張碩，謝軍，顧玲玲，方馨慧，嵇珊珊，陶靜，朱善元*，陳麗，王安平*

(1. 江蘇海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 連云港 222005；2. 江蘇海洋大學(xué)江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005；3. 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 泰州 225300；4. 江蘇海洋大學(xué)江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，江蘇 連云港 222005)

星狀病毒是一種無囊膜、單股、正鏈RNA病毒，病毒衣殼呈二十面體結(jié)構(gòu)對(duì)稱，直徑約30 nm，全長約6.1～7.9 kb?；蚪M包括5′非翻譯區(qū)、3′非翻譯區(qū)、3個(gè)開放的閱讀框(ORF1a、ORF1b、ORF2)和1個(gè)多聚腺氨酸poly A尾[1]。3個(gè)開放的閱讀框分別編碼非結(jié)構(gòu)蛋白、RNA依賴RNA聚合酶和衣殼蛋白。其中ORF2閱讀框編碼的病毒衣殼蛋白是病毒的抗原決定蛋白，能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體的主要抗原[2]。

近年來，我國華北、華中、華南等多地鵝場暴發(fā)了一種以關(guān)節(jié)痛風(fēng)和內(nèi)臟痛風(fēng)為主要特征的致死性傳染病[3-5]。該病主要侵害5～20日齡的雛鵝，病鵝內(nèi)臟器官表面及關(guān)節(jié)腔內(nèi)部會(huì)產(chǎn)生大量白色尿酸鹽沉積，死亡率可高達(dá)50%，對(duì)我國養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成了嚴(yán)重的威脅[6-11]。造成鵝痛風(fēng)的原因有很多，如：飼料蛋白水平不均衡、飼養(yǎng)環(huán)境不佳、腸道菌群失衡或星狀病毒感染等[12-13]。但是在一些飼喂合理、環(huán)境溫暖、干燥、保溫性能好、空氣流通、養(yǎng)殖密度合適的鵝場依然會(huì)出現(xiàn)痛風(fēng)現(xiàn)象，因此懷疑此種痛風(fēng)是由一種新型鵝星狀病毒(goose astrovirus, GAstV)感染引起的[14-17]。

近年來國內(nèi)外關(guān)于新型鵝星狀病毒的報(bào)道逐漸增多，如目前已報(bào)道的分離株SD01、SDPY、JSHA株等[9, 18-19]。張清水[2]利用SD01毒株進(jìn)行了健康雛鵝感染試驗(yàn)，Yang等[16]通過NGS技術(shù)對(duì)SDPY株進(jìn)行全基因組測序，徐蓉等[9]驗(yàn)證了該毒株可感染鵝胚腎臟上皮細(xì)胞，姜?jiǎng)倌械萚18]對(duì)山東部分地區(qū)新型鵝星狀病毒ORF2基因進(jìn)行了擴(kuò)增并繪制了遺傳進(jìn)化樹，但均未對(duì)星狀病毒及其結(jié)構(gòu)或功能蛋白進(jìn)行更加深入的研究。本研究利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)新型鵝星狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白ORF2基因，制備其多抗血清，為新型鵝星狀病毒檢測方法的建立及相關(guān)功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒、菌種與細(xì)胞

本實(shí)驗(yàn)室自行分離鑒定的新型GAstV毒株YC20，GenBank序列號(hào)為MW536497；鵝抗GAstV陽性血清為此病毒攻毒雛鵝后康復(fù)鵝血清；10日齡鵝胚購于江蘇省金鵬鵝業(yè)有限公司；pET-30a載體、雞肝癌細(xì)胞(LMH)由江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購于大連TaKaRa公司。

1.2 酶類和試劑

核酸提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ及T4 DNA連接酶、DNA膠回收試劑盒均購自大連TaKaRa公司；質(zhì)粒抽提試劑盒、His柱純化試劑盒、His組氨酸單抗、DAB顯色試劑盒均購自康為世紀(jì)公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG、HRP標(biāo)記的羊抗鴨IgG、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG、熒光素標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自美國KPL公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中公布的新型GAstV基因組序列，設(shè)計(jì)1對(duì)針對(duì)ORF2基因序列的特異性引物，由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。引物序列為：GAstV-F:5′-TAAGGATCCATGGCAGACAGGGCGGTGGC-3′(下劃線為BamHⅠ酶切位點(diǎn));GAstV-R:5′-ATACTCGAGTCACTCATGTCCGCCCTTCTC-3′(下劃線為XhoⅠ酶切位點(diǎn))。

1.4 病毒增殖與RNA提取

取新型GAstV YC20 經(jīng)尿囊腔接種10日齡鵝胚，棄去24 h內(nèi)死亡的鵝胚，并在接種5 d后收取鵝胚尿囊液。參考核酸提取試劑盒說明書提取尿囊液總RNA，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 ORF2基因的擴(kuò)增

根據(jù)RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，RT的程序?yàn)椋?7 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，54 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 mim，35個(gè)循環(huán)后12 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 重組表達(dá)載體pET30a-ORF2的構(gòu)建

將PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離后，按膠回收試劑盒的說明書回收目的片段，經(jīng)BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切回收后，與同樣經(jīng)過BamHⅠ、XhoⅠ酶切的pET-30a質(zhì)粒22 ℃連接1 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有100 μg/mL卡那青霉素(Kan)的LB瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜。隨機(jī)挑取疑似單菌落，經(jīng)PCR鑒定后提取質(zhì)粒，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳篩選，并用BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切進(jìn)行鑒定。鑒定結(jié)果正確后送至江蘇金唯智生物技術(shù)有限公司測序，測序正確的克隆命名為pET30a-ORF2。

1.7 pET30a-ORF2蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析

將鑒定正確的pET30a-ORF2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落接種于新鮮含100 μg/mL卡那抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜。次日將過夜培養(yǎng)物按1∶100接種于5 mL含卡那抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)至OD600值為0.6～1.0之間時(shí)，加入1 mol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，使IPTG終濃度為1 mmol/L，置于37 ℃搖床繼續(xù)震蕩培養(yǎng)3～5 h，離心收集菌體，沉淀溶于200 μL PBS中，超聲波裂解后離心，分別收集上清及沉淀，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)設(shè)置pET-30a載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞同步誘導(dǎo)作為空白對(duì)照。

1.8 pET30a-ORF2蛋白的鑒定

誘導(dǎo)后，取100 μL菌液與100 μL 2×SDS上樣緩沖液混勻后，沸水煮沸3 min，進(jìn)行SDS-PAGE分析。同時(shí)轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，4 ℃、0.05 g/mL脫脂奶粉封閉過夜，分別以His組氨酸單抗(1∶1 000)、鵝抗GAstV陽性血清(1∶100)為一抗，37 ℃孵育2 h，以HRP標(biāo)記的羊抗鼠(1∶5 000)、HRP標(biāo)記的羊抗鴨(1∶5 000)為二抗，37 ℃孵育2 h，DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色觀察。

1.9 pET30a-ORF2重組蛋白的純化

按上述1.7的方法重新誘導(dǎo)菌液100 mL，4 ℃、12 000 r/min離心10 min收集菌體，加入2 mL PBS，超聲處理10 min，超聲后收集上清，按照His柱標(biāo)簽蛋白純化試劑盒說明書進(jìn)行純化操作，以200 mmol/L咪唑緩沖液進(jìn)行洗脫，將洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。

1.10 pET30a-ORF2多克隆抗體的制備

參照文獻(xiàn)[19]制備多克隆抗體血清，將上述純化的pET30a-ORF2重組蛋白，以背部皮下多點(diǎn)注射家兔，每只家兔免疫的蛋白量為300 μg，每隔2周免疫1次，前2次免疫后的第7天進(jìn)行采血，第3次免疫后的第14天采血，分離血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.11 多克隆抗體的鑒定

1.11.1 Western blot鑒定

將表達(dá)的融合蛋白樣品和空載體pET-30a經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。4 ℃、0.05 g/mL脫脂奶粉封閉過夜，以制備的家兔多抗血清為一抗(1∶100)，37 ℃孵育2 h，以HRP標(biāo)記的山羊抗兔為二抗(1∶5 000)，37 ℃孵育2 h，DAB顯色。

1.11.2 間接免疫熒光(IFA)鑒定

參考文獻(xiàn)[20-21]，將分離得到的GAstV尿囊液感染LMH細(xì)胞，在感染48 h后棄去上清，PBS洗滌2次，用預(yù)冷的固定液(丙酮∶乙醇=3∶4)4 ℃固定5 min，PBS洗滌2次，以制備的家兔多抗血清為一抗(1∶100)，37 ℃孵育2 h，PBS洗滌2次，以熒光素標(biāo)記的山羊抗兔IgG為二抗，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌2次后置于熒光倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察。同時(shí)以未接種的LMH細(xì)胞作為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 ORF2基因的克隆

以新型GAstV尿囊液為模板進(jìn)行PCR，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)1條約2 100 bp大小的特異性條帶(圖1)，與預(yù)期相符。

M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 重組表達(dá)載體pET30a-ORF2的構(gòu)建與鑒定

將克隆的重組表達(dá)載體pET30a-ORF2經(jīng)BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切后得到約2 100 bp和5 400 bp 2個(gè)條帶(圖2)，與預(yù)期結(jié)果相符，且DNA測序結(jié)果證明ORF2基因克隆正確。

2.3 pET30a-ORF2蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組菌pET30a-ORF2用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并以pET-30a載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞同步誘導(dǎo)作為對(duì)照。SDS-PAGE顯示，IPTG濃度為1 mmol/L，37 ℃誘導(dǎo)6 h，重組蛋白可以得到較高水平的表達(dá)，上清和包涵體中均存在。重組蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約為84 kDa(圖3)，與理論值相符。Western blot結(jié)果顯示，His組氨酸單抗(圖4)、鵝抗GAstV陽性血清(圖5)均能對(duì)重組蛋白特異結(jié)合。

M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1. 質(zhì)粒pET-30a BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切；2. 質(zhì)粒pET30a-ORF2 BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切

M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1. pET-ORF2重組蛋白未誘導(dǎo)破碎上清；2. pET-ORF2重組蛋白未誘導(dǎo)破碎沉淀；3. pET-ORF2重組蛋白誘導(dǎo)破碎上清；4. pET-ORF2重組蛋白誘導(dǎo)破碎沉淀

M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1. pET30a-ORF2重組蛋白;2. pET-30a誘導(dǎo)產(chǎn)物

M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1. pET-30a載體質(zhì)粒;2. pET-ORF2重組蛋白

2.4 多克隆抗體的鑒定

2.4.1 Western blot鑒定

通過Western blot對(duì)制備的兔多抗血清進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示(圖6)，在分子量約84 kDa處出現(xiàn)特異條帶，空白對(duì)照未出現(xiàn)，說明制備的兔多抗能與ORF2重組蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，具有良好的反應(yīng)原性。

M. 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1. pET-30a誘導(dǎo)產(chǎn)物;2. pET-ORF2表達(dá)的融合蛋白

2.4.2 IFA鑒定

通過IFA對(duì)制備的兔多抗血清進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，新型GAstV尿囊液感染的LMH細(xì)胞中有大量特異性免疫熒光(圖7A)，而未感染對(duì)照組未出現(xiàn)(圖7B)，說明制備的兔多抗血清能與GAstV尿囊液發(fā)生特異性結(jié)合。

A.感染新型GAstV的LMH細(xì)胞；B. 未感染新型GAstV的LMH細(xì)胞

3 討論

近年來，鵝痛風(fēng)已成為影響鵝場生產(chǎn)的主要疾病之一。越來越多的研究證明鵝星狀病毒是導(dǎo)致鵝痛風(fēng)的主要原因之一，且鵝星狀病毒又分為不同基因型，2018年后流行的主要為新型鵝星狀病毒[11]。ORF2基因編碼星狀病毒的衣殼蛋白，該蛋白在病毒入侵宿主細(xì)胞、病毒粒子包裝等過程中起關(guān)鍵作用，且可以刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，參與宿主的免疫反應(yīng)[2]。由于鵝星狀病毒的研究相對(duì)較晚，目前還沒有成熟的鵝星狀病毒檢測用血清學(xué)方法及防控用生物制品。鵝星狀病毒感染日益嚴(yán)重，迫切需要建立檢測鵝星狀病毒抗原抗體的檢測方法，監(jiān)測鵝星狀病毒在鵝群中的感染情況。本試驗(yàn)以本實(shí)驗(yàn)室自行分離的新型鵝星狀病毒YC20為模板，用pET原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白ORF2。重組蛋白不僅能被組氨酸單抗特異識(shí)別，也能與鵝抗GAstV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。由于無抗鵝二抗商品出售，本試驗(yàn)用抗鴨二抗代替，取得了較好的反應(yīng)結(jié)果。以上說明，本試驗(yàn)表達(dá)的重組蛋白ORF2具有良好的反應(yīng)原性，可以用作血清學(xué)檢測的抗原。

原核系統(tǒng)表達(dá)的外源蛋白，雖然缺少翻譯后加工，但依舊保持完整的抗原性，可以用于特定蛋白抗血清的制備。本試驗(yàn)將原核表達(dá)重組蛋白純化后免疫家兔，制備多抗血清。Western blot和IFA結(jié)果均證明該血清不僅能與重組蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，也能特異性結(jié)合新型鵝星狀病毒。以上說明制備的多抗具有良好的反應(yīng)原性，能特異性識(shí)別新型鵝星狀病毒，將來可以用于檢測抗原的血清學(xué)方法的探索。

本研究通過大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了新型鵝星狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白ORF2，并制備了多抗血清，均具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性，為鵝星狀病毒檢測方法的建立及疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。至于表達(dá)的重組蛋白及制備的多抗，能否與傳統(tǒng)的鵝星狀病毒抗原抗體發(fā)生交叉反應(yīng)，能否起交叉保護(hù)作用，還需要進(jìn)一步開展研究。