劉燦黃，何清彥，吳勝男，林麗美，夏伯候，黃勝

1.長(zhǎng)沙市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；3.九芝堂股份有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410205

丹膝顆粒原名“偏癱靈顆?！保蛰d于《中國(guó)藥典》2020年版一部［1］，為九芝堂獨(dú)家生產(chǎn)品種，臨床上對(duì)陰虛風(fēng)動(dòng)型和氣虛血淤型中風(fēng)偏癱有其特有的預(yù)防和治療優(yōu)勢(shì)［2-4］。全方由丹參、牛膝、天麻、牡丹皮、赤芍、川芎、生地黃、淫羊藿、桑寄生、梔子、決明子、火麻仁12 味藥材組成，丹膝顆粒原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立了丹參、牛膝、淫羊藿、梔子、決明子的薄層色譜鑒別和丹酚酸B、天麻素的高效液相含量測(cè)定方法，薄層色譜和含量測(cè)定項(xiàng)目多而且前處理方法繁雜，影響因素較多。目前尚沒有文獻(xiàn)報(bào)道有關(guān)丹膝顆粒指紋圖譜的研究，本研究通過高效液相色譜法，DAD 檢測(cè)器和ELSD 檢測(cè)器兩個(gè)檢測(cè)器串聯(lián)［5-6］，建立丹膝顆粒HPLC-DAD-ELSD 雙通道指紋圖譜，較為直觀、簡(jiǎn)單呈現(xiàn)丹膝顆粒整體化學(xué)成分，為科學(xué)評(píng)價(jià)及有效控制丹膝顆粒的質(zhì)量提供可靠方法。

1 儀器與試藥

島津LC-20AD 高效液相色譜儀，SPD-M20A檢測(cè)器，ELSD-LT Ⅱ蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，LCsolution 色譜工作站，電子天平METTLER TOLEDO XS205DU，新芝SB-800 DTD 超聲儀。

對(duì)照品及對(duì)照藥材：沒食子酸（批號(hào)：110831-201906，91.5%），梔子苷（批號(hào)：110749-201718，97.6%），丹酚酸B（批號(hào)：110562-201917，96.6%），淫羊藿苷（批號(hào)：110737-202017，98.1%），丹皮酚（批號(hào)：110708-201908，99.8%），丹參酮ⅡA（批號(hào)：110766-202022，98.9%），芍藥苷（批號(hào)：110736-201943，95.1%），丹參素（批號(hào)：20101，99.3%），人參皂苷Ro（批號(hào)：20051，96.0%），橙黃決明素（批號(hào)：20031，98.0%），丹參（批號(hào)：120923-201816），牡丹皮（批號(hào)：121490-201603），丹參素、人參皂苷Ro、橙黃決明素對(duì)照品購(gòu)自珠海安哲生物科技有限公司，其余對(duì)照品、對(duì)照藥材均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，試劑甲醇、甲酸為分析純，水（超純水），乙腈（色譜純）。丹膝顆粒（規(guī)格：每袋裝10 g）15批樣品由九芝堂股份有限公司提供，按照藥典標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目檢驗(yàn)合格。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液精密稱取沒食子酸、梔子苷、丹酚酸B、淫羊藿苷、丹皮酚、丹參酮ⅡA對(duì)照品適量，至棕色量瓶中，加甲醇制成濃度分別為0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.20 mg/mL、0.05 mg/mL、0.015 mg/mL、0.015 mg/mL的對(duì)照品溶液1。精密稱取丹參素、芍藥苷、人參皂苷Ro、橙黃決明素對(duì)照品適量，至棕色量瓶中，加甲醇制成濃度分別為0.10 mg/mL、0.015 mg/mL、0.015 mg/mL、0.015 mg/mL的對(duì)照品溶液2。

2.1.2 供試品溶液樣品研細(xì)，取粉末約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇50 mL，稱定重量，超聲提?。üβ?50 W，頻率40 kHz）45 min，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 對(duì)照藥材溶液按處方量及制備工藝，依照“2.1.2”項(xiàng)下的方法進(jìn)行處理，分別制備丹參、牡丹皮對(duì)照藥材溶液。

2.2 色譜條件

CAPCELL PAK C18 MG Ⅱ色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈（A）-0.05%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～65 min，5%→30%A；65～120 min，30% →90%A；120～121 min，90%→5%A；121～135 min，5%A）；流速：0.8 mL/min；柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL，分析時(shí)間135 min，DAD（190 nm～400 nm）檢測(cè)；ELSD 條件：漂移管溫度45 ℃，氣體流量1.5 L/min，增益9。色譜圖見圖1。

圖1 HPLC-DAD-ELSD色譜圖

2.3 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn)取同一供試品溶液，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，分別測(cè)得DAD、ELSD下各共用峰保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液，在上述色譜條件下0 h、15 h、30 h、45 h、60 h、75 h、90 h 依次測(cè)定，分別測(cè)得DAD、ELSD 下各共用峰保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 均小于2.0%，表明供試品溶液90 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批號(hào)樣品6 份，依照“2.1.2”項(xiàng)下的方法進(jìn)行處理，在上述色譜條件下依次測(cè)定，分別測(cè)得DAD、ELSD 下各共用峰保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 均小于2.0%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜研究

2.4.1 共有峰歸屬取對(duì)照品溶液1、對(duì)照品溶液2依法進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，與指紋圖譜各主要峰對(duì)比，標(biāo)示17 個(gè)共有峰，DAD 檢測(cè)器下1 號(hào)峰為沒食子酸、2 號(hào)峰梔子苷、3 號(hào)峰丹酚酸B、4 號(hào)峰淫羊藿苷、5 號(hào)峰丹皮酚、9 號(hào)峰丹參酮ⅡA，ELSD檢測(cè)器下11 號(hào)峰為丹參素，13 號(hào)峰為芍藥苷，16號(hào)峰為人參皂苷Ro，17 號(hào)峰為橙黃決明素。通過參考丹參對(duì)照藥材溶液和牡丹皮對(duì)照藥材溶液色譜圖，6 號(hào)峰、7 號(hào)峰、8 號(hào)峰為丹參脂溶性成分，12號(hào)峰、14 號(hào)峰，15 號(hào)峰為牡丹皮中成分，10 號(hào)峰未知，具體化合物需進(jìn)一步質(zhì)譜確認(rèn)。2 號(hào)峰梔子苷、3 號(hào)峰丹酚酸B、4 號(hào)峰淫羊藿苷及9 號(hào)峰丹參酮ⅡA在ELSD 下同樣有較強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)，但其紫外吸收明顯，故選用DAD（254 nm）下標(biāo)識(shí)檢測(cè)，在ELSD 檢測(cè)器下未標(biāo)識(shí)。色譜圖見圖1。

2.4.2 指紋圖譜建立及相似度分析取15批次樣品各適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012.130723 版）進(jìn)行分析，建立雙通道串聯(lián)指紋圖譜（參考圖譜：S1，對(duì)照?qǐng)D譜生成方法：中位數(shù)，時(shí)間窗寬度：0.1 min），生成對(duì)照?qǐng)D譜，多點(diǎn)校正法建立指紋圖譜，指紋圖譜、對(duì)照指紋圖譜見圖2、圖3。共標(biāo)示17 個(gè)共有峰，DAD 檢測(cè)器（254 nm）下相似度在0.961～0.998，ELSD 檢測(cè)器下相似度在0.965～0.999。15批樣品相似度整體分布均在0.95 以上，表明相似度良好。

圖2 HPLC-DAD-ELSD指紋圖譜：A.HPLC-DAD；B.HPLC-ELSD

圖3 HPLC-DAD-ELSD對(duì)照指紋圖譜：A.HPLC-DAD；B.HPLC-ELSD

3 討論

3.1 DAD 檢測(cè)波長(zhǎng)和ELSD 檢測(cè)的選擇

實(shí)驗(yàn)通過DAD 檢測(cè)器200～400 nm 全波段掃描，分析色譜結(jié)果時(shí)分別比較了芍藥苷、梔子苷、淫羊藿苷、丹酚酸B、丹參酮ⅡA等成分的最大吸收波長(zhǎng)處（如210 nm、230 nm、238 nm、254 nm，270 nm，286 nm，320 nm）下整體樣品峰信息，最后選擇波長(zhǎng)254 nm 下樣品整體檢測(cè)信號(hào)豐富、靈敏度較高，便于整體評(píng)價(jià)。DAD 檢測(cè)器下對(duì)沒食子酸、梔子苷、丹酚酸B、淫羊藿苷、丹皮酚、丹參酮ⅡA等10 個(gè)成分進(jìn)行了標(biāo)識(shí)檢測(cè)，為進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)丹膝顆粒質(zhì)量的整體控制，彌補(bǔ)在DAD 檢測(cè)器下有些成分含量低、紫外吸收不明顯的缺點(diǎn)［7］，選擇樣品從DAD 檢測(cè)器檢測(cè)流出后再進(jìn)入ELSD 檢測(cè)器同步檢測(cè)，ELSD 檢測(cè)器下標(biāo)識(shí)人參皂苷Ro、橙黃決明素等6 個(gè)共有峰。

3.2 供試品溶液制備、流動(dòng)相系統(tǒng)、流動(dòng)相比例的選擇

考察了不同提取溶劑（50%甲醇，70%甲醇，100%甲醇）；不同提取方法（超聲45 min，回流提取30 min，回流提取1 h）。以100%甲醇提取、超聲45 min 時(shí)，方法較簡(jiǎn)單且目標(biāo)成分提取率較高，提取完全，各檢測(cè)信息相對(duì)穩(wěn)定，分離效果較好。流動(dòng)相體系考慮了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.05%甲酸溶液、乙腈-0.05%甲酸溶液、甲醇-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液［8-10］。其中加0.05%甲酸溶液和0.05%磷酸溶液均優(yōu)于純水體系，因考慮用ELSD檢測(cè)器，選擇了易揮發(fā)的0.05%甲酸溶液；因樣品中成分極性范圍寬，有些成分出峰時(shí)間慢，成分多且復(fù)雜，故最終選擇乙腈-0.05%甲酸溶液流動(dòng)相，分離度相對(duì)較好且基線平穩(wěn)。并對(duì)流動(dòng)相比例進(jìn)行了優(yōu)化［11-15］，最終按照“2.2”項(xiàng)下梯度洗脫的流動(dòng)相比例。

3.3 指紋圖譜分析

本研究指紋圖譜17 個(gè)共有峰分別為1 號(hào)峰沒食子酸、2 號(hào)峰梔子苷、3 號(hào)峰丹酚酸B、4 號(hào)峰淫羊藿苷、5 號(hào)峰丹皮酚、9 號(hào)峰丹參酮ⅡA、11 號(hào)峰丹參素、13 號(hào)峰芍藥苷、16 號(hào)峰人參皂苷Ro、17 號(hào)峰橙黃決明素，以上成分分別來源于丹參、赤芍、牡丹皮、梔子、淫羊藿、牛膝、決明子。6、7、8 號(hào)峰分別來源于丹參，12、14、15 號(hào)峰分別為來源于牡丹皮。共有峰的相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定，方法學(xué)考察精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均符合要求，相似度結(jié)果符合要求。

本研究為生產(chǎn)企業(yè)對(duì)丹膝顆粒的整體年度質(zhì)量回顧、監(jiān)管部門對(duì)丹膝顆粒整體質(zhì)量監(jiān)控、科學(xué)評(píng)價(jià)丹膝顆粒的整體質(zhì)量提供參考方法。