施琳琳 陳 芳 吳之茵 詹程胹 劉 敏 陶麗媛 李 蒙

1 浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 浙江 杭州 310003

2 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 浙江 杭州 310006

腸易激綜合征（IBS）是臨床常見的功能性胃腸病之一，根據(jù)排便習(xí)慣改變可分為便秘型（IBS-C）、腹瀉型（IBS-D），或便秘與腹瀉交替型（IBS-M），同時伴有腹痛或腹脹的感覺[1]。在全球范圍內(nèi)，IBS 患病率在1.1%～45.0%；而在我國，IBS 總體患病率約為6.5%，其中女性患病率略高于男性[2]。IBS-C的發(fā)病機制目前尚不明確，研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟高敏感、腸道動力異常、腸道感染及免疫紊亂等因素參與其中。近年研究也發(fā)現(xiàn)IBS癥狀與腸道微生態(tài)相關(guān)。除此之外，IBS 患者可能還存在腦-腸軸的互動異常。理氣通便合劑是我院在長期臨床治療IBS-C實踐中總結(jié)出的有效方劑。為探討理氣通便合劑治療IBS-C 的可能機制，筆者采用冰水灌胃法建立的IBS-C大鼠模型，觀察其對IBS-C模型膽囊收縮素（CCK）、神經(jīng)肽Y（NPY）、P物質(zhì)（SP）的影響。

1 材料

1.1 實驗動物：SPF 級SD 大鼠24 只，雌雄各半，體質(zhì)量140±20g，購于上海西普爾必凱實驗動物有限公司。動物許可證號：SYXK（浙）2018-0012，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，飼養(yǎng)環(huán)境控制在室溫21℃、濕度70%、噪音＜50dB，每籠4 只，自由飲水、攝食。所有的動物實驗均通過浙江中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會的審批（批準(zhǔn)編號：IACUC-20180326-12）。

1.2 藥物與試劑：理氣通便合劑由生白術(shù)、炒萊菔子各12g，黃芪30g，生首烏6g，炒枳實、檳榔、藿香各10g 組成，由浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)浸泡、2 次煎煮、過濾、濃縮至1g/ml，于4℃冰箱保存，用前加溫至37℃。枸櫞酸莫沙必利5mg/片，日本制藥株式會社生產(chǎn)，碾碎后溶于生理鹽水，濃度為0.135%，4℃冰箱保存，用前加溫。大鼠CCK、NPY、SP的ELISA檢測試劑盒，購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號分別為HR3354120-1、HR4618510-2、HR4234021-2；大鼠CCK、NPY、SP免疫組化抗體，購自Abcam公司。

1.3 耗材與儀器：酶標(biāo)分析儀：Rayto RT-6100 測試方法和操作步操作：詳見操作說明書。Nikon eclipse 80i顯微鏡，Nikon 公司；DS-Fi1 500 萬像素CCD 攝像頭，Nikon 公司；Carl Zeiss Imaging Systems 圖像分析軟件，Carl Zeiss公司。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥：24 只SD 大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，以隨機數(shù)字表法將其隨機分為空白組、IBS-C 模型組（模型組）、理氣通便合劑治療組（中藥組），莫沙必利治療組（西藥組），每組6 只。采用冰水灌胃法[3]制備IBS-C 大鼠模型，用0～4℃冰水2ml/只每天灌胃1 次，連續(xù)灌胃21天；空白組予等量37℃生理鹽水灌胃。通過觀察糞便性狀、糞便顆粒計數(shù)對模型進行評價。根據(jù)人與動物間按體表面積折算的等效劑量換算法計算中西藥物干預(yù)劑量。灌胃第8天起中藥組予加用理氣通便合劑（18.75g?kg-1?d-1）干預(yù)，西藥組予莫沙必利水溶液（1.35mg?kg-1?d-1）灌胃，空白組及模型組予等量生理鹽水灌胃。

2.2 取材：藥物干預(yù)治療14天后，禁食24h，不限水，以10%水合氯醛予腹腔注射麻醉后，開腹，迅速取出各組大鼠距肛門5cm 的結(jié)腸2.0cm，用生理鹽水沖洗干凈后以10%甲醛液固定，以備HE染色、免疫組化檢測；另剪取附近長約1cm 腸組織標(biāo)本，存放于1.5ml 凍存管內(nèi)，以備酶聯(lián)免疫檢測。同時，快速斷頭取腦，在冰盤上分離大鼠下丘腦區(qū)，以10%甲醛液固定，以備免疫組化檢測；另取少量下丘腦組織存放于1.5ml 凍存管內(nèi)，置于液氮，行酶聯(lián)免疫檢測。

2.3 檢測指標(biāo)與方法：①大鼠一般情況及糞便：包括食欲、精神狀態(tài)、活動情況、體質(zhì)量和糞便Bristol 分型等。②直腸擴張試驗測量大鼠內(nèi)臟敏感性，通過觀察腹部撤離反射（AWR）評分來評價內(nèi)臟敏感性。AWR 1 分看作是大鼠的感覺閾值，2分作為痛覺敏感閾值，4分作為痛覺最大耐受容量閾值。③大鼠結(jié)腸HE染色情況：將石蠟標(biāo)本連續(xù)切片（厚度約4μm），HE 染色后光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠結(jié)腸黏膜改變。④大鼠結(jié)腸、下丘腦CCK、NPY、SP蛋白ELISA檢測：用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗組織，將組織剪碎后勻漿，后將勻漿液離心，取上清液行ELISA檢測，操作嚴(yán)格按照說明書進行。⑤大鼠結(jié)腸、下丘腦CCK、NPY、SP 蛋白免疫組化檢測：將結(jié)腸組織、下丘腦組織從甲醛液內(nèi)取出，常規(guī)脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片，用免疫組化法進行結(jié)腸組織、下丘腦組織CCK、NPY、SP 含量的測定，具體按照免疫組化說明書步驟進行。陽性結(jié)果為細(xì)胞染有棕黃顆粒。應(yīng)用Carl Zeiss Imaging Systems圖像分析軟件對染色結(jié)果進行半定量分析。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS 21.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05作為評定差異有顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)果

3.1 一般情況：造模期間，無大鼠死亡。模型對照組大鼠精神狀態(tài)不佳，背毛光澤度差，進食量少，糞質(zhì)干硬，Bristol 分型呈1～2 型。14 天給藥治療結(jié)束后，治療組大鼠精神狀態(tài)好，背毛光澤，進食量多，糞便Bristol分型呈3～4型。

3.2 直腸擴張試驗：與模型組比較，中藥組測得的痛覺敏感閾值和痛覺最大閾值的容量閾值分別為1.07±0.16ml 和2.13±0.21ml，痛覺敏感閾值和痛覺最大閾值的容量閾值均明顯上升（P＜0.05），見表1。

表1 大鼠腸道容量閾值（±s，ml）

表1 大鼠腸道容量閾值（±s，ml）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

n 6 6 6 6分組空白組模型組西藥組中藥組痛覺敏感閾值0.83±0.17 0.74±0.18*1.12±0.25#1.07±0.16#痛覺最大閾值1.89±0.24 1.48±0.20*2.26±0.38#2.13±0.21#

3.3 大鼠結(jié)腸HE 染色情況：HE 染色顯示，模型組大鼠結(jié)腸黏膜病理顯示黏膜腺體排列紊亂，黏膜層可見有中性粒細(xì)胞浸潤，且肌層有斷裂現(xiàn)象，與正常對照的空白組差異較大；而藥物干預(yù)組則與空白組較為接近。

3.4 大鼠結(jié)腸、下丘腦CCK、NPY、SP蛋白ELISA檢測：與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸及下丘腦CCK、NPY表達水平升高（P＜0.05），藥物干預(yù)后，中藥組及西藥組大鼠結(jié)腸及下丘腦CCK、NPY 水平較模型組有所下降（P＜0.05）。模型組大鼠結(jié)腸及下丘腦SP 水平下降（P＜0.05），藥物干預(yù)后，中藥組及西藥組大鼠結(jié)腸及下丘腦SP較模型組有所回升（P＜0.05）。見表2、表3。

表2 理氣通便合劑對大鼠結(jié)腸CCK、NPY、SP的影響（±s）

表2 理氣通便合劑對大鼠結(jié)腸CCK、NPY、SP的影響（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

SP（ng/g）11.749±1.788 10.584±2.493*11.880±0.763#11.994±1.008#分組空白組模型組西藥組中藥組n6 6 6 6 CCK（pg/g）756.745±64.962 948.236±73.194*856.452±35.278#851.806±41.610#NPY（ng/g）51.360± 8.063 87.075±10.961*76.969± 5.717#70.255±12.377#

表3 理氣通便合劑對大鼠下丘腦CCK、NPY、SP的影響（±s）

表3 理氣通便合劑對大鼠下丘腦CCK、NPY、SP的影響（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

分組空白組模型組西藥組中藥組SP（ng/g）21.108±4.224 19.941±2.861*22.056±2.823#23.188±2.426#n6 6 6 6 CCK（pg/g）443.754±10.554 467.792±22.337*416.822±35.220#438.000±8.535#NPY（ng/g）179.790±11.529 377.558±10.987*165.012±17.394#156.034±19.110#

3.5 大鼠結(jié)腸、下丘腦CCK、NPY、SP 蛋白免疫組化檢測：空白組CCK、NPY 陽性細(xì)胞呈棕黃色，模型組陽性細(xì)胞胞漿染色較多較深，主要位于黏膜下層肌間神經(jīng)叢，中藥組及西藥組與空白組分布、染色接近?？瞻捉M結(jié)腸SP 陽性細(xì)胞主要集中于肌間神經(jīng)叢，陽性細(xì)胞胞漿染色呈棕黃色，模型組陽性細(xì)胞胞漿染色較深，數(shù)量較多，而中藥組及西藥組陽性細(xì)胞胞漿多染色較少，與空白組分布、染色接近。

4 討論

隨著羅馬IV 對IBS 的重新定義，腦-腸軸互動異常在IBS 發(fā)病中的作用日益受到重視。胃腸運動、分泌等功能的調(diào)控由腸神經(jīng)系統(tǒng)（ENS）、自主神經(jīng)系統(tǒng)（ANS）及中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）共同作用完成。腦腸肽是由胃腸道內(nèi)分泌細(xì)胞分泌的小分子肽類物質(zhì)，在神經(jīng)系統(tǒng)及胃腸道均有分布，具有胃腸激素和神經(jīng)遞質(zhì)的雙重功能，可參與調(diào)節(jié)內(nèi)臟感覺、胃腸道運動、分泌等過程。主要包括5-羥色胺（5-HT）、P 物質(zhì)（SP）、神經(jīng)肽Y（NPY）、膽囊收縮素（CCK）、降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）等。既往有關(guān)大量研究顯示[4-5]，腦腸肽表達紊亂在腹瀉型腸易激綜合征（IBS-D）的發(fā)病機制中起到非常重要的作用。

CCK 是從十二指腸發(fā)現(xiàn)并提取，它能夠使膽囊收縮。CCK 廣泛分布于消化系統(tǒng)、外周以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外周血液等組織器官中，已被證實具有促進膽囊和胃腸平滑肌收縮、調(diào)節(jié)胃腸蠕動、抑制胃酸分泌、抑制餐后胃排空、抑制結(jié)腸轉(zhuǎn)運的作用。NPY 在CNS、ENS，以及許多器官中均有分布，并且含量豐富。在胃腸道，它能抑制腸液和胰液分泌，抑制胃腸道運動。在中樞，它主要參與包括痛覺在內(nèi)的多項生理功能的調(diào)節(jié)。本研究顯示，IBS-C大鼠NPY 水平在結(jié)腸和下丘腦中明顯升高，NPY 陽性細(xì)胞密度的增加可能會通過增強回腸制動[6]，增加水的吸收并減少腸液的分泌而減慢腸的運輸，從而導(dǎo)致便秘。理氣通便合劑可以降低NPY 水平，改善便秘癥狀。SP 屬于速激肽家族，廣泛分布于CNS、ENS以及胃腸道的細(xì)神經(jīng)纖維內(nèi)。同時，SP 也可以通過感覺神經(jīng)放大內(nèi)臟痛覺。研究表明[7]，IBS-C 患者回盲部及乙狀結(jié)腸黏膜SP纖維陽性表達較正常組增多、增粗，IBS-C 模型大鼠腸黏膜組織SP 表達增高。本研究發(fā)現(xiàn)模型組SP 在腸道肌層表達增強，但結(jié)腸、下丘腦SP 水平下降，類似相左的結(jié)果也出現(xiàn)在慢傳輸型便秘的研究中。

IBS-C 屬中醫(yī)學(xué)中“便秘”范疇，其主要病機為大腸傳導(dǎo)失司，同時又與肝、脾等多個臟腑功能失調(diào)密切相關(guān)，尤其與肝的條達疏泄密切相關(guān)。因此以“理氣疏肝，潤腸通便”為治法，我院自行組方研制理氣通便合劑。目前該方在臨床上對功能性便秘及危重患者腹腔高壓等療效確切[8-9]。同時，前期研究也發(fā)現(xiàn)[10]，理氣通便合劑可降低TRPV1、PAR-2表達，調(diào)節(jié)神經(jīng)肽類和興奮性氨基酸如P 物質(zhì)、降鈣素基因相關(guān)蛋白等的釋放，導(dǎo)致內(nèi)臟敏感性增高和胃腸運動功能紊亂。

綜上所述，理氣通便合劑能改善IBS-C 模型精神狀態(tài)、進食量和大鼠便秘的癥狀；亦可明顯改善其病理狀態(tài)，減少炎癥細(xì)胞浸潤，減輕結(jié)腸黏膜的充血、水腫。其機制可能是抑制NPY、CCK 表達，加速胃腸道蠕動、調(diào)節(jié)胃腸液分泌，從而改善便秘癥狀。SP及其受體NK1R參與IBS-C內(nèi)臟疼痛敏感的研究值得進一步研究。