馬婷婷 任斐 馬進(jìn)寶 楊翰

丙硫異煙胺(Pto)和對氨基水楊酸(PAS)作為二線抗結(jié)核藥品，因其價(jià)格低廉、藥物可及性高、可聯(lián)合其他二線抗結(jié)核藥品，仍較多應(yīng)用于我國結(jié)核病治療中[1]。但Pto作為INH的類似物，其與INH的交叉耐藥一直是臨床較關(guān)注的問題。而PAS作為問世較早的抗結(jié)核藥品，臨床上常與INH聯(lián)合使用以增強(qiáng)INH的抗結(jié)核活性[2]，這些均導(dǎo)致耐INH結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)對Pto及PAS的耐藥率并不低，分別可達(dá)19.3%和11.9%[3]。同時(shí)，劉銀萍等[4]采用基因芯片法檢測MTB的INH耐藥inhA基因突變對檢測MTB對Pto耐藥的敏感度為60.0%，且與Pto的交叉耐藥率為20.0%，認(rèn)為inhA基因突變可能是INH與Pto交叉耐藥的原因。為進(jìn)一步了解耐INH的MTB對Pto及PAS耐藥是否與INH耐藥密切相關(guān)，以及inhA基因突變與Pto耐藥是否存在關(guān)聯(lián)，筆者對耐INH肺結(jié)核患者對Pto及PAS的耐藥情況進(jìn)行分析，以指導(dǎo)兩藥在臨床上的應(yīng)用。

資料和方法

1.研究對象：采用回顧性分析的方法，搜集2018年1月1日至2020年12月31日就診于西安市胸科醫(yī)院且符合入組標(biāo)準(zhǔn)的4021例分枝桿菌培養(yǎng)陽性患者臨床資料；排除168例非結(jié)核分枝桿菌感染患者后(MPB64單克隆抗體測定陰性)，對3853例肺結(jié)核患者(培養(yǎng)和MPB64單克隆抗體測定均陽性)的BACTEC MGIT 960(簡稱“MGIT 960”)液體藥物敏感性試驗(yàn)[簡稱“藥敏試驗(yàn)”；檢測INH和利福平(RFP)耐藥]、比例法藥敏試驗(yàn)(檢測Pto和PAS耐藥)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR熔解曲線法(檢測inhA和katG基因突變)的檢測結(jié)果進(jìn)行整理。3853例肺結(jié)核患者中，849例(22.03%)為INH耐藥，其中，男性566例(66.67%)，女性283例(33.33%)；年齡范圍為2～84歲，年齡中位數(shù)(四分位數(shù))為37.0(26.0，54.0)歲；耐多藥和非耐多藥患者分別為515例(60.66%)和334例(39.34%)；初、復(fù)治患者分別為582例(68.55%)和267例(31.45%)。

2.入組標(biāo)準(zhǔn)：納入痰液或支氣管肺泡灌洗液分枝桿菌MGIT 960培養(yǎng)陽性，醫(yī)院信息系統(tǒng)(HIS)中有MGIT 960和比例法藥敏試驗(yàn)及PCR熔解曲線法耐藥基因檢測結(jié)果者。排除經(jīng)MPB64單克隆抗體測定結(jié)果為陰性(非結(jié)核分枝桿菌)者。

3.液體培養(yǎng)及初步菌種鑒定：采用MGIT 960培養(yǎng)系統(tǒng)操作。首先對患者痰液或支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理，取0.5 ml處理過的標(biāo)本放入MGIT 960專用管中，在MGIT 960儀器中進(jìn)行培養(yǎng)。對培養(yǎng)陽性標(biāo)本進(jìn)行MPB64單克隆抗體測定，進(jìn)一步對判定為MTB的菌株行藥敏試驗(yàn)。

4.藥敏試驗(yàn)：使用MGIT 960藥敏試驗(yàn)檢測INH和RFP的耐藥性，兩者耐藥濃度分別為 0.1 μg/ml 和 1.0 μg/ml；使用比例法藥敏試驗(yàn)檢測Pto和PAS耐藥性，二者耐藥濃度分別為40 μg/ml和1 μg/ml。

5.耐藥基因檢測：參照實(shí)時(shí)熒光定量PCR熔解曲線法MTB耐藥基因突變檢測試劑盒說明書進(jìn)行試劑配制。取5 μl待檢測核酸加入反應(yīng)體系，瞬時(shí)離心，彈去氣泡后上機(jī)檢測。使用0.5麥?zhǔn)蠁挝籋37Rv菌懸液按照Lad-Aid 824 MTB核酸提取試劑盒說明書提取核酸，與試劑盒自帶陽性對照、陰性對照及樣品同時(shí)進(jìn)行檢測。菌液熔解曲線與陽性對照結(jié)果均敏感為質(zhì)量控制合格，陰性對照用于檢測環(huán)境及操作過程中的污染。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：使用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以“構(gòu)成比或百分率(%)”表示，組間差異的比較采用χ2檢驗(yàn)。inhA基因突變與Pto耐藥檢測的一致性采用Kappa值判定，當(dāng)Kappa值≥0.75說明一致性好，Kappa值<0.4說明一致性差，0.75>Kappa值≥0.4說明一致性一般。

結(jié) 果

1.對Pto和PAS的耐藥情況：849例INH耐藥患者中，Pto耐藥33例，耐藥率為3.89%；其中，Pto耐藥比例在耐多藥與非耐多藥、初治與復(fù)治患者中的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PAS耐藥101例，耐藥率為11.90%；其中，PAS耐藥比例在耐多藥與非耐多藥患者中的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在初治與復(fù)治患者中的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 不同特征異煙肼耐藥肺結(jié)核患者對丙硫異煙胺和對氨基水楊酸的耐藥情況

2.inhA及katG基因突變情況：849例INH耐藥肺結(jié)核患者中，518例進(jìn)行了耐藥基因檢測，發(fā)現(xiàn)katG基因突變者382例，突變率為73.75%；inhA基因突變者82例，突變率為15.83%；其中，24例(4.63%)同時(shí)存在katG及inhA突變，78例(15.06%)未檢測到katG和inhA基因突變。二者聯(lián)合檢測INH耐藥率達(dá)84.94%(440/518)。

3.inhA基因突變與Pto耐藥的一致性分析：518例行耐藥基因檢測者中，Pto耐藥者20例，耐藥率為3.86%。其中，82例inhA基因突變者中，Pto敏感75例(91.46%)、耐藥7例(8.54%)，與Pto耐藥者中發(fā)生inhA基因突變(35.00%，7/20)的一致性較差，Kappa值為0.080。

討 論

結(jié)核病的治療遵循“早期、聯(lián)合、適量、全程、規(guī)律”，但因MTB生長緩慢，耐藥結(jié)核病早期診斷仍較困難，而分子生物學(xué)檢測方法為其提供了可能。katG和inhA基因突變是MTB對INH耐藥的常見基因突變位點(diǎn)，二者聯(lián)合檢測INH耐藥的陽性率可高達(dá)90%左右[4]，尤以katG基因突變更為常見。本研究二者聯(lián)合檢測INH的耐藥率達(dá)84.94%，katG基因突變率為73.75%，與周愛萍等[5]對西安市117株INH耐藥MTB菌株katG315位點(diǎn)突變率(69.23%)和Huo等[6]對2015年北京胸科醫(yī)院INH耐藥MTB菌株katG基因突變率(70.5%)的結(jié)果基本一致。但本研究inhA基因突變率(15.83%)高于周愛萍等[5]的研究結(jié)果(8.55%)，低于Huo等[6]報(bào)道(26.7%)，且仍有15.1%(78例)的INH耐藥患者未檢測到katG或inhA基因突變，提示INH耐藥除與katG和inhA耐藥基因突變相關(guān)外，可能還存在其他耐藥基因，如ahpC、oxyR及kasA等，其中，ahpC基因突變率在部分患者中可達(dá)15%～20%左右[7-9]，提示依靠katG及inhA檢測MTB分離株對INH耐藥可能會(huì)出現(xiàn)漏診，增加ahpc等基因突變檢測可能會(huì)提高診斷敏感度。

PAS為抗結(jié)核抑菌藥物[10]，目前在《耐藥結(jié)核病化學(xué)治療指南(2019年簡版)》[2]藥物分組中位列C組，因其與INH聯(lián)用時(shí)可增加INH的活性，并可延遲INH及鏈霉素的耐藥性[11]，在與INH聯(lián)合使用時(shí)可提高部分復(fù)治、難治及耐藥肺結(jié)核患者的治療效果[12]。本研究中，INH耐藥患者對PAS的耐藥率為11.90%，與Li等[3]研究結(jié)果(11.90%)一致，且與患者是否為耐多藥有關(guān)，說明INH耐藥結(jié)核病患者對PAS的耐藥率并不低，應(yīng)重視耐多藥患者的藥敏試驗(yàn)結(jié)果。但隨著抗結(jié)核新藥的問世及越來越多的臨床研究，PAS在耐多藥結(jié)核病治療中的地位逐漸降低[13]，其耐藥率也呈逐年下降趨勢[14]。筆者認(rèn)為，隨著PAS使用率的降低，需要進(jìn)一步考慮其用藥定位，加之其在INH耐藥結(jié)核病患者中的耐藥率較高，建議在準(zhǔn)確藥敏試驗(yàn)結(jié)果支持下使用，并應(yīng)考慮既往用藥史及與耐藥結(jié)核病患者接觸史等。

Pto也因新型抗結(jié)核藥物的出現(xiàn)而使用減少，但因新型藥品價(jià)格及可獲得性問題，其在我國仍被用于耐藥結(jié)核病的治療。本研究INH耐藥患者中，Pto的耐藥率僅為3.89%，與趙冰等[15]調(diào)查的我國耐多藥結(jié)核病患者Pto耐藥率(3.2%)基本接近，提示Pto在我國的耐藥率較低，但并未表現(xiàn)出隨時(shí)間延長而降低的趨勢。雖然Pto是INH的類似物，但其與INH的耐藥分子機(jī)制并不完全相同，Pto的耐藥機(jī)制可能包括了inhA、ethA、ethR等基因突變[16]。宋艷華等[17]研究顯示，Pto耐藥MTB菌株中inhA基因突變率較低，約為20%左右；Tan等[18]研究我國南部地區(qū)282株MTB分離株，發(fā)現(xiàn)inhA基因突變率達(dá)59.4%，且16.3%的菌株對Pto耐藥，51.4%的菌株存在ethA基因突變。這提示inhA基因突變可能只是耐多藥結(jié)核病患者Pto耐藥的原因之一，而且可能存在地域性差異。另外，不同研究報(bào)道Pto耐藥MTB的inhA基因突變率是不同的，Lee等[19]對朝鮮地區(qū)206例存在katG及inhA基因突變的患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)Pto耐藥MTB的inhA基因突變率為61.8%；而Islam等[20]研究中在INH和Pto均耐藥的MTB中inhA基因突變率為33.5%，與本研究(35.00%)接近，但本研究證實(shí)了inhA基因突變與Pto耐藥的一致性較差，提示inhA基因突變可能不是Pto耐藥的主要分子機(jī)制，臨床使用Pto時(shí)應(yīng)參照表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果，在使用分子生物學(xué)手段檢測MTB對Pto耐藥性時(shí)也應(yīng)檢測更多的基因突變位點(diǎn)。

綜上，INH耐藥肺結(jié)核患者katG及inhA基因突變率較高，對PAS耐藥率較高，但對Pto耐藥率較低；inhA基因突變與Pto耐藥的一致性較差，可能存在其他耐藥基因，后續(xù)應(yīng)對Pto其他耐藥基因突變位點(diǎn)進(jìn)一步研究。