逄宇 高興輝 湯一葦 高孟秋

結(jié)核病是全球重大公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。世界衛(wèi)生組織估算全球每年新發(fā)結(jié)核病患者超過(guò)1000萬(wàn)例，死亡患者超過(guò)140萬(wàn)例，有效遏制結(jié)核病需要新型的防控技術(shù)[1-2]。人群暴露于結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)環(huán)境中后發(fā)生結(jié)核感染，但無(wú)臨床癥狀，成為潛伏感染者，部分潛伏感染者在后期發(fā)展成活動(dòng)性結(jié)核病患者，在人群感染結(jié)核分枝桿菌的過(guò)程中，存在兩個(gè)主要狀態(tài)：(1)是否能夠清除入侵的結(jié)核分枝桿菌；(2)感染結(jié)核分枝桿菌的潛伏感染者是否會(huì)發(fā)病[3-4]。在這兩個(gè)過(guò)程中，宿主的免疫系統(tǒng)都發(fā)揮至關(guān)重要的作用。其中入侵宿主的結(jié)核分枝桿菌激發(fā)感染性遲發(fā)型超敏反應(yīng)，即由效應(yīng)性T細(xì)胞與相應(yīng)抗原作用后，引起的以單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)和組織細(xì)胞損傷為主要特征的炎癥反應(yīng)[3]。一方面，遲發(fā)型超敏反應(yīng)能夠保護(hù)患者在接受到抗原刺激后迅速應(yīng)答以實(shí)現(xiàn)清除病原的目的；另一方面，肺結(jié)核患者對(duì)結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生T細(xì)胞免疫可導(dǎo)致自身組織損傷，形成干酪樣壞死和肺空洞，精準(zhǔn)調(diào)控免疫應(yīng)答的保護(hù)和損傷作用的動(dòng)態(tài)平衡是提高患者治療效果的重要方面[5]。

當(dāng)前結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷仍然是以病原學(xué)為主，通過(guò)檢測(cè)到結(jié)核分枝桿菌或其核酸，為臨床診斷結(jié)核病提供重要的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)[2]。雖然病原學(xué)檢測(cè)被視為結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷的可靠方法，但是超過(guò)半數(shù)患者無(wú)法找到確定的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)，提示亟待開(kāi)發(fā)新型的診斷技術(shù)滿足日益增長(zhǎng)的臨床需求[6]。培養(yǎng)是結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，其成本低廉也是其顯著優(yōu)勢(shì)，但是培養(yǎng)方法自身的缺點(diǎn)也成為制約其在基層實(shí)驗(yàn)室推廣使用的主要限制因素[6-7]。結(jié)核分枝桿菌是高致病性病原微生物，開(kāi)展結(jié)核分枝桿菌的實(shí)驗(yàn)需要符合特殊生物安全標(biāo)準(zhǔn)，這也成為制約分枝桿菌培養(yǎng)在基層推廣的重要因素；最后，培養(yǎng)操作相對(duì)繁瑣，對(duì)實(shí)驗(yàn)室操作人員的熟練程度要求較高[8]。近些年多種分子生物技術(shù)在結(jié)核病及耐藥結(jié)核病早期診斷方面發(fā)揮重要作用[2,9]。但是與傳統(tǒng)的培養(yǎng)相比，其高敏感度造成的特異度稍差可能造成臨床診斷困難；此外，由于DNA的高穩(wěn)定性，基于DNA的檢測(cè)方法難以區(qū)分結(jié)核分枝桿菌的死活，限制了分子生物學(xué)診斷技術(shù)在結(jié)核病患者療效評(píng)價(jià)中的應(yīng)用[2]。對(duì)于部分早期診斷的肺結(jié)核患者，缺乏臨床癥狀且無(wú)法排出高質(zhì)量的痰，也造成了分子生物學(xué)診斷技術(shù)在痰菌陰性肺結(jié)核診斷中的困境[6]。免疫學(xué)診斷技術(shù)目前是輔助結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷的重要方面[10]。結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(tuberculin skin test, TST)和結(jié)核特異性γ-干擾素釋放試驗(yàn)(interferon-gamma release assay，IGRA)是目前應(yīng)用最廣泛的結(jié)核病免疫學(xué)診斷技術(shù)，在《WS 288—2017 肺結(jié)核診斷》[11]中作為活動(dòng)性結(jié)核病的輔助診斷技術(shù)。但由于僅對(duì)結(jié)核抗原刺激的遲發(fā)型超敏反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)法區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病和潛伏感染者，這導(dǎo)致兩種方法在結(jié)核病診斷方面的特異度較低。近年來(lái)，聚焦于提高結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷，特別是痰菌陰性肺結(jié)核診斷，充分發(fā)掘宿主抗結(jié)核的特異性應(yīng)答反應(yīng)，尋找新型的免疫學(xué)診斷標(biāo)志物或標(biāo)志物組合用于結(jié)核病診斷成為未來(lái)重要方向。本文系統(tǒng)梳理了結(jié)核病宿主反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)展及其臨床應(yīng)用。

一、結(jié)核病宿主反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

(一)TST

TST是1907年奧地利科學(xué)家Von Pirquet提出的，其基本原理是通過(guò)皮內(nèi)注射結(jié)核菌素，并根據(jù)注射部位的皮膚狀況診斷結(jié)核分枝桿菌感染所致Ⅳ型超敏反應(yīng)的皮內(nèi)試驗(yàn)[12]。在過(guò)去TST一直用于識(shí)別結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的風(fēng)險(xiǎn)人群，但TST的主要問(wèn)題是高水平的假陽(yáng)性結(jié)果，是由于TST無(wú)法區(qū)分結(jié)核分枝桿菌感染和接觸非結(jié)核分枝桿菌或接種卡介苗引起的陽(yáng)性反應(yīng)，這兩種假陽(yáng)性反應(yīng)通常歸因于由卡介苗接種或環(huán)境分枝桿菌的同源抗原觸發(fā)的免疫反應(yīng)[13]。TST特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，無(wú)需特殊設(shè)備，是臨床上常用的輔助診斷結(jié)核病方法，其敏感度約為68%～95%，特異度約為96%～99%[14]。其敏感度受注射結(jié)核菌素的效力和劑量、感染后間隔時(shí)間、脫敏、故意干擾、產(chǎn)后免疫抑制和觀察者變異的影響。特異度受鳥(niǎo)分枝桿菌、副結(jié)核分枝桿菌和環(huán)境分枝桿菌的致敏作用以及皮膚結(jié)核的影響[14]。TST可用于結(jié)核病流行情況的調(diào)查和監(jiān)測(cè)，通過(guò)該試驗(yàn)可獲得一個(gè)地區(qū)結(jié)核感染和結(jié)核分枝桿菌的傳播情況；可為接種卡介苗提供依據(jù)并監(jiān)測(cè)卡介苗的免疫效果與質(zhì)量；可輔助結(jié)核病診斷和鑒別診斷，對(duì)于臨床疑似結(jié)核病患者，若陽(yáng)性反應(yīng)可支持結(jié)核病的診斷，若陰性反應(yīng)則說(shuō)明結(jié)核病可能性較小，但陰性反應(yīng)不能排除其他情況導(dǎo)致，如免疫缺陷、營(yíng)養(yǎng)不良、炎癥或全身播散性結(jié)核病、肺炎、腫瘤、病毒感染等[15]。重組結(jié)核桿菌融合蛋白(EC)是一種新型的皮膚試驗(yàn)產(chǎn)品，在結(jié)核病患者中EC具有良好的敏感度(90.64%)，與TST具有較高的一致性；在未感染結(jié)核分枝桿菌人員中EC的兩次檢測(cè)陰性一致率較高(88.20%)；在非結(jié)核性疾病患者中EC的陰性符合率較高(73.10%)，與T-SPOT.TB的一致性較好；同時(shí)不受卡介苗接種的影響[16-19]。

(二)IGRA

IGRA的基本原理是機(jī)體感染結(jié)核分枝桿菌以后，存于血液中的特異性T淋巴細(xì)胞會(huì)在再次接觸結(jié)核分枝桿菌特異性抗原(如早期分泌抗原靶6和培養(yǎng)濾液蛋白10等)時(shí)，T細(xì)胞活化并分泌相應(yīng)的細(xì)胞因子γ干擾素，通過(guò)對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞和γ干擾素的檢測(cè)，判斷機(jī)體被結(jié)核分枝桿菌感染的風(fēng)險(xiǎn)[20]。IGRA包括干擾素體外釋放酶聯(lián)免疫法和體外酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)，前者檢測(cè)γ干擾素產(chǎn)生水平，后者檢測(cè)產(chǎn)生γ干擾素細(xì)胞的數(shù)量，這兩種檢測(cè)方法不受卡介苗接種的影響，可以區(qū)分結(jié)核分枝桿菌感染與非結(jié)核分枝桿菌感染，診斷結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的敏感度為70%～80%，特異度為88%～97%[21]。

1． 干擾素體外釋放酶聯(lián)免疫法：干擾素體外釋放酶聯(lián)免疫法產(chǎn)品目前主要有QuantiFERON-TB (QFT)、QuantiFERON-TB gold (QFT-G)、QuantiFERON-TB gold in-tube(QFT-GIT)、Quanti-FERON-TB gold plus(QFT-G Plus)等檢測(cè)產(chǎn)品。QFT是2001年美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的第一代用于診斷結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的IGRA試劑盒，它是利用來(lái)自結(jié)核分枝桿菌的PPD刺激全血細(xì)胞，檢測(cè)活化T細(xì)胞分泌產(chǎn)生γ-干擾素。QFT-G是第二代的IGRA試劑盒，刺激全血細(xì)胞的PPD換成了結(jié)核分枝桿菌特異性抗原——結(jié)核分枝桿菌早期分泌抗原靶6和培養(yǎng)濾液蛋白10，這些抗原不能被卡介苗和非結(jié)核分枝桿菌編碼，對(duì)結(jié)核分枝桿菌的特異性更高。QFT-GIT是第三代IGRA試劑盒，它利用結(jié)核分枝桿菌的早期分泌抗原靶6、培養(yǎng)濾液蛋白-10、特異性抗原TB7.7，去刺激患者免疫T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生γ-干擾素，對(duì)γ-干擾素進(jìn)行定量測(cè)定[22]。QFT-GIT對(duì)兒童和成人活動(dòng)性肺結(jié)核的診斷敏感度與特異度分別為83.9%和88.5%、73.7%和70.4%，QFT-GIT診斷結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的敏感度為70%，特異度在未接種卡介苗者為99%，接受卡介苗治療的患者為96%[23]。QFT-G Plus是最新一代IGRA試劑盒，QFT-Plus的新穎之處在于，除了CD4+T細(xì)胞外，它還誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)答，從而比QFT-GIT從T細(xì)胞亞群獲得更廣泛的應(yīng)答。它的目的是提高結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的檢測(cè)，特別是在最近接觸者、免疫功能低下的宿主和幼兒人群中[24]。在治愈肺結(jié)核患者中，QFT-G Plus陽(yáng)性率為82.0%，高于QFT-GIT(73.0%)。在隱匿性結(jié)核病感染中 QFT-GIT與QFT-G Plus檢測(cè)結(jié)果一致性較高。與QFT-GIT相比，QFT-G Plus與結(jié)核病疑似患者的替代指標(biāo)有更強(qiáng)的相關(guān)性。在老年人中，QFT-G Plus檢測(cè)結(jié)果比QFT-GIT有更高的敏感度。QFT-G Plus總的敏感度、特異度、陽(yáng)性似然比、陰性似然比和診斷優(yōu)勢(shì)比分別為94%、96%、24.4、0.05和414，ROC曲線下面積為0.99[25]。QFT-GIT和QFT-G Plus在活動(dòng)性結(jié)核病患者中的敏感度差異在所有研究中都不顯著。在高危人群中，QFT-G Plus和QFT-GIT之間的一致性為89.9%～96.0%，低風(fēng)險(xiǎn)人群中QFT-Plus的特異度略低于QFT-GIT[10]。QFT-G Plus對(duì)活動(dòng)性結(jié)核病的聯(lián)合敏感度為94.0%，而對(duì)健康人的聯(lián)合特異度為96.0%。結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的聯(lián)合敏感度和特異度分別為91.0%和95.0%[26]。

2.干擾素體外酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)：酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)是用于測(cè)定分泌特異性抗體或細(xì)胞因子的單個(gè)細(xì)胞對(duì)特異性抗原的應(yīng)答能力及產(chǎn)生應(yīng)答的細(xì)胞數(shù)量。常用的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)是T-SPOT.TB試劑盒。在診斷結(jié)核分枝桿菌潛伏感染人群的研究中，QFT-G的敏感度為64.2%，特異度為99.6%，T-SPOT.TB的敏感度為50.0%，特異度為90.6%，TST的敏感度為70.9%，特異度為68.3%，T-SPOT.TB的特異度較高，敏感度較差[27]。 在兒童結(jié)核病的診斷中，T-SPOT.TB敏感度為84.0%，特異度為99.1%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為93.1%，陰性預(yù)測(cè)值為97.8%。T-SPOT.TB診斷肺結(jié)核敏感度顯著高于肺外結(jié)核，同時(shí)T-SPOT.TB的敏感度隨著年齡的增長(zhǎng)而增加[28]。在診斷血液透析患者的結(jié)核分枝桿菌潛伏感染方面，TST的敏感度為31%，特異度為63%； QFT-G試驗(yàn)的聯(lián)合敏感度為53%，特異度為69%；T-SPOT.TB的敏感度為50%，特異度為67%[29]。IGRA和TST在兒童、免疫缺陷人群和結(jié)核病高發(fā)國(guó)家新移民人群的17項(xiàng)研究中，發(fā)現(xiàn)在兩項(xiàng)兒童研究中，QFT-GIT和TST(≥5 mm)之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但其他兩項(xiàng)研究顯示QFT-GIT在識(shí)別結(jié)核分枝桿菌潛伏感染方面優(yōu)于TST(≥10 mm)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在免疫功能低下者中，IGRA(T-SPOT.TB)在鑒別結(jié)核分枝桿菌潛伏感染患者方面，與TST(≥10 mm)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在結(jié)核病高發(fā)國(guó)家新移民人群進(jìn)行的兩項(xiàng)研究結(jié)果不一致，具有高度異質(zhì)性(表1和表2)[30]。

表1 IGRA與TST在兒童、免疫缺陷人群和結(jié)核病高發(fā)國(guó)家新移民人群中活動(dòng)性結(jié)核病發(fā)病率研究的偏倚風(fēng)險(xiǎn)(參考文獻(xiàn)[30])

表2 兒童、免疫缺陷人群和結(jié)核病高發(fā)國(guó)家新移民人群中通過(guò)結(jié)核分枝桿菌潛伏感染檢測(cè)(IGRA與TST)后進(jìn)展為結(jié)核病(參考文獻(xiàn)[30])

續(xù)表2

(三)IFN-γ/IL-2雙因子試驗(yàn)

Essone等[31]評(píng)價(jià)INF-γ/IL-2雙因子試驗(yàn)在肺結(jié)核的診斷與治療反應(yīng)相關(guān)研究結(jié)果提示，同時(shí)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌特異性γ-IFN和IL-2水平可能增加活動(dòng)性結(jié)核病的診斷敏感度。有研究發(fā)現(xiàn)活動(dòng)性結(jié)核病患者的IFN-γ+IL-2-T 細(xì)胞中位頻率和比例顯著高于非活動(dòng)性結(jié)核病患者，且IFN-γ+IL-2-T 細(xì)胞診斷活動(dòng)性結(jié)核病的受試者工作特征(ROC)曲線下面積為0.788，聯(lián)合IFN-γ+IL-2-T 細(xì)胞的頻率和比例診斷活動(dòng)性結(jié)核病的敏感度從79.7%提高到95.3%，特異度從69.8%提高到83.2%[32-33]。IFN-γ/IL-2雙因子試驗(yàn)結(jié)果有待進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。

(四)宿主轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)

對(duì)血漿中結(jié)核病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子分析可以對(duì)結(jié)核病診斷、鑒別診斷及其治療效果檢測(cè)起到一定作用。目前對(duì)結(jié)核病的血液轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)干擾素誘導(dǎo)的基因信號(hào)在成功治療后表達(dá)減少，這有助于改善結(jié)核病的診斷和治療監(jiān)測(cè)，這對(duì)根除結(jié)核病至關(guān)重要。同時(shí)分析各種不同的血液轉(zhuǎn)錄特征，被提議用于結(jié)核病的診斷和無(wú)癥狀高危人群的鑒定，并提出了新的方法來(lái)開(kāi)發(fā)這種生物標(biāo)記物用于臨床[34]。Berry等[35]通過(guò)轉(zhuǎn)錄芯片技術(shù)對(duì)活動(dòng)性結(jié)核病患者和結(jié)核分枝桿菌潛伏感染者的全血中393種轉(zhuǎn)錄因子水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其與疾病的放射結(jié)果相關(guān)，并在治療后恢復(fù)到健康對(duì)照組的水平。同時(shí)發(fā)現(xiàn)86種轉(zhuǎn)錄因子水平在活動(dòng)性結(jié)核病與其他炎癥或感染性患者之間有顯著差異。通過(guò)模塊化和通路分析顯示，結(jié)核病的特征是由中性粒細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的干擾素誘導(dǎo)的基因譜決定的，包括IFN-γ和Ⅰ型IFN-α信號(hào)通路。此研究揭示了Ⅰ型IFN-α信號(hào)通路在結(jié)核病發(fā)病機(jī)制中的作用，促進(jìn)結(jié)核病疫苗和治療的發(fā)展，還提供了廣泛的轉(zhuǎn)錄生物標(biāo)志物，有可能作為診斷和預(yù)測(cè)結(jié)核病流行的工具[35-36]。結(jié)核病患者和結(jié)核分枝桿菌潛伏感染者的全血微陣列基因研究發(fā)現(xiàn)， FCGRIB、CD64、 LTF、GBP5和顆粒酶A的差異表達(dá)最顯著，5個(gè)標(biāo)記物聯(lián)合診斷的敏感度為94%，特異度為97%，有利于活動(dòng)性結(jié)核病和結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的鑒別診斷[37]。同時(shí)確定了活動(dòng)性結(jié)核病特有的差異表達(dá)基因，及其與結(jié)核病易感性和耐藥性相關(guān)的基因譜。此研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)的基因表達(dá)譜有利于更好地理解從潛伏感染到活動(dòng)性疾病的進(jìn)展，并為結(jié)核病保護(hù)提供方法[37]。在HIV與結(jié)核混合感染患者血液轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜中，Kaforou等[38]建立了27個(gè)轉(zhuǎn)錄因子集，用于區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病和結(jié)核分枝桿菌潛伏感染，其敏感度為95%，特異度為90%；44個(gè)轉(zhuǎn)錄因子集，用于區(qū)分結(jié)核與其他疾病，其敏感度為93%，特異度為88%。血液轉(zhuǎn)錄因子集能把結(jié)核病從艾滋病病毒感染和未感染人群的其他疾病中區(qū)分出來(lái)，未來(lái)有可能作為一種適合于HIV流行國(guó)家的結(jié)核病檢測(cè)方法。結(jié)核病患者中15個(gè)宿主基因表達(dá)可準(zhǔn)確區(qū)分結(jié)核病患者與TST陽(yáng)性和TST陰性患者，因此有望作為生物標(biāo)志物將埃塞俄比亞的活動(dòng)性結(jié)核病與結(jié)核分枝桿菌潛伏感染進(jìn)行分類。當(dāng)ROC曲線臨界值≥0.80時(shí)，F(xiàn)CGR1A是區(qū)分結(jié)核分枝桿菌潛伏感染和結(jié)核病的唯一標(biāo)志物，與HIV感染狀況無(wú)關(guān)。隨著結(jié)核分枝桿菌的RNA檢測(cè)技術(shù)不斷發(fā)展，結(jié)核病診斷準(zhǔn)確性和實(shí)用性得到不斷拓展[39-40]。

在基于宿主反應(yīng)的結(jié)核病診斷基因meta分析研究[41]發(fā)現(xiàn) 11個(gè)培養(yǎng)證實(shí)診斷活動(dòng)性結(jié)核病患者研究的加權(quán)平均ROC曲線下面積>0.80，2個(gè)研究的加權(quán)平均ROC曲線下面積為0.60。除2個(gè)研究外，其他研究均具有高陰性預(yù)測(cè)值(2%患病率時(shí)>98%)。除了3個(gè)使用培養(yǎng)證實(shí)為活動(dòng)性結(jié)核病研究外，臨床診斷為活動(dòng)性結(jié)核病的所有研究的加權(quán)平均ROC曲線下面積和特異度降低最小。當(dāng)包括臨床診斷為活動(dòng)性結(jié)核病的數(shù)據(jù)集時(shí)，只有4個(gè)研究具有均勻的診斷優(yōu)勢(shì)比和較低的假陽(yáng)性率；其他研究要么具有異質(zhì)的診斷優(yōu)勢(shì)比或較高的假陽(yáng)性率，要么兩者兼有。同時(shí)16個(gè)基因研究中有7個(gè)預(yù)測(cè)了痰轉(zhuǎn)換前6個(gè)月結(jié)核分枝桿菌潛伏感染到活動(dòng)性結(jié)核病進(jìn)展，其陽(yáng)性預(yù)測(cè)值>6%(患病率為2%時(shí))?？傊?，基于宿主反應(yīng)的診斷方法可以準(zhǔn)確地識(shí)別活動(dòng)性結(jié)核病患者，并在痰轉(zhuǎn)換前預(yù)測(cè)結(jié)核分枝桿菌潛伏感染進(jìn)展為活動(dòng)性結(jié)核病的高危個(gè)體。診斷組合中增加檢測(cè)基因的數(shù)量并不一定提高診斷的準(zhǔn)確性。到目前為止，Sweeney團(tuán)隊(duì)篩選的標(biāo)志物組合具有最佳的診斷效能[41]。基于宿主反應(yīng)的結(jié)核病診斷對(duì)實(shí)現(xiàn)世界衛(wèi)生組織2035年終止結(jié)核病的目標(biāo)方面提供了有力的證據(jù)，并且有利于臨床應(yīng)用 (表3和表4)[41]。結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)試劑盒(IP-10.TBTM)是新一代結(jié)核病診斷產(chǎn)品，利用實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)體外檢測(cè)全血樣本中經(jīng)結(jié)核特異性抗原刺激前后IP-10 m RNA水平，并據(jù)此判斷人體是否有針對(duì)結(jié)核特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)[42-43]，檢測(cè)性能有待進(jìn)一步評(píng)估和驗(yàn)證。

表3 應(yīng)用雙變量薈萃分析比較用于診斷活動(dòng)性結(jié)核病的16個(gè)基因特征 (參考文獻(xiàn)[41])

表4 青少年隊(duì)列研究中診斷前180天從結(jié)核分枝桿菌潛伏感染進(jìn)展到活動(dòng)性結(jié)核病的ROC曲線下面積、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值 (參考文獻(xiàn)[41])

(五)結(jié)核病宿主反應(yīng)試劑盒

TB Host response試劑盒是通過(guò)計(jì)算結(jié)核分?jǐn)?shù)(TB-scores)進(jìn)行檢測(cè)，TB-scores是由Sweeney團(tuán)隊(duì)通過(guò)篩選了2572例結(jié)核病患者全血中結(jié)核感染相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子水平發(fā)現(xiàn)的，其定義為TB-scores=(GBP5+DUSP3)/2-KLF2，可用于結(jié)核分枝桿菌潛伏感染和活動(dòng)性結(jié)核病的鑒別診斷以及治療效果的快速準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)[44]。在結(jié)核病患病率為4%的情況下，TB-scores診斷活動(dòng)性結(jié)核病方面的敏感度為90%、特異度為70%和陰性預(yù)測(cè)值為99.3%，如果結(jié)果為陰性，基本排除是活動(dòng)性結(jié)核病[45]。目前Xpert MTB Host response試劑盒采用利用這個(gè)技術(shù)進(jìn)行TB-scores計(jì)算，該試劑盒采用0.1 ml末梢或采集靜脈血，隨到隨測(cè)，可以在30 min完成檢測(cè)。該試劑盒在HIV混合結(jié)核感染人群的鑒別診斷方面，其敏感度約為90%，與微生物綜合參考標(biāo)準(zhǔn)相比，其特異度為55.8%；與Xpert MTB/RIF相比，其特異度為85.9%。在獨(dú)立診斷方面，在該試劑盒的特異度接近95%時(shí)，其敏感度為65.7%，而C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP))的敏感度僅為13.6%[46]。肺結(jié)核患者的TB-scores顯著低于對(duì)照組人群，Xpert MTB Host response在區(qū)分肺結(jié)核患者和對(duì)照組時(shí)，其ROC曲線下面積為0.84；在敏感度為90%時(shí)，Xpert MTB Host response的特異度(53.0%)顯著高于CRP(28.1%)。在Xpert MTB/RIF半定量為中或高負(fù)荷的肺結(jié)核患者中，Xpert MTB Host response的敏感度較高(96.8%)，而CRP敏感度為90.3%[47]。

Xpert MTB Host response試劑盒的出現(xiàn)，為無(wú)痰樣本的疑似結(jié)核病患者在快速篩查、鑒別診斷以及治療監(jiān)測(cè)方面提供新的便利的檢測(cè)方法，可改善結(jié)核病目前的檢測(cè)困境[46]，期待更多地對(duì)不同人群及其對(duì)肺外結(jié)核患者的不同臨床應(yīng)用的研究成果問(wèn)世。

二、結(jié)核病宿主反應(yīng)臨床應(yīng)用

雖然標(biāo)本中直接查到結(jié)核分枝桿菌病原學(xué)依據(jù)是診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)，但是臨床實(shí)踐中不是所有結(jié)核病患者都可以獲得來(lái)自病灶的標(biāo)本供病原學(xué)檢測(cè)，比如肺內(nèi)病變遠(yuǎn)離支氣管、比較局限且有完整包膜，病灶與支氣管、氣管不通，痰標(biāo)本中不可能有來(lái)源于病灶的結(jié)核分枝桿菌；有些肺外結(jié)核病灶部位特殊，不適于穿刺活檢獲得來(lái)自于病灶的標(biāo)本，比如顱內(nèi)結(jié)核瘤。對(duì)處于潛伏感染及感染階段的結(jié)核病，菌量少，未形成病灶或病灶較小，低于現(xiàn)有檢查手段的分辨率的下限，臨床檢查未發(fā)現(xiàn)病灶，亦無(wú)可供病原學(xué)檢測(cè)的標(biāo)本。利用檢測(cè)宿主感染結(jié)核分枝桿菌后產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，間接證明體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的存在，是臨床診斷結(jié)核病的重要依據(jù)。

(一)結(jié)核病篩查

結(jié)核病經(jīng)呼吸道傳播，排菌的肺結(jié)核患者是傳染源。未經(jīng)有效治療的患者痰標(biāo)本中獲得病原學(xué)診斷依據(jù)就意味著患者作為傳染源已經(jīng)對(duì)密切接觸人群造成很大的傳播風(fēng)險(xiǎn)。利用宿主對(duì)結(jié)核分枝桿菌的免疫反應(yīng)，主動(dòng)篩查結(jié)核分枝桿菌潛伏感染人群、有/或無(wú)結(jié)核中毒癥狀的結(jié)核病疑似患者，做到早期診斷，早期干預(yù)治療，杜絕發(fā)展成為排菌患者(傳染源)無(wú)疑是控制結(jié)核病傳播的重要手段。

結(jié)核病篩查分為主動(dòng)篩查及被動(dòng)篩查，主動(dòng)篩查即對(duì)無(wú)癥狀的高風(fēng)險(xiǎn)人群進(jìn)行定期結(jié)核病相關(guān)檢查，被動(dòng)篩查為患者出現(xiàn)結(jié)核疑似癥狀(咳嗽、咳痰2周以上或咯血)或發(fā)現(xiàn)可疑結(jié)核病灶，進(jìn)一步進(jìn)行結(jié)核病相關(guān)檢查。宿主對(duì)結(jié)核分枝桿菌的免疫反應(yīng)相關(guān)檢查方法(TST或IGRA)由于標(biāo)本采集簡(jiǎn)單、可行(皮試或靜脈采血)、避免放射檢查方法對(duì)特殊人群(15歲以下兒童)造成傷害，成為結(jié)核病篩查的首選方法。根據(jù)《中國(guó)結(jié)核病預(yù)防控制工作技術(shù)規(guī)范(2020年版)》要求[48]，在中國(guó)疫情背景下需要主動(dòng)篩查的人群包括：(1)艾滋病病毒感染人群；(2)學(xué)校人群；(3)流動(dòng)人口；(4)病原學(xué)陽(yáng)性肺結(jié)核患者密切接觸者，尤其是5歲以下兒童；(5)老年人；(6)糖尿病患者； (7)羈押人群；(8)其他人群：需使用腫瘤壞死因子治療、長(zhǎng)期應(yīng)用透析治療、準(zhǔn)備做器官移植或骨髓移植者、矽肺患者以及長(zhǎng)期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素或其他免疫抑制劑的患者。需要特別注意的是對(duì)于存在免疫抑制的患者，宿主對(duì)結(jié)核分枝桿菌的免疫反應(yīng)亦可能受到抑制而出現(xiàn)假陰性的情況，臨床需要結(jié)合患者流行病學(xué)史、癥狀、其他檢查情況等綜合判斷。

(二)區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病與結(jié)核分枝桿菌潛伏感染

結(jié)核分枝桿菌潛伏感染及活動(dòng)性結(jié)核病是結(jié)核病發(fā)生、發(fā)展的不同階段，宿主對(duì)結(jié)核分枝桿菌的免疫反應(yīng)處于不同的狀態(tài)。Petruccioli等[49]研究者納入57例受試者，其中27例活動(dòng)性結(jié)核病患者、 30例結(jié)核分枝桿菌潛伏感染者，通過(guò)流式細(xì)胞儀及細(xì)胞染色，對(duì)QFT-Plus管中結(jié)核分枝桿菌抗原產(chǎn)生反應(yīng)的特異性CD4+T細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示在活動(dòng)性結(jié)核病和結(jié)核分枝桿菌潛伏感染患者中檢測(cè)到特異性的CD4+T細(xì)胞反應(yīng)，而特異性的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答主要與活動(dòng)性結(jié)核病相關(guān)。在潛伏感染和活動(dòng)性肺結(jié)核中CD4+T和CD8+T細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后應(yīng)答的差異，可能成為區(qū)分潛伏感染和活動(dòng)性結(jié)核病的標(biāo)志，但上述結(jié)論尚缺乏大規(guī)模人群的臨床驗(yàn)證。目前已經(jīng)上市的產(chǎn)品尚未獲得有效區(qū)分結(jié)核分枝桿菌潛伏感染和活動(dòng)性結(jié)核病的適應(yīng)證。

(三)療效監(jiān)測(cè)

經(jīng)過(guò)有效治療后的結(jié)核病患者，一方面體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的負(fù)荷量發(fā)生了明顯的變化，另一方面隨著菌量下降，患者結(jié)核中毒癥狀、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)發(fā)生了很大變化，機(jī)體的免疫狀態(tài)也發(fā)生了變化。雖然痰菌陰轉(zhuǎn)率是肺結(jié)核治療轉(zhuǎn)歸的金標(biāo)準(zhǔn)，但是不適用于不排菌狀態(tài)的臨床診斷肺結(jié)核患者；雖然影像可以形象地顯示病灶轉(zhuǎn)歸，但是需要有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)生判斷，臨床急需要一種簡(jiǎn)單易行的檢測(cè)方法觀察療效。Lee等[50]招募了336名(例)參與者(118名無(wú)感染接觸者，105名結(jié)核分枝桿菌潛伏感染者，113例活動(dòng)性肺結(jié)核)，以QFT-Plus檢測(cè)的CD8應(yīng)答在未感染接觸者、結(jié)核分枝桿菌潛伏感染接觸者和活動(dòng)性結(jié)核病之間不同且呈遞增的趨勢(shì)；CD8應(yīng)答在培養(yǎng)確診的活動(dòng)性結(jié)核病患者中高于組織確診的活動(dòng)性結(jié)核病患者。作者結(jié)論為通過(guò)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)CD8特異性淋巴細(xì)胞的反應(yīng)，有望作為一個(gè)結(jié)核病活動(dòng)程度的潛在生物標(biāo)志物。目前宿主免疫反應(yīng)標(biāo)志物在療效監(jiān)測(cè)的應(yīng)用尚缺乏大規(guī)模隊(duì)列研究的支持。

(四) 特殊人群的輔助診斷

免疫缺陷患者、器官移植患者、HIV感染者由于機(jī)體免疫系統(tǒng)受到抑制，成為結(jié)核病易感高危人群，一旦感染結(jié)核分枝桿菌易發(fā)展成為重癥結(jié)核病，在HIV感染者中，并發(fā)結(jié)核病成為主要致死原因。利用宿主免疫反應(yīng)早期診斷結(jié)核病、早期給予有效治療是改善免疫抑制人群合并結(jié)核感染預(yù)后的重要手段。宿主免疫反應(yīng)是利用機(jī)體特異性淋巴細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異性蛋白的識(shí)別來(lái)實(shí)現(xiàn)的，雖然機(jī)體存在的免疫抑制情況影響了體內(nèi)免疫反應(yīng)(TST)結(jié)果，但對(duì)于采用體外免疫反應(yīng)的IGRA試驗(yàn)，由于采用淋巴細(xì)胞體外分離培養(yǎng)技術(shù)，避免了體內(nèi)免疫抑制狀態(tài)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。而基于ELISPOT 技術(shù)由于在檢測(cè)過(guò)程中對(duì)單個(gè)核細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化，消除了淋巴細(xì)胞減少對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，更適用于CD4+T細(xì)胞減少人群。2011年Cattamanchi等[51]的meta分析結(jié)果為在HIV感染人群中宿主免疫反應(yīng)診斷結(jié)核感染的敏感度，T-SPOT.TB為 72%(95%CI： 62%～81%)， QFT-GIT 為61%(95%CI： 41%～75%)，兩種體外免疫檢測(cè)方法均優(yōu)于TST。Jiang等[52]觀察到在中國(guó)BCG普遍接種的背景下，在HIV感染人群中當(dāng)CD4+T細(xì)胞<500/μl時(shí)，T-SPOT.TB和TST診斷活動(dòng)性結(jié)核病的敏感度分別為64.5%和22.6%，診斷結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的敏感度為 62.2%和29.7%；Petruccioli等[53]研究者在HIV感染并發(fā)結(jié)核病及單純結(jié)核病患者中觀察到以QFT-Plus檢測(cè)方法診斷結(jié)核感染的敏感度分別為81.8%和86.8%。在免疫抑制人群中，宿主免疫反應(yīng)為早期診斷結(jié)核感染的重要手段，其中體外宿主免疫反應(yīng)檢測(cè)方法優(yōu)于體內(nèi)免疫反應(yīng)檢測(cè)方法；在判讀宿主免疫反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果時(shí)需要結(jié)合臨床癥狀、檢測(cè)方法和患者的免疫背景。

三、總結(jié)與展望

TST一直用于識(shí)別結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的風(fēng)險(xiǎn)人群，但TST的敏感度和特異度較低，受其他因素干擾，存在較多的假陽(yáng)性結(jié)果。目前IGRA試驗(yàn)主要應(yīng)用于診斷結(jié)核分枝桿菌潛伏感染和區(qū)分結(jié)核分枝桿菌感染與其他結(jié)核分枝桿菌感染，其敏感度和特異度比TST有較大提高，但是在區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病和潛伏感染者方面診斷價(jià)值有限。結(jié)核病患者的確診需要依賴傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)，但其對(duì)菌陰結(jié)核病應(yīng)用的局限性明顯，基于新方法或者新型標(biāo)志物的診斷策略將成為菌陰結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷的主要突破方向。近年來(lái)，人們對(duì)于結(jié)核與人體免疫系統(tǒng)互作機(jī)制認(rèn)識(shí)的不斷深入，篩選出多個(gè)結(jié)核感染特異性的宿主免疫標(biāo)志物，基于這些標(biāo)志物的聯(lián)合應(yīng)用可以準(zhǔn)確鑒別診斷活動(dòng)性結(jié)核病。但與傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)方法存在差異，增加宿主基因轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)目并不與診斷準(zhǔn)確性成正比，如何在符合成本-效益的前提下優(yōu)選適宜的宿主標(biāo)志物組合是未來(lái)開(kāi)發(fā)平臺(tái)技術(shù)的核心；其次，基于宿主的診斷技術(shù)需要細(xì)胞純化及核酸檢測(cè)等步驟，限制了其在基層的使用，開(kāi)發(fā)自動(dòng)化的分子檢測(cè)平臺(tái)將是研究的首要任務(wù)；再次，目前診斷主要針對(duì)活動(dòng)性結(jié)核病患者開(kāi)展，利用宿主免疫應(yīng)答水平及時(shí)預(yù)測(cè)結(jié)核分枝桿菌潛伏感染向活動(dòng)性結(jié)核病進(jìn)展的危險(xiǎn)程度是實(shí)現(xiàn)對(duì)潛伏感染者精準(zhǔn)干預(yù)的基礎(chǔ)；第四，應(yīng)用基于宿主的免疫診斷標(biāo)志物依賴于對(duì)結(jié)核宿主互作的機(jī)制解析，但部分宿主因子對(duì)抗結(jié)核的作用機(jī)制尚不明晰，成為未來(lái)潛在的研究方向?？傊谒拗鞣磻?yīng)的結(jié)核病診斷技術(shù)有望在臨床上達(dá)到進(jìn)一步的應(yīng)用，并為實(shí)現(xiàn)世界衛(wèi)生組織在2035年提出的全球消滅結(jié)核病的宏偉目標(biāo)發(fā)揮重要作用。