.5.1 巢式PCR

應用巢式PCR擴增HCMV gB基因型[5]。引物序列如表1所示。

表1 巢式PCR引物序列

1.5.2 限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)

以巢式PCR內側擴增產物為模板,分別用限制性核酸內切酶Rsa I和Hinf I進行酶切,酶切體系為20 μL,12 h(37 ℃)。酶切產物加樣至2.5%瓊脂糖凝膠,使用電泳檢測(100 V,25 min),置凝膠成像儀中觀察結果。參照文獻[10],根據(jù)酶切片段不同鑒定和分型。gB1型305 bp:Hinf I酶切片段為:202、67,36 bp、Rsa I酶切片段為:239、66 bp;gB2型(302 bp):Hinf I酶切片段為:202,100(bp),Rsa I酶切片段為:239、63 bp;gB3型299 bp:Hinf I酶切片段為:202、97 bp,Rsa I酶切片段為:195、63、41 bp;gB4型305 bp:Hinf I酶切片段為:202、69、36 bp,Rsa I酶切片段為:195、66、44 bp。

1.5.3 HCMV gB擴增產物測序及序列分析

對巢式PCR內側擴增產物進行測序(北京博邁德基因技術有限公司)。并使用DNAMAN、Clustal X及MEGA 6軟件進行序列分析。各個型別的HCMV標準病毒株核苷酸序列下載自GenBank。

1.6 統(tǒng)計分析

采用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)分析。主要采用χ2檢驗、方差分析等。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 新疆地區(qū)哈薩克族HCMV-DNA陽性受試者一般情況

在107例陽性樣本中,HCMV-DNA陽性中EH組患者平均年齡50.7,顯著高于對照組43.1(t=4.889,P＜0.05)(表2)。HCMV-DNA陽性EH患者中男性48.6% (34/70),女性51.4%(36/70);對照組男性32.4%(12/37),女性67.6%(25/37),EH組與對照組在性別比例無統(tǒng)計學差異(χ2=2.572,P＞0.05)。HCMV-DNA陽性的EH患者占65.4%(70/107)顯著高于對照組34.6% (37/107) (χ2=10.178,P＜0.05)(表2)。

表2 HCMV-DNA陽性與陰性臨床相關指標比較

2.2 新疆地區(qū)哈薩克族HCMV gB基因型分布及構成比

哈薩克族共107例,單一gB基因型:gB2型占37.4% (40/107),在新疆哈薩克族人群中尚未發(fā)現(xiàn)gB1,gB3和gB4型。

此外,實驗中還發(fā)現(xiàn)gB混合基因型:gB1+2型和gB2+3型。gB混合基因型占62.6% (67/107),其中gB1+2基因型占47.6% (51/107),gB2+3型占15.0% (16/107)。這3種基因型:gB2型、 gB1+2和gB2+3型的構成比存在差異(χ2=17.961,P＜0.05),(表3,圖1a、b)男性共46例:gB2型占39.1% (18/46);gB1+2基因型占47.8% (22/46),gB2+3型占13.1% (6/46)。女性共61例:gB2型占36.1% (22/61):gB1+2型占47.5% (29/61);gB2+3型占16.4% (10/61)。對哈薩克族男性、女性中HCMV gB基因型的分布及構成比進行統(tǒng)計學分析,結果無統(tǒng)計學差異(χ2=0.263,P＞0.05)(表3,圖1c)。

表3 哈薩克族男性和女性HCMV gB基因型的分布及構成比

圖1 哈薩克族HCMV感染者gB基因型分布(n=107)

2.3 新疆地區(qū)哈薩克族EH患者中HCMV gB基因型分布及構成比

結果顯示,新疆哈薩克族EH患者中存在一種單一gB基因型gB2型,尚未發(fā)現(xiàn)gB1、gB3和gB4型;發(fā)現(xiàn)gB混合基因型兩種:gB1+2型,gB2+3型。其中gB2型占37.1% (26/70),gB1+2型占48.6%(34/70),gB2+3型占14.3%(10/70)。

這3種基因型:gB2型、gB1+2型和gB2+3型在EH患者中的分布及構成比有差異(χ2=12.800,P＜0.05)和圖1d;在EH男性:gB2型占47.1% (16/34),gB1+2型占47.1% (16/34),gB2+3型占5.8%(2/34)。在EH女性中:gB2型占27.8% (10/36),gB1+2型占50.0% (18/36),gB2+3型占22.2%(8/36)。EH男性、女性中各HCMV gB基因型的分布及構成比統(tǒng)計學分析不存在差異(χ2=5.049,P＞0.05)(表4、圖1e)。

表4 哈薩克族EH患者中男性和女性HCMV gB基因型的分布及構成比

2.4 HCMV gB擴增產物測序及序列分析

對107份陽性樣本命名:XJKZ-1到XJKZ-107,從107份HCMV gB擴增產物中按照相同構成比對64份擴增產物進行測序,包括單一gB基因型23例,混合gB基因型41例。由于混合gB基因型Genbank中沒有相對應的標準株,因此序列分析時均以單一gB基因型(gB2)作為研究對象。各單一基因型:gB2型陽性樣本的測序結果及核苷酸序列見圖2。

圖2 gB2基因序列比較(n=23)

2.5 各單一gB基因核苷酸以及氨基酸突變位點

使用MEGA 6.0軟件中的ClustalW將實驗得到的23例樣本的gB片段與GenBank中的標準病毒株(gB2:M60932)進行多序列比對,結果如圖2a所示。其中核苷酸變異位點主要集中在1389-1450位,變異較多的XJKZ-19、XJKZ-48、XJKZ-58、XJKZ-62、XJKZ-65在該區(qū)段的變異率分別是:8.2%,4.9%,8.2%,1.6%,11.5%。氨基酸位點的主要變異集中在513-574位如圖2b所示。整個區(qū)段的前段變異較多,而后半部分的保守性很高,應該在gB蛋白發(fā)揮功能的過程中發(fā)揮重要作用,可能是gB蛋白的重要結構域。其中XJKZ-19、XJKZ-48、XJKZ-58、XJKZ-62、XJKZ-65在該區(qū)段的變異位點(變異率)分別是:5(8.2%),3(4.9%),8(13.1%),3(4.9%),6(9.8%)。其中515位上有兩個陽性病毒株由天冬氨酸→谷氨酸,467位上4個陽性株由蘇氨酸→丙氨酸,479位上有3個陽性病毒株由纈氨酸→甘氨酸,520位上3個陽性病毒株由絲氨酸→異亮氨酸,值得注意的是,在473位上有三個陽性株發(fā)生終止密碼子變異。

2.6 各單一gB基因片段與不同型別的標準病毒株的系統(tǒng)發(fā)育分析

對四個不同型別的標準病毒株[M60927(gB1),M60932(gB2),M60933(gB3),M60924(gB4)]和本研究擴展得到的基因片段使用MEGA6.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析,其結果如圖3所示。圖中我們可以看出,23個病毒株均與gB2標準病毒株的親緣關系較近,而與gB1,gB3,gB4等3個標準病毒株親緣關系較遠,并未在同一分支上發(fā)生聚集。這一結果也與我們前面基因型鑒定實驗得到的結果相一致。同時結果顯示,XJKZ-19、XJKZ-48、XJKZ-58、XJKZ-62、XJKZ-65雖然與gB2親緣關系較近,但是并未與標準菌株在同一分支上發(fā)生聚集,說明這5個病毒株的變異可能對病毒的功能產生影響。

圖3 HCMV基因組gB段的系統(tǒng)進化樹分析(n=23)

3 討論

本次研究首次針對新疆哈薩克族高血壓患者人群HCMV感染的易感基因型及變異進行分析。實驗發(fā)現(xiàn)在新疆哈薩克族高血壓人群中混合基因型gB1+2與單一gB 基因型gB2為易感基因型。我們發(fā)現(xiàn)哈薩克族群體中單一基因型gB2型序列存在差異:核苷酸突變率為8.2%～11.5%、氨基酸突變率為4.9%～13.1%。本研究通過分析哈薩克族人群以及EH患者感染gB基因型的分布特點,為闡明新疆地區(qū)哈薩克族及EH患者HCMV感染流行株的分子流行病學特征提供了線索。

大量文獻證明,gB基因型多態(tài)性在HCMV感染中普遍存在。一項關于113名健康HCMV陽性的非裔美國婦女的流行病學調查中,發(fā)現(xiàn)該人群中存在單一和混合的gB基因型感染,gB2型是最常見的,其次是gB4型[10]。MADHAVAN等人[11]發(fā)現(xiàn)兒童HCMV感染主要以gB2為主。在美國青少年HCMV感染中易感基因型為gB1為主[7]。在亞洲地區(qū),泰國人混合基因型為gB2+3多見,常見單一基因型為gB1[6],而本實驗發(fā)現(xiàn)同為亞洲人,新疆哈薩克民族多見混合基因型為gB1+2,其次為單一基因型gB2型。這表明HCMV基因型分布受地域環(huán)境和種族的影響。許多研究表明,HCMV gB混合基因型最常見的組合是gB2+3或gB1+3型[12-13]。這可能是由于不同HCMV gB基因型的再感染和/或由于潛在HCMV感染的再激活是上述人群中的常見特征。從而導致重組和形成新的HCMV變異體的機會增加[14]。

鑒于gB在病毒-宿主相互作用中的重要作用,多項研究表明,HCMV gB基因型在不同疾病的人群:同種異體移植受者、慢性牙周炎患者和先天性感染嬰兒中也存在多樣性[15-17]:在移植患者中,gB1型是最常見的基因型。慢性牙周炎患者中,gB2型是最常見的基因型。先天性感染HCMV基因型的報道在不同地區(qū)和國家分布不同:gB1型在匈牙利南部的先天性感染中占主導地位[11],而印度則以gB2和gB3型為主[6]。而我們的研究顯示在新疆哈薩克族人群及EH患者中HCMV感染的易感基因為混合基因型gB1+2型,其次為單一基因型gB2。這種差異可能是由于病毒株地理分布的差異,或由于種族和疾病譜的差異導致的。

為了確定HCMV gB是否含有多態(tài)性,特別是基因型內變異,我們對23個單一基因型:gB2基因型中進行DNA測序。gB2型內HCMV株之間的序列同源性為88.5%～100%,這與以往關于每個基因型內臨床菌株同源性為98.6%～99.9%的報道不同[5]。同時我們發(fā)現(xiàn)有5個gB2基因型變異樣本(XJKZ-19、48、58、62、65)在核苷酸其樣本變異率高達11.5%,氨基酸變異率高達13.1%,值得注意的是,在473位上有3個陽性株發(fā)生終止密碼子變異,將對整個蛋白的功能產生較大的影響。在系統(tǒng)發(fā)育樹中,我們還發(fā)現(xiàn)這些樣本中核苷酸變異的百分比超過1%,表明再次感染是誘導基因型內變異的常見機制。在我們的研究中,所有的基因型內變異都發(fā)現(xiàn)在5個EH患者樣本中。眾所周知,HCMV的重新激活可能隨時發(fā)生,特別是在免疫功能低下的宿主,如EH患者,可能導致核苷酸變異增加。由于gB在誘導中和抗體中起著重要作用,gB分子的構象變化可能是逃避免疫反應的機制之一。因此,本研究EH患者的基因型內變異可能是由與其他病毒相似的宿主免疫的陽性選擇引起的[[18-19]。

總之,本研究明確了新疆地區(qū)哈薩克族人群及高血壓患者HCMV流行株gB基因型的分布,我們發(fā)現(xiàn)新疆哈薩克族人群及高血壓患者中易感基因型為gB1+2和gB2型。同時新疆哈薩克族人群中單一基因型:gB2型在核酸及氨基酸存在變異?；谀壳拔墨I報道HCMV感染與高血壓的密切關系,無疑本研究結論將為進一步闡明HCMV在高血壓發(fā)病中作用和機制提供重要理論基礎,并為其防治提供新靶標。