許珂,郭佳,葛明月,殷姜文,殷潔婷,張晗,李燕*

(1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院,新疆 石河子 832002;2 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,新疆 石河子 832002)

圍術(shù)期神經(jīng)認(rèn)知障礙(Perioperative neurocognitive disorders,PND)的發(fā)病機(jī)制是多種因素的協(xié)同作用,迄今為止,確切機(jī)制尚不明確[1]。有研究報(bào)道,α-synuclein(α-syn)、β-Amyloid1-42(Aβ1-42)的過(guò)度表達(dá)可抑制多巴胺能神經(jīng)元神經(jīng)遞質(zhì)釋放,這可能是術(shù)后3個(gè)月內(nèi)PND的預(yù)測(cè)因素[2],并且選擇性使中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(Ventral tegmental area,VTA)多巴胺神經(jīng)元變性可導(dǎo)致海馬多巴胺流出量降低[3-4]。而多巴胺(Dopamine,DA)的細(xì)胞外濃度主要依靠多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Dopamine transporter,DAT)進(jìn)行調(diào)控[5],因此本研究旨在觀察中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(DAT)的變化對(duì)老年大鼠術(shù)后認(rèn)知功能的影響,并初步探討VTA區(qū)DAT變化對(duì)老年大鼠術(shù)后認(rèn)知功能的影響是否與調(diào)控海馬區(qū)α-syn、Aβ1-42蛋白聚集有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雄性,清潔級(jí)SD(Sprague Dawley)大鼠50只,18～20月齡,體質(zhì)量300～500 g(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)。飼養(yǎng)環(huán)境:大鼠自由活動(dòng)、攝食、飲水,室溫21～23 ℃,相對(duì)濕度為45～55%。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組,每組10只:空白組(Normal,N)、假手術(shù)組(sham,S)、PND模型組(PND,P)、AAV·DAT·RNAi(AAV)、AAV·NC(NC)。

1.2 老年大鼠PND模型建立

各組大鼠術(shù)前禁食12 h,自由飲水至術(shù)前2 h。P組大鼠尾靜脈注射丙泊酚20 mg·kg-1誘導(dǎo)待翻正反射消失后,調(diào)整為11 mg·kg-1·h-1持續(xù)輸注。腹部備皮,仰臥位固定于大鼠恒溫手術(shù)臺(tái),手術(shù)切口處使用碘伏消毒三次,鋪無(wú)菌洞巾。定位左肋緣下,于上腹部行縱切口約2 cm,逐層進(jìn)入腹腔游離脾臟,用絲線結(jié)扎脾動(dòng)、靜脈兩次,完整摘除脾臟。檢查無(wú)出血及滲血后切口用絲線按腹膜,肌肉,皮膚逐層縫合后停止丙泊酚輸注,術(shù)畢給予5 mg·kg-1酮洛芬皮下注射。S組僅輸注丙泊酚,不行脾切除手術(shù)。為了保證實(shí)驗(yàn)條件的一致性,所有手術(shù)均由同一操作者在20 min內(nèi)完成。術(shù)畢待大鼠翻正反射恢復(fù)后各自放回籠飼養(yǎng)。

1.3 VTA區(qū)AAV·DAT·RNAi立體定位注射

構(gòu)建slc6a3基因敲低DAT的腺相關(guān)病毒,AAV組、NC組大鼠在大鼠面罩吸入異氟醚麻醉下通過(guò)耳桿和齒栓將大鼠頭部固定于腦立體定位儀上,用變溫毯維持大鼠核心體溫于37 ℃～38 ℃范圍內(nèi)。根據(jù)《大鼠腦圖譜》的VTA坐標(biāo):AP ±5.8～6.0 mm,L/R 0.5～1 mm,H 6.5～7.5 mm定位VTA核團(tuán)。使用牙科鉆在大鼠顱骨表面鉆孔,注意勿傷及大腦皮層。用干凈棉球清除顱骨表面的骨屑,以及孔內(nèi)溢出的腦脊液、血液,持細(xì)針在外科顯微鏡直視下輕輕挑破腦膜后,利用微量注射針在VTA核團(tuán)以1 μL·min-1的速度注入AAV·DAT·RNAi/AAV·NC,注射完畢后停留10 min,待藥物完全擴(kuò)散并防止藥物溢出,再緩慢移除注射針,縫皮。術(shù)畢連續(xù)3 d肌肉注射青霉素20U預(yù)防感染。

待其從麻醉狀態(tài)下安全蘇醒,放入單獨(dú)鼠籠內(nèi)飼養(yǎng)并恢復(fù)14 d后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 行為學(xué)評(píng)價(jià)

1.4.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

術(shù)前5 d,每天將各組大鼠隨機(jī)從2個(gè)不同象限放入池中2次,記錄大鼠在池中找到隱藏平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期,latency),使大鼠對(duì)隱藏平臺(tái)的位置形成空間記憶。在第6 d,進(jìn)行大鼠脾切除手術(shù)。術(shù)后第3 d分別測(cè)試大鼠對(duì)原平臺(tái)的記憶能力即空間探索實(shí)驗(yàn)。測(cè)試時(shí)將原有平臺(tái)撤除,將大鼠由原平臺(tái)象限的對(duì)側(cè)放入水中。大鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間,穿過(guò)原平臺(tái)位置的次數(shù)以及逃避潛伏期作為本實(shí)驗(yàn)參考記憶的主要檢測(cè)指標(biāo)。

1.4.2 條件恐懼實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物在恐懼條件下,全身除呼吸運(yùn)動(dòng)外其他運(yùn)動(dòng)全部停止的狀態(tài),記為凝滯狀態(tài)(Freezing)。

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,將凝滯時(shí)間與測(cè)試總時(shí)間百分比(即凝滯時(shí)間百分比,Freezing%)作為觀察指標(biāo),衡量大鼠的恐懼記憶能力。術(shù)前1 d,將各組大鼠放入實(shí)驗(yàn)箱中適應(yīng)60 s,然后給予一個(gè)持續(xù)30 s,90 dB的聲音,聲音結(jié)束前的最后2 s給予2 s,0.85 mA的足底電擊,每組刺激間隔時(shí)間60 s?？傆?xùn)練時(shí)間330 s,共給予大鼠三組聲音和電擊組成的成對(duì)刺激。大鼠在實(shí)驗(yàn)箱休息60 s后取出,放回飼養(yǎng)籠內(nèi)。術(shù)后3 d將各組大鼠置于與訓(xùn)練階段相同的場(chǎng)景中,不給予聲音和電擊,觀察并記錄330 s內(nèi)大鼠Freezing%,即為場(chǎng)景恐懼記憶測(cè)試(contextual test)。

1.5 DAT、α-syn、Aβ1-42蛋白免疫熒光

各組大鼠在體實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,用4%多聚甲醛固定液經(jīng)心臟實(shí)施灌注取腦,制備石蠟切片。取含VTA核團(tuán)和海馬的腦片用65 ℃烤箱烤片3 h后進(jìn)行脫蠟,隨后置于枸櫞酸修復(fù)液中以低、中、高溫分別修復(fù)4 min。PBS震蕩清洗5 min×3次,3%Triton X-100破膜30 min后用5%BSA封閉1 h。分別滴加DAT、α-syn和Aβ1-42一抗4 ℃孵育過(guò)夜。PBS洗滌后,分別滴加相應(yīng)的熒光二抗,濕盒避光室溫孵育2 h,PBS洗滌完成后在暗室中用0.5 μg·mL-1的PI溶液染細(xì)胞核15 min,封片后在顯微鏡下觀察。每張切片在200×視野下隨機(jī)選3個(gè)不同視野進(jìn)行采圖。用ImageJ圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行熒光強(qiáng)度測(cè)定。

1.6 Western-Blot檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)量

各組大鼠在深麻醉下快速斷頭取腦,分離出海馬組織。用冰凍RIPA裂解液裂解蛋白質(zhì),進(jìn)行海馬組織α-syn和Aβ1-42蛋白提取。聚丙烯酰胺凝聚電泳,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜,5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h,一抗孵育后熒光素結(jié)合的二抗孵育,Bio-Rad成像儀成像,Image Lab軟件分析條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±S)表示。組間比較采用單因素方差分析,非正態(tài)分布計(jì)量資料采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VTA區(qū)立體定位腦內(nèi)注射AAV·DAT·RNAi結(jié)果

2.1.1 病毒轉(zhuǎn)染

VTA區(qū)AAV·DAT·RNAi病毒轉(zhuǎn)染成功,顯示紅色熒光(mcCherry)見(jiàn)圖1。

圖1 VTA區(qū)多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白病毒轉(zhuǎn)染情況

2.1.2 蛋白免疫熒光

VTA區(qū)病毒轉(zhuǎn)染后多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白免疫熒光見(jiàn)圖2。

圖2 VTA區(qū)N組與AAV組多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白免疫熒光

2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

定位航行訓(xùn)練重復(fù)測(cè)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,術(shù)前5天各組大鼠泳速度及對(duì)固定平臺(tái)的學(xué)習(xí)記憶能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,各組大鼠游泳速度無(wú)顯著差異P＞0.05(圖4A),提示手術(shù)創(chuàng)傷和藥物注射均未對(duì)大鼠的運(yùn)動(dòng)能力造成明顯影響?？臻g探索實(shí)驗(yàn)參考記憶檢測(cè)結(jié)果顯示,與模型組比較,VTA區(qū)多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白敲低改善了丙泊酚麻醉手術(shù)后3 d穿臺(tái)次數(shù)的減少P＜0.05(圖4B),與模型組比較,VTA區(qū)多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白敲低大鼠術(shù)后3 d在目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯延長(zhǎng)P＜0.05(圖4C)。與模型組相比,VTA區(qū)多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白敲低大鼠術(shù)后3 d逃避潛伏期明顯縮短P＜0.05(圖4D)。

圖3 Morris水迷宮定位巡航訓(xùn)練軌跡圖

圖4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

2.3 條件恐懼實(shí)驗(yàn)

條件恐懼訓(xùn)練結(jié)果顯示,各組大鼠學(xué)習(xí)探索能力基本一致,大鼠凝滯時(shí)間百分比差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。場(chǎng)景恐懼記憶檢測(cè)結(jié)果顯示,與N組相比,P組術(shù)后3 d大鼠的凝滯時(shí)間百分比明顯降低P＜0.05;與P組相比,AAV組明顯改善了大鼠術(shù)后3 d場(chǎng)景恐懼記憶損害P＜0.05(圖5)。

圖5 各組大鼠場(chǎng)景恐懼記憶損害凝滯時(shí)間百分比

2.4 海馬α-syn的免疫熒光結(jié)果

免疫熒光結(jié)果顯示α-syn集中表達(dá)在海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元胞漿中,與N組比較,P組術(shù)后3 d海馬α-syn蛋白含量明顯升高P＜0.05(圖6),表明丙泊酚全麻脾切除手術(shù)使老年大鼠海馬CA1區(qū)α-syn蛋白聚集增多;與P組相比,AAV組海馬α-syn蛋白含量明顯降低P＜0.05(圖6),表明特異性的敲低VTA區(qū)DAT可以使海馬CA1區(qū)α-syn蛋白較術(shù)后聚集減少。

圖6 海馬區(qū)α-syn蛋白免疫熒光

2.5 海馬Aβ1-42的免疫熒光結(jié)果

與N組相比,P組術(shù)后3 dAβ1-42蛋白含量明顯升高P＜0.05(圖7),表明丙泊酚全麻脾切除手術(shù)使老年大鼠海馬CA1區(qū)Aβ1-42蛋白聚集增多;與P組相比,AAV組Aβ1-42蛋白含量明顯降低P＜0.05(圖7),表明特異性的敲低VTA區(qū)DAT可以使海馬CA1區(qū)Aβ1-42蛋白較術(shù)后聚集減少。

圖7 海馬區(qū)Aβ1-42蛋白免疫熒光

2.6 海馬α-syn、Aβ1-42的蛋白含量

與N組相比,P組α-syn含量明顯升高P＜0.05(圖8A),與P組相比,AAV組α-syn含量明顯降低P＜0.05(圖8A);與N組相比,P組Aβ1-42含量明顯升高P＜0.05(圖8B),與P組相比,AAV組Aβ1-42含量明顯降低P＜0.05(圖8B)。

圖8 海馬區(qū)α-syn、Aβ1-42蛋白含量的比較

3 討論

圍術(shù)期神經(jīng)認(rèn)知障礙(PND)多發(fā)生于接受大手術(shù)或急診手術(shù)的患者,被認(rèn)為是麻醉手術(shù)等外界因素誘發(fā)了疾病,同時(shí)多因素相互影響,相互作用,是老年人術(shù)后常見(jiàn)并發(fā)癥之一[6-7]。PND主要是指患者在手術(shù)前后出現(xiàn)的海馬依賴性認(rèn)知功能的下降,包括記憶,意識(shí)和注意力障礙,以及人格的改變[8]。越來(lái)越多的證據(jù)表明,PND的發(fā)生在早期階段涉及海馬的神經(jīng)元損傷[9],目前還不清楚是如何通過(guò)調(diào)控海馬區(qū)的神經(jīng)遞質(zhì)而導(dǎo)致認(rèn)知能力的下降。

大腦中多巴胺通路是目前研究證明參與認(rèn)知功能機(jī)制的通路之一。研究[10]表明,腦內(nèi)重要神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺(DA)在調(diào)控情緒、覺(jué)醒、運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知、學(xué)習(xí)記憶、獎(jiǎng)賞等行為方面具有至關(guān)重要的作用。DA作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)與學(xué)習(xí)記憶及認(rèn)知過(guò)程相關(guān)的重要神經(jīng)遞質(zhì),主要分布于中腦的黑質(zhì)致密區(qū)(SNc)和腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)[11]。Ventre等[12]在使用多巴胺替代治療和使用深部腦刺激治療的帕金森病人中研究發(fā)現(xiàn),DA具有促進(jìn)記憶保持的作用,場(chǎng)景記憶需要DA參與,阻斷DA能神經(jīng)元的突觸傳遞能夠抑制視覺(jué)空間刺激引起學(xué)習(xí)記憶形成的過(guò)程。神經(jīng)系統(tǒng)中在空間和時(shí)間上多巴胺水平的維持主要依靠多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(DAT)。DAT能控制多巴胺的細(xì)胞外濃度,起到維持多巴胺平衡和調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)信號(hào)強(qiáng)度的作用,DAT的數(shù)量越多,突觸前膜重?cái)z取多巴胺的能力越強(qiáng)。DAT功能異常會(huì)引起多巴胺系統(tǒng)的平衡紊亂,進(jìn)而引起相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)的疾病,例如,抑郁、注意力缺陷多動(dòng)癥、認(rèn)知功能障礙等?；A(chǔ)和臨床的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明,應(yīng)用轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑減少神經(jīng)遞質(zhì)的再攝取來(lái)增加中樞突觸間隙內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)含量對(duì)于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病有效[13]。并且在以中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病為特質(zhì)的老年認(rèn)知功能下降如:阿爾茲海默病、帕金森病等的研究中發(fā)現(xiàn),這些疾病是以α-syn、Aβ1-42異常聚集發(fā)生協(xié)同作用加重突觸損害為病理特點(diǎn),對(duì)中樞神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生毒性,最終發(fā)展為認(rèn)知功能障礙,使用Aβ1-42寡聚體孵育海馬神經(jīng)元,也可導(dǎo)致神經(jīng)元樹(shù)突棘形態(tài)改變,密度下降[14]。因此,Aβ1-42和α-syn的異常聚集成為認(rèn)知障礙的關(guān)鍵因素。而通過(guò)抑制患者腦內(nèi)α-syn 寡聚體的形成,減輕其與Aβ1-42 寡聚體的協(xié)同作用從而減輕術(shù)后認(rèn)知功能障礙發(fā)生的研究目前還未涉及。

在本研究中利用行為學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察丙泊酚麻醉脾切除手術(shù)對(duì)老年大鼠手術(shù)后認(rèn)知功能的影響,建立了老年大鼠PND模型,在此基礎(chǔ)上,我們發(fā)現(xiàn)通過(guò)敲低VTA區(qū)多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,進(jìn)而抑制海馬區(qū)αsyn、Aβ1-42寡聚體的形成,可以改善老年大鼠的認(rèn)知功能障礙,這表明海馬區(qū)α-syn、Aβ1-42寡聚體的形成可能與VTA區(qū)DAT相關(guān),通過(guò)改變DAT能夠影響老年大鼠的認(rèn)知功能。

本研究通過(guò)一個(gè)PND動(dòng)物模型探討海馬區(qū)αsyn、Aβ1-42寡聚體的形成是否參與了手術(shù)誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙。得到結(jié)果顯示,在行為學(xué)測(cè)試中利用評(píng)價(jià)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的經(jīng)典Morris水迷宮實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)在術(shù)前訓(xùn)練階段各組大鼠逃避潛伏期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明術(shù)前各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力無(wú)組間差異,而在丙泊酚全身麻醉下行脾切除手術(shù)的老年大鼠,逃避潛伏期明顯延長(zhǎng),在空間探索實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出記憶能力顯著下降,這提示術(shù)后3 d老年大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力受到了損害,通過(guò)敲低VTA區(qū)多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白后與模型組相比,逃避潛伏期顯著縮短,提示多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與了老年大鼠認(rèn)知功能障礙。條件恐懼實(shí)驗(yàn)通過(guò)凝滯時(shí)間百分比評(píng)估大鼠情緒學(xué)習(xí)記憶(恐懼記憶)的形成能力。本研究結(jié)果顯示,與空白組相比,模型組術(shù)后3 d的場(chǎng)景相關(guān)凝滯時(shí)間百分比顯著降低,提示丙泊酚全麻脾切除手術(shù)對(duì)老年大鼠的恐懼記憶產(chǎn)生了影響,而通過(guò)敲低VTA區(qū)多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以改善這一損害。通過(guò)免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn),與空白組相比,術(shù)后大鼠海馬CA1區(qū)α-syn、Aβ1-42陽(yáng)性細(xì)胞熒光強(qiáng)度均明顯增高,而多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白敲低組與手術(shù)組相比,海馬CA1區(qū)α-syn、Aβ1-42陽(yáng)性細(xì)胞熒光強(qiáng)度均表現(xiàn)出明顯的降低,進(jìn)一步說(shuō)明,我們使用AAV·DAT·RNAi特異性的敲低VTA區(qū)多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白后能有效的減輕手術(shù)引起的認(rèn)知功能障礙,并且手術(shù)引起的認(rèn)知功能障礙與海馬區(qū)α-syn、Aβ1-42寡聚體的形成有一定的關(guān)系。利用Western-Blot檢測(cè)海馬α-syn、Aβ1-42的蛋白含量示術(shù)后海馬區(qū)α-syn、Aβ1-42蛋白含量較術(shù)前顯著增多,而敲低VTA區(qū)多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白后,α-syn、Aβ1-42蛋白含量表現(xiàn)出明顯的下降,這就表明VTA區(qū)DAT變化對(duì)老年大鼠術(shù)后認(rèn)知功能的影響與調(diào)控海馬區(qū)αsyn、Aβ1-42蛋白聚集相關(guān)。

綜上所述,VTA區(qū)多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與了老年大鼠丙泊酚全身麻醉脾切除手術(shù)后認(rèn)知功能障礙,并且VTA區(qū)DAT變化對(duì)老年大鼠術(shù)后認(rèn)知功能的影響可能與調(diào)控海馬區(qū)α-syn、Aβ1-42蛋白聚集有關(guān),進(jìn)一步闡明多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)變化與α-syn、Aβ1-42蛋白聚集的關(guān)系,為尋找臨床實(shí)用型治療術(shù)后認(rèn)知功能障礙提供重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論佐證。