戴媛 劉嘉莉 閔新栩 李蘊(yùn)凡 毛芊 丁正年

老年人感染發(fā)生率高，容易進(jìn)展為膿毒癥、感染性休克，導(dǎo)致多器官損傷和功能障礙，威脅病人生命[1]。肺臟是膿毒癥/感染性休克的重要受累器官之一[2]。研究顯示，感染導(dǎo)致的嚴(yán)重肺損傷死亡率高達(dá)27%，是ICU內(nèi)死亡的獨(dú)立相關(guān)危險(xiǎn)因素[3]。因此，深入揭示膿毒癥/感染性休克所致肺損傷的發(fā)病機(jī)制，對(duì)發(fā)現(xiàn)并鑒定新的有效治療措施有積極意義。

熱休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)是一類進(jìn)化保守的分子伴侶，根據(jù)分子量大小可分為HSPA/HSP70、HSPB/HSP27、HSPC/HSP90、HSPH/HSP110以及DNAJ/HSP40等幾個(gè)亞家族[4]。一些HSP如HSP70、HSP90被證實(shí)可顯著減輕膿毒癥/感染性休克肺損傷[5-6]，但尚未能成功臨床轉(zhuǎn)化，可能有更多其他HSP參與肺損傷的發(fā)生發(fā)展。

HSPA12A因其含有不連續(xù)ATP酶結(jié)構(gòu)域，被認(rèn)為是HSPA/HSP70家族的不典型成員。本團(tuán)隊(duì)的前期研究顯示，HSPA12A在肥胖、非酒精性脂肪肝、腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[7-8]。但尚不清楚HSPA12A是否參與膿毒癥、感染性休克肺損傷。本研究采用HSPA12A表達(dá)沉默的基因敲除鼠，探索HSPA12A在細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)所誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血癥肺損傷中的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 以C57BL/6為基因背景的Hspa12a基因敲除(Hspa12a-/-)鼠由本課題組前期構(gòu)建完成[9]。本研究采用8～10周齡雄性小鼠用于實(shí)驗(yàn)，對(duì)照組采用一窩所生、同性別、野生型(WT)小鼠。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，并得到相應(yīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 Escherichia coli LPS (0111:B4)、甲醛、抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體為Bioworld Technology公司產(chǎn)品(St. Louis，MN，美國(guó))，抗HSPA12A抗體為Abcam公司產(chǎn)品(Cambridge，英國(guó))，High-sig ECL western blotting 底物為天能公司產(chǎn)品(上海，中國(guó))，BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒為Pierce產(chǎn)品 (Rockford，IL，美國(guó))。

1.3 誘導(dǎo)內(nèi)毒素血癥 將WT鼠和Hspa12a-/-鼠分別分為2組，NS-WT組和LPS-WT組，NS-Hspa12a-/-組和LPS-Hspa12a-/-組(n=7)。LPS-WT組和LPS-Hspa12a-/-組進(jìn)行LPS (5 mg/kg)單劑量腹腔注射,NS-WT組和NS-Hspa12a-/-組注射等體積生理鹽水。6 h后進(jìn)行相應(yīng)分析。

1.4 血?dú)夥治?LPS或生理鹽水腹腔注射后6 h, 以1.5%異氟烷麻醉小鼠，氣管插管、機(jī)械通氣，然后從左心室抽取動(dòng)脈血液，用iSTAT Analyzer MN:300 (Abbott Park, IL,美國(guó))進(jìn)行血?dú)夥治觥?/p>

1.5 組織學(xué)分析 LPS或生理鹽水腹腔注射后6 h, 收集肺組織進(jìn)行甲醛固定、石蠟切片以及HE染色，并在顯微鏡下觀察(Olympus, 日本)。肺損傷評(píng)分按美國(guó)胸科協(xié)會(huì)制定的肺損傷量表進(jìn)行評(píng)分[10]。見(jiàn)表1。

表1 肺損傷評(píng)分量表

1.6 免疫印跡(Western blot) LPS或生理鹽水腹腔注射后6 h, 收集肺組織提取蛋白質(zhì)，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后，以等量蛋白質(zhì)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后按順序進(jìn)行轉(zhuǎn)印、封閉、孵育一抗、孵育二抗、顯影。以抗GAPDH的印跡為上樣內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 HSPA12A在內(nèi)毒素血癥小鼠肺組織中表達(dá)升高 本研究按照文獻(xiàn)采用革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁主要致病成分LPS進(jìn)行小鼠腹腔注射，誘導(dǎo)肺損傷的動(dòng)物模型[11]。免疫印跡結(jié)果顯示，LPS刺激使小鼠肺組織中的HSPA12A蛋白水平升高到對(duì)照組的1.5倍 (1.45±0.42比1.00±0.09，P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 NS-WT組和LPS-WT組HSPA12A蛋白水平比較

2.2Hspa12a基因敲除加重內(nèi)毒素血癥小鼠肺組織學(xué)改變 顯微鏡觀察顯示，WT鼠和Hspa12a-/-鼠的肺組織在LPS作用后均受到損傷，主要表現(xiàn)為肺泡腔和肺間質(zhì)中的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡內(nèi)蛋白碎片沉積、肺泡壁增厚等病理改變。見(jiàn)圖2。根據(jù)肺損傷量表進(jìn)行評(píng)分后發(fā)現(xiàn)，LPS作用后，Hspa12a-/-鼠肺損傷較WT鼠顯著加重 (P<0.01)，見(jiàn)表2。

圖2 WT鼠和Hspa12a-/-鼠的肺組織病理圖像(HE，×20)

表2 小鼠肺組織肺損傷評(píng)分 分，n=6)

2.3Hpa12a基因敲除加重肺功能損害 與LPS-WT鼠相比，LPS-Hspa12a-/-鼠動(dòng)脈血中總CO2(TCO2)以及CO2分壓(PCO2)均顯著升高 (P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 小鼠動(dòng)脈血?dú)夥治?/p>

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)毒素血癥小鼠肺組織中HSPA12A表達(dá)水平升高，而Hspa12a基因敲除則加重內(nèi)毒素血癥肺損傷，提示HSPA12A在膿毒癥/感染性休克肺損傷發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。

感染所致肺損傷涉及多重信號(hào)網(wǎng)絡(luò)形成的復(fù)雜病理生理過(guò)程，至今尚未完全闡明[12]。然而，肺泡壁水腫和肺泡內(nèi)滲出造成的彌漫性肺損傷是其無(wú)可非議的、公認(rèn)的關(guān)鍵病理特征[12]。此外，以中性粒細(xì)胞為主的白細(xì)胞聚集、纖維蛋白沉積也是此類肺損傷的常見(jiàn)病理改變。由于至少50%的膿毒癥/感染性休克由革蘭氏陰性菌引起，而LPS是位于革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上的主要致病成分，也稱內(nèi)毒素，因此，LPS常被用于膿毒癥/感染性休克的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的誘導(dǎo)[13]。本研究給予小鼠5 mg/kg LPS單劑量腹腔注射，6 h后觀察發(fā)現(xiàn)，小鼠肺組織出現(xiàn)肺泡壁間質(zhì)和肺泡內(nèi)白細(xì)胞滲出、肺泡壁水腫等典型的肺損傷病理改變，并且血?dú)夥治鲲@示小鼠體內(nèi)CO2過(guò)度蓄積，這些結(jié)果都提示小鼠出現(xiàn)了肺損傷。值得關(guān)注的是，上述LPS所致的肺組織損傷和肺功能損害在Hspa12a基因敲除鼠中顯著加重，提示HSPA12A是保護(hù)膿毒癥、感染性休克所致肺損傷所必需的。

現(xiàn)有研究證據(jù)顯示，膿毒癥/感染性休克肺損傷的病理改變主要與內(nèi)皮細(xì)胞損傷、上皮細(xì)胞損傷、炎癥細(xì)胞招募和浸潤(rùn)等因素有關(guān)。內(nèi)皮細(xì)胞是肺泡壁的重要組成結(jié)構(gòu)并形成血管屏障，控制分子、細(xì)胞進(jìn)出，在肺泡氣體交換、肺泡壁完整性方面的作用極其重要。LPS等細(xì)菌致病成分可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡(apoptosis)、焦亡(pyroptosis)，從而損傷內(nèi)皮屏障功能，導(dǎo)致肺泡蛋白成分、炎癥細(xì)胞等滲出，而滲出的炎癥細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生大量炎癥因子，對(duì)肺組織形成二次損傷。此外，肺上皮細(xì)胞損傷也是膿毒癥/感染性休克肺損傷的重要病理改變。本研究結(jié)果顯示，Hspa12a基因敲除可加重LPS所致的肺損傷，但其作用機(jī)制是否與內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞或炎癥細(xì)胞有關(guān)有待進(jìn)一步闡明。本團(tuán)隊(duì)前期研究顯示，Hspa12a可調(diào)控癌變的腎小管上皮細(xì)胞增殖和遷移、肝臟巨噬細(xì)胞活化[7]，提示HSPA12A在肺泡上皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和激活中可能也具有某種作用。此外，作為HSPA12A的高度同源基因HSPA12B，可顯著抑制LPS所致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷、維持內(nèi)皮屏障功能、限制內(nèi)皮細(xì)胞與炎癥細(xì)胞之間的交互作用[14]。結(jié)合HSPA12A參與腦卒中后血管新生的報(bào)道[9]，提示我們未來(lái)值得從內(nèi)皮細(xì)胞的角度探索HSPA12A對(duì)膿毒癥/感染性休克肺損傷的保護(hù)機(jī)制。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)Hspa12a是一個(gè)內(nèi)毒素血癥肺損傷的新型保護(hù)基因，但其作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步闡明。