張慶乾 葉 菁 陳 淼 陳嘉斌 徐國暑 謝鑫靈 余志紅

浙江省立同德醫(yī)院 浙江 杭州 310012

清熱消積方基于腫瘤患者“正氣虛損、陰陽失衡、臟腑功能失調(diào)，痰、瘀、熱、毒互結(jié)”的病機而組方。已有研究證實該復(fù)方具有較好的抗腫瘤效果，但其是否通過調(diào)控免疫功能進而發(fā)揮抗腫瘤作用尚不清楚。本研究采用荷瘤Lewis肺癌小鼠移植瘤作為研究對象，觀察其對腫瘤組織PD-1/PD-L1 蛋白及相關(guān)細胞因子的影響，對其抗腫瘤機理進一步探討。

1 材料與方法

1.1 材料：分述如下。

1.1.1 動物模型：Lewis肺癌細胞株購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心（中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細胞庫）。1.1.2 實驗用藥：清熱消積方中藥材蛇六谷、白花蛇舌草、半枝蓮、絞股藍等由浙江省立同德醫(yī)院藥房提供。以上藥材采用粉碎機進行粉碎，過200 目藥篩后于3～5L圓底燒瓶中，加水混勻后置于中藥陶瓷罐中加熱提取2h，過濾收集全部濾液。殘渣重復(fù)提取，合并兩次濾液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮。最后將全部中藥提取后濃縮提取液，并于冷凍干燥機中低溫減壓干燥，備用。

1.1.3 主要試劑及儀器：小鼠血清γ 干擾素（IFN-γ）試劑盒、白介素-2（IL-2）試劑盒以及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；DMEM細胞培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗、胰蛋白酶消化液均購自蘭堡生物技術(shù)服務(wù)部；小鼠脫毛劑（LANUOR 蘭諾兒）購于杭州宏萊生物科技有限公司。

1.2 方法：分述如下。

1.2.1 細胞培養(yǎng)：在25cm2細胞培養(yǎng)瓶中，含10%胎牛血清和1%抗生素的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)肺癌細胞株Lewis，置于5% CO2培養(yǎng)箱，待生長至80%融合時用0.25%胰酶-EDTA消化傳代。待細胞量足夠?qū)嶒炇褂脮r，傳代到6孔板中，傳代時細胞濃度約為2×105個。

1.2.2 荷瘤小鼠模型制備：選取40 只SPF 級C57BL/6J雄性小鼠在實驗動物中心適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，分別于小鼠右腋窩皮下注射Lewis 肺癌細胞0.1ml，細胞懸液腫瘤細胞數(shù)為1×107/ml，全程無菌操作，規(guī)定在30min 內(nèi)注射完成，制備荷瘤小鼠。

1.2.3 實驗分組：將接種后的荷瘤小鼠隨機分為4組，其中中藥組給予清熱消積方藥液0.2ml/10g量，灌胃給藥，每日2 次，連續(xù)給藥3 周；安慰劑組給予同等劑量的生理鹽水灌胃；陽性對照組給予順鉑，腹腔注射，1 次10mg/kg，每周1 次，連續(xù)給藥3 周；模型組自由飲水。停藥次日，取荷瘤小鼠眼球外周血后處死，剝離皮下瘤體，留取瘤體新鮮組織待用。

1.2.4 ELISA 法檢測IFN-γ、IL-2 和TNF-α 的水平：將采集的血液離心后收集血清，嚴格按照IFN-γ、IL-2和TNF-α 試劑盒說明書操作，于酶標儀上檢測血清中IFN-γ、IL-2和TNF-α的水平。

1.2.5 流式細胞儀檢測CD8+PD-1+T 細胞和CD8+PD-1-T細胞：使用眼科剪將腫瘤組織剪碎，PBS 漂洗后加入0.25%胰蛋白酶液制成濃度約為1.5×107個/ml 的單細胞懸液，然后采用磁珠分選儀進行CD8+T細胞分選，CD8-APC 抗體單染后，加入流式分選儀進行流式分析，獲得CD8+標記的T細胞后，經(jīng)離心和重懸后，加入PD-1-PE抗體單染，經(jīng)流式分選儀分析后獲得CD8+/PD-1+的T細胞。

1.2.6 免疫組化法檢測PD-L1的表達：腫瘤組織經(jīng)10%福爾馬林固定后，常規(guī)石蠟包埋并制成4μm厚的切片，然后采用丹麥DAKO公司EnVisionTM二步法進行了免疫組化染色檢測。使用二甲苯對石蠟切片水化，抗原修復(fù)后滴加一抗，孵育完畢后滴加二抗，室溫孵育后滴加預(yù)備好的顯色劑DAB，室溫孵育后用蒸餾水沖洗終止顯色，蘇木精復(fù)染后封片。

1.2.7 免疫組化染色結(jié)果判定：PD-L1 陽性細胞隨機選取5個高倍鏡視野（×40）進行細胞計數(shù)，評分方法根據(jù)Remmele 和Stegner 提出的免疫反應(yīng)積分（IRS）評分法[1]，即染色強度（SI）和陽性細胞百分比（PP）的乘積，IRS=SI×PP，當(dāng)SI與PP的乘積＞3分時為陽性。

1.3 統(tǒng)計分析方法：采用SPSS 22.0 進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均值±標準差（±s）表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 建立肺癌移植瘤模型：C57BL/6J 小鼠接種Lewis

肺癌細胞懸液1周后可在右腋皮下觸及米粒大小結(jié)節(jié)，連續(xù)觀察10天左右，小鼠接種部位皮下腫塊持續(xù)存在，無自然消退現(xiàn)象，成瘤率達100%，說明建模成功，符合實驗要求。

2.2 各組血清IFN-γ、IL-2和TNF-α水平：見表1。

表1 各組小鼠血清細胞因子水平變化（±s，pg/ml)

表1 各組小鼠血清細胞因子水平變化（±s，pg/ml)

注：與安慰劑組及模型組比較，aP＜0.05。

組別安慰劑組模型組陽性對照組中藥組TNF-α 45.49±6.45 56.21±7.07 26.41±4.48a 31.55±6.53a INF-γ 522.38±40.47 533.52±36.71 638.95±68.38a 609.99±48.13a IL-2 18.55±2.27 21.33±2.42 29.33±2.28a 25.52±3.05a

2.3 對腫瘤組織CD8+PD-1+T 細胞和CD8+PD-1-T 細胞表達的影響：與中藥組和陽性對照組相比，安慰劑組及模型組腫瘤組織中CD8+PD-1+T細胞比例明顯降低，CD8+PD-1-T細胞比例明顯增高（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組CD8+PD-1+T細胞和CD8+PD-1-T細胞水平

2.4 對腫瘤組織PD-L1表達的影響：安慰劑組及模型組腫瘤組織PD-L1的陽性染色細胞明顯高于中藥組及陽性對照組（P＜0.05），見圖2A；安慰劑組和模型組IRS評分明顯高于中藥組及陽性對照組（P＜0.05），見圖2B。

圖2 各組腫瘤組織PD-L1免疫組化染色結(jié)果（×40）

3 討論

清熱消積方由蛇六谷、白花蛇舌草、半枝蓮、絞股藍、白豆蔻等組成，具有清熱解毒、化痰散結(jié)、理氣行瘀等功效。前期研究顯示，清熱消積方能夠抗腫瘤血管形成[2]。本研究結(jié)果顯示，清熱消積方能夠提高IFN-γ、IL-2水平，降低TNF-α水平。TNF-α在腫瘤微環(huán)境中起重要作用，腫瘤細胞自分泌的或髓樣細胞旁分泌的TNF-α 通過誘導(dǎo)活性氧和活性氮的產(chǎn)生，對腫瘤細胞DNA 造成損傷，從而誘導(dǎo)腫瘤細胞的突變，從而促進腫瘤細胞發(fā)生及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）[3]。IL-2 可以刺激CD8+T細胞的活化為毒性T淋巴細胞，并激活NK細胞，促使其分泌干擾素-γ（IFN-γ）等細胞因子，從而殺傷腫瘤細胞[4]。進一步通過流式細胞儀檢測T 細胞表型發(fā)現(xiàn)，清熱消積方能夠提高腫瘤組織中PD-1 耗竭的CD8+T細胞的PD-1表達，其作用效果同陽性對照藥順鉑相似，說明清熱消積方可能通過提高PD-1 的表達，促進CD8+T細胞，即毒性T淋巴細胞的活化，促進IFN-γ、IL-2因子分泌，抑制TNF-α 分泌，從而達到抑瘤效應(yīng)。目前研究發(fā)現(xiàn)，阻斷PD-1/PD-L1途徑可顯著提高特異性T細胞對腫瘤的殺傷效果[5]。本研究中進一步通過免疫組化法檢測了腫瘤組織中PD-L1蛋白表達，結(jié)果提示清熱消積方給藥后，腫瘤組織中PD-L1蛋白表達明顯降低，其IRS評分明顯高于安慰劑組及模型組，但與陽性對照藥順鉑相似，提示清熱消積方可能通過降低PD-L1表達調(diào)控腫瘤小鼠的免疫功能。綜上，清熱消積方能夠提高血清IFNγ、IL-2 含量，降低TNF-α 水平，其作用機制可能與降低PD-L1表達進而激活T細胞有關(guān)。