施琳琳 陳 芳 吳之茵 詹程胹 劉 敏 陶麗媛 李 蒙

1 浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 浙江 杭州 310003

2 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 浙江 杭州 310006

腸易激綜合征（IBS）是臨床常見(jiàn)的功能性胃腸病之一，根據(jù)排便習(xí)慣改變可分為便秘型（IBS-C）、腹瀉型（IBS-D），或便秘與腹瀉交替型（IBS-M），同時(shí)伴有腹痛或腹脹的感覺(jué)[1]。在全球范圍內(nèi)，IBS 患病率在1.1%～45.0%；而在我國(guó)，IBS 總體患病率約為6.5%，其中女性患病率略高于男性[2]。IBS-C的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟高敏感、腸道動(dòng)力異常、腸道感染及免疫紊亂等因素參與其中。近年研究也發(fā)現(xiàn)IBS癥狀與腸道微生態(tài)相關(guān)。除此之外，IBS 患者可能還存在腦-腸軸的互動(dòng)異常。理氣通便合劑是我院在長(zhǎng)期臨床治療IBS-C實(shí)踐中總結(jié)出的有效方劑。為探討理氣通便合劑治療IBS-C 的可能機(jī)制，筆者采用冰水灌胃法建立的IBS-C大鼠模型，觀察其對(duì)IBS-C模型膽囊收縮素（CCK）、神經(jīng)肽Y（NPY）、P物質(zhì)（SP）的影響。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF 級(jí)SD 大鼠24 只，雌雄各半，體質(zhì)量140±20g，購(gòu)于上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（浙）2018-0012，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)環(huán)境控制在室溫21℃、濕度70%、噪音＜50dB，每籠4 只，自由飲水、攝食。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均通過(guò)浙江中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)的審批（批準(zhǔn)編號(hào)：IACUC-20180326-12）。

1.2 藥物與試劑：理氣通便合劑由生白術(shù)、炒萊菔子各12g，黃芪30g，生首烏6g，炒枳實(shí)、檳榔、藿香各10g 組成，由浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)浸泡、2 次煎煮、過(guò)濾、濃縮至1g/ml，于4℃冰箱保存，用前加溫至37℃。枸櫞酸莫沙必利5mg/片，日本制藥株式會(huì)社生產(chǎn)，碾碎后溶于生理鹽水，濃度為0.135%，4℃冰箱保存，用前加溫。大鼠CCK、NPY、SP的ELISA檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)分別為HR3354120-1、HR4618510-2、HR4234021-2；大鼠CCK、NPY、SP免疫組化抗體，購(gòu)自Abcam公司。

1.3 耗材與儀器：酶標(biāo)分析儀：Rayto RT-6100 測(cè)試方法和操作步操作：詳見(jiàn)操作說(shuō)明書(shū)。Nikon eclipse 80i顯微鏡，Nikon 公司；DS-Fi1 500 萬(wàn)像素CCD 攝像頭，Nikon 公司；Carl Zeiss Imaging Systems 圖像分析軟件，Carl Zeiss公司。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥：24 只SD 大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，以隨機(jī)數(shù)字表法將其隨機(jī)分為空白組、IBS-C 模型組（模型組）、理氣通便合劑治療組（中藥組），莫沙必利治療組（西藥組），每組6 只。采用冰水灌胃法[3]制備IBS-C 大鼠模型，用0～4℃冰水2ml/只每天灌胃1 次，連續(xù)灌胃21天；空白組予等量37℃生理鹽水灌胃。通過(guò)觀察糞便性狀、糞便顆粒計(jì)數(shù)對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。根據(jù)人與動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量換算法計(jì)算中西藥物干預(yù)劑量。灌胃第8天起中藥組予加用理氣通便合劑（18.75g?kg-1?d-1）干預(yù)，西藥組予莫沙必利水溶液（1.35mg?kg-1?d-1）灌胃，空白組及模型組予等量生理鹽水灌胃。

2.2 取材：藥物干預(yù)治療14天后，禁食24h，不限水，以10%水合氯醛予腹腔注射麻醉后，開(kāi)腹，迅速取出各組大鼠距肛門(mén)5cm 的結(jié)腸2.0cm，用生理鹽水沖洗干凈后以10%甲醛液固定，以備HE染色、免疫組化檢測(cè)；另剪取附近長(zhǎng)約1cm 腸組織標(biāo)本，存放于1.5ml 凍存管內(nèi)，以備酶聯(lián)免疫檢測(cè)。同時(shí)，快速斷頭取腦，在冰盤(pán)上分離大鼠下丘腦區(qū)，以10%甲醛液固定，以備免疫組化檢測(cè)；另取少量下丘腦組織存放于1.5ml 凍存管內(nèi)，置于液氮，行酶聯(lián)免疫檢測(cè)。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法：①大鼠一般情況及糞便：包括食欲、精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、體質(zhì)量和糞便Bristol 分型等。②直腸擴(kuò)張?jiān)囼?yàn)測(cè)量大鼠內(nèi)臟敏感性，通過(guò)觀察腹部撤離反射（AWR）評(píng)分來(lái)評(píng)價(jià)內(nèi)臟敏感性。AWR 1 分看作是大鼠的感覺(jué)閾值，2分作為痛覺(jué)敏感閾值，4分作為痛覺(jué)最大耐受容量閾值。③大鼠結(jié)腸HE染色情況：將石蠟標(biāo)本連續(xù)切片（厚度約4μm），HE 染色后光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠結(jié)腸黏膜改變。④大鼠結(jié)腸、下丘腦CCK、NPY、SP蛋白ELISA檢測(cè)：用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗組織，將組織剪碎后勻漿，后將勻漿液離心，取上清液行ELISA檢測(cè)，操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。⑤大鼠結(jié)腸、下丘腦CCK、NPY、SP 蛋白免疫組化檢測(cè)：將結(jié)腸組織、下丘腦組織從甲醛液內(nèi)取出，常規(guī)脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片，用免疫組化法進(jìn)行結(jié)腸組織、下丘腦組織CCK、NPY、SP 含量的測(cè)定，具體按照免疫組化說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。陽(yáng)性結(jié)果為細(xì)胞染有棕黃顆粒。應(yīng)用Carl Zeiss Imaging Systems圖像分析軟件對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 21.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05作為評(píng)定差異有顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)果

3.1 一般情況：造模期間，無(wú)大鼠死亡。模型對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)不佳，背毛光澤度差，進(jìn)食量少，糞質(zhì)干硬，Bristol 分型呈1～2 型。14 天給藥治療結(jié)束后，治療組大鼠精神狀態(tài)好，背毛光澤，進(jìn)食量多，糞便Bristol分型呈3～4型。

3.2 直腸擴(kuò)張?jiān)囼?yàn)：與模型組比較，中藥組測(cè)得的痛覺(jué)敏感閾值和痛覺(jué)最大閾值的容量閾值分別為1.07±0.16ml 和2.13±0.21ml，痛覺(jué)敏感閾值和痛覺(jué)最大閾值的容量閾值均明顯上升（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 大鼠腸道容量閾值（±s，ml）

表1 大鼠腸道容量閾值（±s，ml）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

n 6 6 6 6分組空白組模型組西藥組中藥組痛覺(jué)敏感閾值0.83±0.17 0.74±0.18*1.12±0.25#1.07±0.16#痛覺(jué)最大閾值1.89±0.24 1.48±0.20*2.26±0.38#2.13±0.21#

3.3 大鼠結(jié)腸HE 染色情況：HE 染色顯示，模型組大鼠結(jié)腸黏膜病理顯示黏膜腺體排列紊亂，黏膜層可見(jiàn)有中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，且肌層有斷裂現(xiàn)象，與正常對(duì)照的空白組差異較大；而藥物干預(yù)組則與空白組較為接近。

3.4 大鼠結(jié)腸、下丘腦CCK、NPY、SP蛋白ELISA檢測(cè)：與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸及下丘腦CCK、NPY表達(dá)水平升高（P＜0.05），藥物干預(yù)后，中藥組及西藥組大鼠結(jié)腸及下丘腦CCK、NPY 水平較模型組有所下降（P＜0.05）。模型組大鼠結(jié)腸及下丘腦SP 水平下降（P＜0.05），藥物干預(yù)后，中藥組及西藥組大鼠結(jié)腸及下丘腦SP較模型組有所回升（P＜0.05）。見(jiàn)表2、表3。

表2 理氣通便合劑對(duì)大鼠結(jié)腸CCK、NPY、SP的影響（±s）

表2 理氣通便合劑對(duì)大鼠結(jié)腸CCK、NPY、SP的影響（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

SP（ng/g）11.749±1.788 10.584±2.493*11.880±0.763#11.994±1.008#分組空白組模型組西藥組中藥組n6 6 6 6 CCK（pg/g）756.745±64.962 948.236±73.194*856.452±35.278#851.806±41.610#NPY（ng/g）51.360± 8.063 87.075±10.961*76.969± 5.717#70.255±12.377#

表3 理氣通便合劑對(duì)大鼠下丘腦CCK、NPY、SP的影響（±s）

表3 理氣通便合劑對(duì)大鼠下丘腦CCK、NPY、SP的影響（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

分組空白組模型組西藥組中藥組SP（ng/g）21.108±4.224 19.941±2.861*22.056±2.823#23.188±2.426#n6 6 6 6 CCK（pg/g）443.754±10.554 467.792±22.337*416.822±35.220#438.000±8.535#NPY（ng/g）179.790±11.529 377.558±10.987*165.012±17.394#156.034±19.110#

3.5 大鼠結(jié)腸、下丘腦CCK、NPY、SP 蛋白免疫組化檢測(cè)：空白組CCK、NPY 陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色，模型組陽(yáng)性細(xì)胞胞漿染色較多較深，主要位于黏膜下層肌間神經(jīng)叢，中藥組及西藥組與空白組分布、染色接近?？瞻捉M結(jié)腸SP 陽(yáng)性細(xì)胞主要集中于肌間神經(jīng)叢，陽(yáng)性細(xì)胞胞漿染色呈棕黃色，模型組陽(yáng)性細(xì)胞胞漿染色較深，數(shù)量較多，而中藥組及西藥組陽(yáng)性細(xì)胞胞漿多染色較少，與空白組分布、染色接近。

4 討論

隨著羅馬IV 對(duì)IBS 的重新定義，腦-腸軸互動(dòng)異常在IBS 發(fā)病中的作用日益受到重視。胃腸運(yùn)動(dòng)、分泌等功能的調(diào)控由腸神經(jīng)系統(tǒng)（ENS）、自主神經(jīng)系統(tǒng)（ANS）及中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）共同作用完成。腦腸肽是由胃腸道內(nèi)分泌細(xì)胞分泌的小分子肽類(lèi)物質(zhì)，在神經(jīng)系統(tǒng)及胃腸道均有分布，具有胃腸激素和神經(jīng)遞質(zhì)的雙重功能，可參與調(diào)節(jié)內(nèi)臟感覺(jué)、胃腸道運(yùn)動(dòng)、分泌等過(guò)程。主要包括5-羥色胺（5-HT）、P 物質(zhì)（SP）、神經(jīng)肽Y（NPY）、膽囊收縮素（CCK）、降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）等。既往有關(guān)大量研究顯示[4-5]，腦腸肽表達(dá)紊亂在腹瀉型腸易激綜合征（IBS-D）的發(fā)病機(jī)制中起到非常重要的作用。

CCK 是從十二指腸發(fā)現(xiàn)并提取，它能夠使膽囊收縮。CCK 廣泛分布于消化系統(tǒng)、外周以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外周血液等組織器官中，已被證實(shí)具有促進(jìn)膽囊和胃腸平滑肌收縮、調(diào)節(jié)胃腸蠕動(dòng)、抑制胃酸分泌、抑制餐后胃排空、抑制結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)的作用。NPY 在CNS、ENS，以及許多器官中均有分布，并且含量豐富。在胃腸道，它能抑制腸液和胰液分泌，抑制胃腸道運(yùn)動(dòng)。在中樞，它主要參與包括痛覺(jué)在內(nèi)的多項(xiàng)生理功能的調(diào)節(jié)。本研究顯示，IBS-C大鼠NPY 水平在結(jié)腸和下丘腦中明顯升高，NPY 陽(yáng)性細(xì)胞密度的增加可能會(huì)通過(guò)增強(qiáng)回腸制動(dòng)[6]，增加水的吸收并減少腸液的分泌而減慢腸的運(yùn)輸，從而導(dǎo)致便秘。理氣通便合劑可以降低NPY 水平，改善便秘癥狀。SP 屬于速激肽家族，廣泛分布于CNS、ENS以及胃腸道的細(xì)神經(jīng)纖維內(nèi)。同時(shí)，SP 也可以通過(guò)感覺(jué)神經(jīng)放大內(nèi)臟痛覺(jué)。研究表明[7]，IBS-C 患者回盲部及乙狀結(jié)腸黏膜SP纖維陽(yáng)性表達(dá)較正常組增多、增粗，IBS-C 模型大鼠腸黏膜組織SP 表達(dá)增高。本研究發(fā)現(xiàn)模型組SP 在腸道肌層表達(dá)增強(qiáng)，但結(jié)腸、下丘腦SP 水平下降，類(lèi)似相左的結(jié)果也出現(xiàn)在慢傳輸型便秘的研究中。

IBS-C 屬中醫(yī)學(xué)中“便秘”范疇，其主要病機(jī)為大腸傳導(dǎo)失司，同時(shí)又與肝、脾等多個(gè)臟腑功能失調(diào)密切相關(guān)，尤其與肝的條達(dá)疏泄密切相關(guān)。因此以“理氣疏肝，潤(rùn)腸通便”為治法，我院自行組方研制理氣通便合劑。目前該方在臨床上對(duì)功能性便秘及危重患者腹腔高壓等療效確切[8-9]。同時(shí)，前期研究也發(fā)現(xiàn)[10]，理氣通便合劑可降低TRPV1、PAR-2表達(dá)，調(diào)節(jié)神經(jīng)肽類(lèi)和興奮性氨基酸如P 物質(zhì)、降鈣素基因相關(guān)蛋白等的釋放，導(dǎo)致內(nèi)臟敏感性增高和胃腸運(yùn)動(dòng)功能紊亂。

綜上所述，理氣通便合劑能改善IBS-C 模型精神狀態(tài)、進(jìn)食量和大鼠便秘的癥狀；亦可明顯改善其病理狀態(tài)，減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，減輕結(jié)腸黏膜的充血、水腫。其機(jī)制可能是抑制NPY、CCK 表達(dá)，加速胃腸道蠕動(dòng)、調(diào)節(jié)胃腸液分泌，從而改善便秘癥狀。SP及其受體NK1R參與IBS-C內(nèi)臟疼痛敏感的研究值得進(jìn)一步研究。