徐超 韓正祥 周雷 孫波

乳腺癌是臨床較為常見的惡性腫瘤之一[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，全世界乳腺癌的每年新發(fā)病例為140萬，乳腺癌的發(fā)病率在發(fā)展中國家以及發(fā)達(dá)國家中呈逐年上升的趨勢(shì)[2]。在乳腺癌的疾病進(jìn)展中，雌激素受體(ER)和孕激素受體陽性病人的比例高達(dá)70%，在對(duì)此類病人的治療中，通過診療技術(shù)的不斷革新，其預(yù)后較好[3]。三陰性乳腺癌 (triple negative breast cancer, TNBC)主要是指ER、孕激素受體以及人表皮生長因子受體均為陰性的乳腺癌病人。研究顯示，TNBC對(duì)常規(guī)的化療方案的敏感性較差，靶向治療效果不理想[4]。成纖維細(xì)胞生長因子受體1(fibroblast growth factor receptor 1,FGFR1)在腫瘤細(xì)胞的生長以及分化過程中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。FGFR1主要通過基因的突變、差異性表達(dá)以及融合蛋白等進(jìn)一步導(dǎo)致酪氨酸酶受體活化，進(jìn)一步造成腫瘤進(jìn)展[5]。增殖細(xì)胞的相關(guān)抗原Ki67與腫瘤細(xì)胞的增殖水平具有顯著相關(guān)性[6]。本研究主要通過分析TNBC組織中FGFR1蛋白水平及Ki67表達(dá)與微血管密度(microvessel density,MVD)的關(guān)系，為疾病進(jìn)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究為前瞻性研究，以2018年5月至2019年3月在我院進(jìn)行診斷并治療的140例乳腺癌病人作為研究對(duì)象，其中TNBC病人(TNBC組)100例，非TNBC病人(非TNBC組)40例，年齡60～75歲，TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期81例，Ⅲ～Ⅳ期59例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有病人均符合乳腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；(2)病人入組前均未接受抗腫瘤治療；(3)病人的ER狀態(tài)均經(jīng)病理學(xué)結(jié)果確認(rèn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他腫瘤；(2)術(shù)前接受新輔助化療；(3)有其他腫瘤家族史。2組年齡、BMI、TNM分期差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。所有病人均簽署知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)論證通過。

表1 2組病人的基線資料比較

1.2 研究方法 對(duì)所有病人均進(jìn)行病理學(xué)活檢，將以上樣本進(jìn)行石蠟包埋后，切割成厚度為4μm的石蠟組織切片，對(duì)病人的病灶組織進(jìn)行常規(guī)脫蠟后，使用3%的過氧化氫溶液浸泡8 min，采用PBS溶液沖洗3遍，浸泡于0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液，使用微波爐對(duì)病人的抗原修復(fù)15 min，自然冷卻后，采用新鮮的FGFR1、Ki67、MVD抗體進(jìn)行滴加，在4 ℃的恒溫冰箱過夜后，再次使用PBS溶液進(jìn)行沖洗，使用聚合酶輔助劑對(duì)病人的組織標(biāo)本進(jìn)行滴加后，37 ℃恒溫培養(yǎng)30 min，再次使用PBS溶液進(jìn)行沖洗后，使用辣根酶標(biāo)記的羊抗兔以及小鼠IgG滴加，37℃恒溫培養(yǎng)30 min，采用DAB進(jìn)行顯色以及復(fù)染，使用已知的組織切片作為參照，對(duì)病人的FGFR1、Ki67、MVD水平進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)病人的染色情況進(jìn)行評(píng)分，無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分；陽性細(xì)胞的比例：病人的陽性細(xì)胞比例在5%以下為0分， 5%～25%為1分， 26%～50%為2分， 51%～75%為3分， 76%～100%為4分。以染色情況以及陽性細(xì)胞比例的乘積作為病人FGFR1、Ki67、MVD的表達(dá)量。所有免疫組化檢查均由2位高年資病理醫(yī)師雙盲判讀。

1.3 觀察內(nèi)容 (1)對(duì)TNBC組以及非TNBC組的FGFR1、Ki67、MVD水平進(jìn)行比較；(2)對(duì)不同年齡、腫瘤大小、TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移情況的FGFR1、Ki67、MVD水平進(jìn)行比較；(3)對(duì)TNBC病人的FGFR1、Ki67表達(dá)水平與MVD水平進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 2組FGFR1、Ki67、MVD水平比較 TNBC組與非TNBC組的MVD水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，TNBC組FGFR1、Ki67的表達(dá)水平均顯著高于非TNBC組(P<0.01)。見表2。

表2 2組病人的FGFR1、Ki67、MVD水平比較

2.2 TNBC組中不同病理學(xué)特征病人的FGFR1、Ki67、MVD水平比較 TNBC組中不同腫瘤大小、TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移病人之間FGFR1、Ki67、MVD水平的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同病理學(xué)特征TNBC病人FGFR1、Ki67、MVD表達(dá)水平比較

2.3 相關(guān)性分析 相關(guān)性分析顯示，TNBC病人的腫瘤大小、TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移、MVD水平與FGFR1、Ki67表達(dá)水平呈正相關(guān)(均P<0.01)。見表4。

表4 相關(guān)性分析(r)

3 討論

乳腺癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，約占女性惡性腫瘤的30%[8]。與非TNBC相比，TNBC具有較強(qiáng)的侵襲性以及進(jìn)展性,病人的生存質(zhì)量以及生存時(shí)間顯著降低。目前臨床對(duì)于TNBC發(fā)病機(jī)制的研究尚不明確，在臨床治療中，通過對(duì)腫瘤標(biāo)志物相關(guān)蛋白質(zhì)以及抗腫瘤靶向物質(zhì)的尋找成為目前基礎(chǔ)研究的重點(diǎn)。在非TNBC病人中，病人的HER-2呈現(xiàn)顯著的活性。在乳腺癌病人中，隨著病人HER-2活性的顯著升高，其對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長、分化、分裂呈現(xiàn)出顯著的催化作用。有報(bào)道指出，病人的HER-2蛋白的表達(dá)水平與腫瘤的體積、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等情況顯著相關(guān)。

在對(duì)乳腺癌病人的疾病進(jìn)展的研究表明，F(xiàn)GFR1在10%的乳腺癌病人中存在一定的擴(kuò)增，而該基因的擴(kuò)增與機(jī)體的FGFR1蛋白過度表達(dá)顯著相關(guān)。隨著機(jī)體的FGFR1蛋白水平的不斷提升[9]，乳腺癌病人的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)顯著升高，生存率下降。在較低分化的乳腺癌病人以及ER陽性的乳腺癌病人中，F(xiàn)GFR1蛋白與其生存情況存在顯著相關(guān)[10]。本研究結(jié)果顯示，與非TNBC病人相比，TNBC病人的FGFR1蛋白水平顯著升高，病人的預(yù)后較差。在正常的生理作用下，F(xiàn)GFR1蛋白的表達(dá)可顯著促進(jìn)絲裂原激活蛋白激酶以及蛋白激酶b的轉(zhuǎn)錄，最終造成管腔上皮細(xì)胞的生長以及分化[11]。在FGFR1蛋白的異常表達(dá)中，絲裂原激活蛋白激酶以及磷脂肌醇3激酶的信號(hào)被異常激活，進(jìn)而造成腫瘤細(xì)胞的異常增生。而在腫瘤細(xì)胞的異常性增生過程中，需要大量的營養(yǎng)物質(zhì)，新生血管的密度水平將顯著升高，本研究也發(fā)現(xiàn)，乳腺癌病人的FGFR1蛋白水平與MVD呈現(xiàn)顯著相關(guān)性。

Ki67在正常的乳腺組織中表達(dá)較為少見，在惡性腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平較高。有研究顯示，Ki67與惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲能力以及惡性程度顯著相關(guān)[12]。國外有研究顯示，Ki67的異常高水平表達(dá)是預(yù)后較差的重要指征，正常的乳腺組織Ki67的表達(dá)水平不會(huì)超過3%，而在乳腺癌組織的疾病進(jìn)展中，Ki67水平介于3%～14%，則有利于乳腺癌病人的生存率[13]。同時(shí)，在對(duì)TNBC病人的基因突變的分析顯示，在共線性模型中，rs3213849位點(diǎn)的G等位基因的突變，可能會(huì)造成病人的不良預(yù)后。王宇航等[14]對(duì)女性乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的研究認(rèn)為，Ki67水平的異常升高與疾病的不良預(yù)后具有顯著相關(guān)性，與本研究相互印證。

另外，在相關(guān)性分析中，病人的腫瘤大小、TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移、MVD水平與FGFR1、Ki67表達(dá)水平呈正相關(guān)(均P<0.01)；而在對(duì)TNBC以及非TNBC的MVD水平的分析中，2組病人的MVD水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示，ER不同狀態(tài)病人的MVD并不存在差異，利用MVD水平對(duì)疾病進(jìn)展的預(yù)測(cè)能力不足，而通過對(duì)病人的FGFR1、Ki67水平的檢測(cè)，可再進(jìn)一步代替MVD水平的預(yù)測(cè)能力，同時(shí)兼顧TNBC以及非TNBC病人的差異。

綜上所述，TNBC組織中FGFR1、Ki67的表達(dá)與MVD呈現(xiàn)顯著相關(guān)性，未來可通過對(duì)病人的FGFR1、Ki67聯(lián)合檢測(cè)，進(jìn)一步對(duì)病情進(jìn)展進(jìn)行分析。