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        三七總皂苷對(duì)腦缺血再灌注大鼠TLR4/NF-κB信號(hào)通路及炎性細(xì)胞因子的影響*

        2021-09-07 10:55:10周玉嘉張?jiān)蕩X馬青科金香蘭張志辰
        中國(guó)中醫(yī)急癥 2021年8期
        關(guān)鍵詞:膠質(zhì)腦組織細(xì)胞因子

        周玉嘉 張?jiān)蕩X 周 晶 田 沫 馬青科 金香蘭 張志辰△

        (1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院,北京 100078;2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院,北京 100191;3.北京第一中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,北京 100026)

        根據(jù)《全球疾病負(fù)擔(dān)研究》報(bào)告,中風(fēng)已成為第2大死亡原因,也是全球殘疾調(diào)整生命年的第3大原因[1]。近年來(lái),缺血性卒中的臨床治療手段越來(lái)越多樣化,大量研究表明,血管再通是治療缺血性腦卒中的最有效手段。中風(fēng)后的腦損傷是由于流向大腦的血液中斷以及受損區(qū)域缺氧引起的[2]。然而,對(duì)于發(fā)生血栓后的組織來(lái)說(shuō)血供的重建會(huì)提高損傷的程度,即缺血再灌注損傷(I/RI)[3]。炎癥是I/RI的主要機(jī)制之一[4],神經(jīng)缺血缺氧后可激活Toll樣受體4(TLR4),激活核因子-κB(NF-κB),被激活的NF-κB可以促進(jìn)多種促炎性細(xì)胞因子合成,促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞釋放促炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α),減少抑炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)等釋放,擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。因此,靶向抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路,可降低腦組織促炎性細(xì)胞因子的表達(dá),改善組織炎性損傷。

        三七總皂苷是三七提取物,臨床上廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病?;A(chǔ)研究發(fā)現(xiàn),三七總皂苷可以改善大鼠腦、心、腎等臟器I/RI損傷[5-8]。目前研究認(rèn)為,三七總皂苷對(duì)腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制涉及其對(duì)自由基及脂質(zhì)過(guò)氧化物、細(xì)胞凋亡、鈣通道、神經(jīng)元損傷、相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)等[6]。本研究旨在從TLR4/NF-κB信號(hào)通路及炎癥因子角度,探討三七總皂苷對(duì)腦缺血/再灌注大鼠腦組織的保護(hù)作用機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性Wistar大鼠45只,體質(zhì)量(275±25)g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,使用許可證編號(hào):SYXK(京)2019-0013。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院動(dòng)物中心,飼養(yǎng)級(jí)別為SPF級(jí),5只/籠,保證正常光照節(jié)律、溫度適度、環(huán)境安靜,正常大鼠生長(zhǎng)繁殖飼料飼養(yǎng),自由進(jìn)食和飲水。本研究通過(guò)北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審批(批號(hào):2019072)。

        1.2 試藥與儀器 三七總皂苷(廣西梧州制藥有限公司,生產(chǎn)批號(hào):19060106)。大鼠線栓(廣州佳靈生物科技有限公司,規(guī)格:L3600);大鼠IL-1β ELISA試劑盒(Abcam,ab100768);大鼠TNF-α ELISA試劑盒(Abcam,ab100785);大鼠IL-4 ELISA試劑盒(Abcam,ab100771);大 鼠 IL-10 ELISA 試 劑 盒(Abcam,ab100765);Anti-TLR4抗體(Abcam,ab217274);Anti-NF-κB p65抗體(Abcam,ab16502)。顯微鏡(Leica公司,型號(hào)DM3000);酶標(biāo)分析儀(無(wú)錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司,DR-200BS);高級(jí)凝膠成像系統(tǒng)(基因有限公司,G:BOX F3)。

        1.3 分組與造模 所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、中藥組各15只。模型組及中藥組建立I/RI模型。造模方法:10%水合氯醛(0.35 g/kg)麻醉大鼠,麻醉成功之后,大鼠固定于操作臺(tái),頸部正中切口,游離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈,頸外動(dòng)脈及結(jié)扎,夾閉頸總動(dòng)脈,在大鼠做一V型切口,插入線栓并緩慢向前推進(jìn),直至插入大腦中動(dòng)脈,輕遇阻力即停止。栓塞2 h后,緩慢拔出線栓,逐層縫合大鼠傷口。假手術(shù)組不插入線栓外,其余操作與模型組及中藥組相同。造模24 h后評(píng)估模型成果,成功標(biāo)志:Longa神經(jīng)功能分級(jí)評(píng)分≥2分的大鼠為模型制備成功。剔除各組造模不成功大鼠及死亡大鼠,最終假手術(shù)組14只,模型組12只,中藥組13只。

        1.4 給藥方法 中藥組大鼠尾靜脈注射三七總皂苷50 mg/kg(給藥劑量參考文獻(xiàn)[7]),模型組及假手術(shù)組給予等量0.9%氯化鈉注射液尾靜脈注射。各組給藥均每日1次,連續(xù)3 d。

        1.5 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 給藥3 d后,對(duì)所有大鼠進(jìn)行Garcia評(píng)分[8],從大鼠自主運(yùn)動(dòng)、體態(tài)對(duì)稱性、前肢伸展功能、攀爬運(yùn)動(dòng)、身體雙側(cè)觸覺(jué)、雙側(cè)胡須碰觸反應(yīng)等6個(gè)方面評(píng)估大鼠神經(jīng)功能損傷的程度。分值為3~18分,數(shù)值越大,神經(jīng)功能損傷越輕,18分為正常。

        1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1)大鼠腦組織HE染色。各組大鼠完成神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分后,每組隨機(jī)取3只大鼠麻醉,4%多聚甲醛灌注固定,留取腦組織制作5 μm的冠狀石蠟切片。切片脫蠟、復(fù)水后進(jìn)行HE染色,在普通光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠腦組織形態(tài)變化。2)大鼠腦組織氯化三苯基四氮唑(TTC)染色。每組隨機(jī)取3只大鼠麻醉,生理鹽水心臟灌注,留取干凈腦組織迅速放入-20℃冰箱里冷凍,20 min后取出,冠狀位切5~6片,每片厚約2 mm。切好的腦組織用2%TTC染色液37℃孵育染色30 min,沖掉多余染色液,4%多聚甲醛固定,24 h后拍照,計(jì)算腦梗死面積。3)大鼠腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10水平檢測(cè)。各組剩余大鼠麻醉后迅速留取腦組織,-80℃保存用于細(xì)胞因子檢測(cè)及蛋白免疫印跡法(Wester blotting)檢測(cè)。取大鼠新鮮腦組織50 mg,在預(yù)冷PBS(0.01 mol/L,pH=7.0~7.2)中清洗去除血液,將組織切成小塊,均勻地放入放置在冰上勻漿,勻漿液4℃低溫冷凍離心機(jī)10 000 r/min離心5 min,留取上清液用于檢測(cè)。分別用IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10 ELISA試劑盒檢測(cè)各個(gè)大鼠腦組織細(xì)胞因子含量,具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。4)各組大鼠腦組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)檢測(cè)。取30 mg大鼠腦組織剪碎,加入適量含磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液,置于冰上研磨,4℃低溫冷凍離心機(jī)10 000 r/min離心5 min,取上層清液為蛋白提取液,用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。調(diào)整各樣本為統(tǒng)一濃度,金屬浴使蛋白變性。配備SDS-PAGE凝膠電泳,恒流轉(zhuǎn)膜1.5 h,用5%脫脂奶粉封閉,于室溫?fù)u床封閉1.5 h,分別加入一抗(兔抗TLR4抗體1∶300;兔抗NF-κB p65抗體1∶2 000),4 ℃過(guò)夜孵育,洗膜后加入二抗(山羊抗兔IgG HRP,1∶10000),室溫?fù)u床孵育70 min,洗膜后加入超敏ECL發(fā)光液顯色,于凝膠圖像成像分析系統(tǒng)曝光5~30 s,Image J軟件計(jì)算條帶灰度值。

        1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布,以(±s)表示,符合方差齊性,兩組對(duì)比采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較 見(jiàn)表1。模型組及中藥組大鼠表現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺失癥狀,如左側(cè)偏癱,行走時(shí)左側(cè)轉(zhuǎn)圈,運(yùn)動(dòng)減少,左前爪不能完全伸展等。對(duì)各組大鼠進(jìn)行Garcia評(píng)分,與假手術(shù)組相比,模型組大鼠Garcia評(píng)分顯著降低(P<0.01),與模型組相比,中藥組大鼠Garcia評(píng)分升高(P<0.05)。

        表1 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較(分,±s)

        表1 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較(分,±s)

        注:與假手術(shù)組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01。下同。

        組別假手術(shù)組模型組中藥組n 14 12 13 Garcia評(píng)分17.31±0.23 6.28±2.49**8.53±1.72△

        2.2 各組大鼠缺血半暗帶組織形態(tài)學(xué)變化 見(jiàn)圖1。假手術(shù)組大鼠神經(jīng)元胞體及軸突排列整齊,細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞核清晰可見(jiàn);模型組大鼠神經(jīng)細(xì)胞可見(jiàn)壞死,細(xì)胞排列混亂,神經(jīng)元結(jié)構(gòu)不完整;中藥組大鼠與模型組大鼠相比神經(jīng)元凋亡情況顯著改善。

        圖1 各組大鼠腦組織病理觀察(HE染色,400倍)

        2.3 各組大鼠腦梗死面積比較 見(jiàn)表2,圖2。通過(guò)Image Pro Plus軟件分析各個(gè)層面白色梗死區(qū)域的所占面積,取平均值代表大鼠梗死面積百分比。與模型組相比,中藥組大鼠腦組織梗死面積顯著降低(P<0.05)。

        表2 各組大鼠大腦梗死面積比較(%,±s)

        表2 各組大鼠大腦梗死面積比較(%,±s)

        組別假手術(shù)組模型組中藥組n 3 3 3腦梗死面積0 46.79±17.46 27.53±11.32△

        圖2 大鼠腦組織梗死情況(TTC染色)

        2.4 各組大鼠腦組織炎癥因子水平比較 見(jiàn)表3。與假手術(shù)組相比,模型組大鼠促炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α水平顯著增高(P<0.01),抑炎型細(xì)胞因子IL-4、IL-10水平降低(P<0.01);與模型組相比,中藥組促炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α水平顯著降低(P<0.01),抑炎型細(xì)胞因子IL-4、IL-10水平顯著增加(P<0.05或P<0.01)。

        表3 各組大鼠腦組織炎癥因子水平比較(pg/mL,±s)

        表3 各組大鼠腦組織炎癥因子水平比較(pg/mL,±s)

        組別假手術(shù)組模型組中藥組n 8 6 7 IL-1β 16.03±2.28 39.46±5.25**27.13±4.51△△TNF-α 37.24±0.28 59.11±1.45**53.40 ±0.75△△IL-4 28.21±9.83 14.00±7.66**19.50±7.81△IL-10 12.93±3.02 7.99±2.45**11.75±2.39△△

        2.5 各組大鼠腦組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平比較 見(jiàn)表4,圖3。與假手術(shù)組相比,模型組大鼠TLR4、NF-κB p65表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.01);與模型組相比,中藥組大鼠TLR4表達(dá)下調(diào)(P<0.05),NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)。

        表4 各組腦組織TLR4、NF-κB p65水平比較(±s)

        表4 各組腦組織TLR4、NF-κB p65水平比較(±s)

        組別假手術(shù)組模型組中藥組n 8 6 7 TLR4蛋白0.21±0.03 0.62±0.09**0.31±0.05△NF-κB p65蛋白0.12±0.09 0.53±0.11**0.27±0.08△△

        圖3 各組大鼠TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)條帶

        3 討論

        炎癥是腦IR/R的主要損傷機(jī)制之一[4]。在靜息狀態(tài)下,存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)并處于失活狀態(tài),當(dāng)腦缺血組織突然恢復(fù)血供后,細(xì)胞產(chǎn)生大量氧自由基,誘導(dǎo)TLR4激活[9],通過(guò)信號(hào)級(jí)聯(lián)擴(kuò)大效應(yīng)激活 NF-κB,NF-κB被激活后從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)(尤其是p65亞單位),與相應(yīng)的炎癥相關(guān)基因結(jié)合,啟動(dòng)炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄,誘發(fā)炎癥。此外,活化的NF-κB還可激活小膠質(zhì)細(xì)胞,同時(shí)調(diào)控其激活狀態(tài)[10-11]。

        小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞最主要的炎癥細(xì)胞,在腦缺血后第一個(gè)做出反應(yīng)[12]。小膠質(zhì)細(xì)胞的活化存在于缺血性腦中風(fēng)的各個(gè)階段[13],通過(guò)釋放細(xì)胞因子、趨化因子等持續(xù)影響神經(jīng)功能[14-15]。研究發(fā)現(xiàn),活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可以表現(xiàn)出損傷和保護(hù)兩種截然相反的生理活性,這主要取決于小膠質(zhì)細(xì)胞活化后的狀態(tài)[16-17]。M1型小膠質(zhì)細(xì)胞為促炎型小膠質(zhì)細(xì)胞,主要產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子,如TNF-α、IL-1β、干擾素-γ(IFN-γ)、IL-6、IL-12、IL-23、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和蛋白水解酶(MMP9、MMP3)等,加劇組織炎性損傷[18]。M2型小膠質(zhì)細(xì)胞為修復(fù)型小膠質(zhì)細(xì)胞,產(chǎn)生促血管生成和促炎性作用的IL-4、IL-10、IL-13、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β),以及生長(zhǎng)因子如VEGF、BDNF、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)等,可以減輕組織炎癥,促進(jìn)損傷修復(fù)[19]。NF-κB對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活主要是使小膠質(zhì)細(xì)胞由靜息態(tài)轉(zhuǎn)化為M1型,還可以促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞由M2型轉(zhuǎn)化為M1型,增加IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8等促炎癥因子釋放,引起組織廣泛而又持續(xù)的炎性損傷[20]。

        實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路,可以減輕腦組織炎性損傷,預(yù)防腦IR/R[21-22]。綜上所述,抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路,促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2轉(zhuǎn)化,可以減少促炎性細(xì)胞因子水平,增加抑炎性細(xì)胞因子水平,恢復(fù)腦組織免疫穩(wěn)態(tài),可減少腦組織IR/R損傷。在本研究中發(fā)現(xiàn),三七總皂苷可顯著縮小MCAO模型大鼠腦梗死面積,改善大鼠神經(jīng)元損傷,改善大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀,這與既往的研究結(jié)果相同,再次印證了三七總皂苷對(duì)腦IR/R的保護(hù)作用。其機(jī)制可能與下調(diào)大鼠TLR4/NF-κB炎性信號(hào)通路,促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞由M2型向M1型轉(zhuǎn)化,進(jìn)而減少M(fèi)1型小膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β、TNF-α表達(dá),增加M2型小膠質(zhì)細(xì)胞IL-4、IL-10表達(dá),減輕組織炎性損傷相關(guān)。

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