馮妮，陳志英，謝運(yùn)法，李美珍，馮顯鈐，唐榮福，胡傳活*，唐胤晟*，李銘*

(1. 廣西大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，廣西 南寧 530004；2. 廣西畜禽品種改良站，廣西 南寧 530001；3. 廣西畜牧研究所，廣西 南寧 530001)

隨著養(yǎng)豬生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展，人工授精技術(shù)被廣泛應(yīng)用，提高人工授精效率顯得尤為重要。人工授精過(guò)程中，精子發(fā)生頂體反應(yīng)之前，獲能是一個(gè)重要的生理先決條件[1]。而哺乳動(dòng)物精子獲能期間的一個(gè)早期事件是產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)[2]，ROS的產(chǎn)生和氧化應(yīng)激與氧化還原損傷直接相關(guān)[3]。研究表明，氧化應(yīng)激是損傷精子質(zhì)量的主要因素之一[4]。精子獲能過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)多氧化物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致精子受精所需的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變甚至丟失[5]，極大地限制了人工授精技術(shù)的廣泛推廣。枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharides，LBP)是一種常見(jiàn)天然中藥提取物。近年來(lái)研究表明，LBP具有多種生物活性和藥理作用，可通過(guò)調(diào)節(jié)垂體性腺軸，維持生殖激素之間的平衡，進(jìn)而維持正常的生精環(huán)境[6]。此外，LBP已被證明在豬精液冷凍保存中是一種天然抗凍劑[7]。一系列研究還探討了LBP對(duì)睪丸組織的保護(hù)作用，表明其可以通過(guò)減少睪丸組織的氧化應(yīng)激進(jìn)而表現(xiàn)出對(duì)精子的保護(hù)作用[8]。LBP不僅能夠逆轉(zhuǎn)鎘引起的血清睪酮水平下降趨勢(shì)[9]，還能阻斷生精細(xì)胞凋亡的相關(guān)途徑[10]。盡管研究表明LBP能用于治療多種疾病，并作為抗氧化劑促進(jìn)機(jī)體健康和長(zhǎng)壽，但其對(duì)精子獲能過(guò)程中抗氧化功能的影響研究未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)旨在評(píng)價(jià)LBP對(duì)獲能新鮮和凍后豬精子抗氧化能力的影響，為進(jìn)一步提高豬的人工授精效率提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮精液，手握法采自廣西科達(dá)畜禽改良有限責(zé)任公司體況相近的杜洛克公豬，按廣西大學(xué)動(dòng)物解剖實(shí)驗(yàn)室沿用方法[11]冷凍。精子培養(yǎng)液(Biggers-Whitten-Whittingham，BWW)購(gòu)自上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司。LBP(純度50%)、總抗氧化能力(T-AOC)檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)試劑盒、丙二醛(MDA)含量檢測(cè)試劑盒、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)、細(xì)胞熒光凋亡Hoechst 33342/PI雙染試劑盒和伊紅染液，均購(gòu)自北京Solarbio Science有限公司。超微量紫外分光光度計(jì)，購(gòu)自天根生化科技有限公司。

1.2 精子獲能處理

離心富集后的新鮮與凍后精子以PBS液1 000 r/min離心5 min洗滌。同樣的離心重復(fù)2次后，加入BWW培養(yǎng)液，將不同濃度LBP(2、4、8和16 mg/mL)與處理后的精子混勻，按文獻(xiàn)[12]操作孵育精子。

1.3 精子表觀指標(biāo)檢測(cè)

按田恒玖[13]方法依次檢測(cè)獲能處理后豬精子活率、質(zhì)膜完整性、頂體完整率。精子線粒體活性和精子細(xì)胞凋亡Hoechst 33342/PI雙染按Solarbio Science公司說(shuō)明操作。

1.4 精子抗氧化能力的檢測(cè)

使用最佳濃度LBP處理獲能精子后，分別按試劑盒操作說(shuō)明測(cè)定精子T-AOC、SOD活性及MDA含量。

1.5 精子SOD-1和Caspase-8 mRNA表達(dá)量分析

精子在上述處理的基礎(chǔ)上加入1 μmol/L氯化鎘處理[14]，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激后采用TRIzol法提取各組精子的總RNA，使用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定各組別RNA的A260/A280在1.8～2.0。隨后用Gene Star 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用華大基因有限公司合成的引物，按照SYBR Green方法檢測(cè)SOD-1(上游引物:ATGGTGTGGCCACTGTGTACA；下游引物：CCACCTCTGCCCAAGTCATC)和Caspase-8(上游引物：TCAAGTTCCTGAGCCTGGAC；下游引物：GCATGACCCTGTAGGCAGA) 基因mRNA表達(dá)水平。以β-actin(上游引物：CTAGTTACACACACGCGGCTCT；下游引物：CATGAATACCCTGCACAGATCG)作為內(nèi)參基因，每個(gè)樣本重復(fù)3次。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，數(shù)據(jù)用 “平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以P<0.05 為差異顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)。用GraphPad 7.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度LBP對(duì)獲能新鮮和冷凍精子表觀指標(biāo)的影響

由表1可見(jiàn)，新鮮精子中，2 mg/mL LBP獲能精子活率和頂體完整率顯著高于空白組和16 mg/mL組(P<0.05)。2 mg/mL LBP獲能精子質(zhì)膜完整性達(dá)到最高(P<0.05)。由表2可見(jiàn)，冷凍精子中，8 mg/mL LBP的獲能精子活率、線粒體活性和頂體完整率顯著高于空白組、2 mg/mL組、4 mg/mL組(P<0.05)，而質(zhì)膜完整性則顯著低于空白組和其他試驗(yàn)組(P<0.05)。綜合分析，選取2和8 mg/mL LBP為鮮精和凍精最適濃度。

表1 不同濃度LBP對(duì)獲能新鮮精子表觀指標(biāo)的影響 %

表2 不同濃度LBP對(duì)獲能凍后精子表觀指標(biāo)的影響 %

2.2 Hoechst 33342/PI雙染精子凋亡情況

精子在最適濃度LBP處理后，Hoechst 33342/PI雙染結(jié)果顯示正常精子：弱紅色熒光+弱藍(lán)色；凋亡精子：弱紅色熒光+強(qiáng)藍(lán)色；壞死精子：強(qiáng)紅色+強(qiáng)藍(lán)色。圖1結(jié)果顯示：新鮮精子獲能試驗(yàn)組較獲能空白組中視野內(nèi)正常精子數(shù)目較多；凍后精子獲能試驗(yàn)組較獲能空白組中強(qiáng)紅色熒光信號(hào)較強(qiáng)，獲能試驗(yàn)組精子壞死減少。

圖1 精子Hoechst 33342/PI雙染結(jié)果(標(biāo)尺=50 μm)

2.3 最適濃度LBP對(duì)獲能豬精子抗氧化指標(biāo)的影響

T- AOC如圖2所示，新鮮精子和凍后精子中，相比較獲能空白組，獲能試驗(yàn)組T-AOC均顯著增加(P<0.05)。

注：*表示差異顯著(P<0.05)。下同

SOD活性如圖3所示，新鮮精子和凍后精子的獲能試驗(yàn)組較獲能空白組SOD活性均顯著增加(P<0.05)；MDA含量如圖4所示，新鮮精子和凍后精子的獲能試驗(yàn)組與獲能空白組MDA含量均差異不顯著(P>0.05)。

圖3 LBP對(duì)獲能新鮮(A)和凍后(B)豬精子SOD活性的影響

圖4 LBP對(duì)獲能新鮮(A)和凍后(B)豬精子MDA含量的影響

2.4 最適濃度LBP對(duì)獲能豬精子SOD-1和Caspase-8 mRNA表達(dá)量的影響

由圖5可知，加氯化鎘誘導(dǎo)氧化應(yīng)激后，新鮮精子和凍后精子的獲能試驗(yàn)組較獲能空白組SOD-1 mRNA表達(dá)量均顯著增加(P<0.05)。

圖5 LBP對(duì)獲能新鮮(A)和凍后(B)豬精子SOD-1 mRNA表達(dá)量的影響

由圖6可知，新鮮精子和凍后精子的獲能試驗(yàn)組較獲能空白組Caspase-8 mRNA表達(dá)量均顯著下調(diào)(P<0.05)。

圖6 LBP對(duì)獲能新鮮(A)和凍后(B)豬精子

3 討論

現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，LBP作為一種常見(jiàn)的抗氧化劑，不僅能夠提高輻射誘導(dǎo)的少弱精子癥模型小鼠精子懸液SOD 活力、降低MDA含量，減輕睪丸組織氧化損傷，還能夠促進(jìn)生殖腺的發(fā)育和恢復(fù)[15]，提高精子數(shù)量和活力[16]，進(jìn)而保護(hù)精子的抗氧化系統(tǒng)。人工授精過(guò)程中，在精子發(fā)生頂體反應(yīng)之前，精子獲能是必要的。ROS是精子獲能過(guò)程中產(chǎn)生的物質(zhì)之一，ROS調(diào)節(jié)精子獲能，涉及精子與卵母細(xì)胞周圍的透明帶結(jié)合，誘導(dǎo)頂體反應(yīng)，使卵母細(xì)胞受精[17]。過(guò)量的ROS，在生殖方面表現(xiàn)為影響精子細(xì)胞膜完整性、活率和活力等相關(guān)指標(biāo)[18]。雄性生殖系統(tǒng)本身就是一個(gè)產(chǎn)生高濃度ROS的部位，易導(dǎo)致精子DNA損傷、中斷或阻礙精卵融合，最終影響動(dòng)物繁殖能力[19]。因此當(dāng)抗氧化劑的含量越高時(shí)，ROS的含量就會(huì)因此下降，可促進(jìn)精子保持完整的形態(tài)，提高精卵結(jié)合率。

Qiu等[20]證實(shí)了LBP可以顯著提高雞體內(nèi)GSH-Px和SOD活性。LBP還可以提高大鼠血清中GSH-Px和SOD 的活性[21]。本研究發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組較空白組相比SOD活性升高，這一結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道的LBP增加SOD活性結(jié)果一致。此外，LBP可以保護(hù)雄性大鼠的生殖功能，增加線粒體膜電位進(jìn)而緩解精子發(fā)生凋亡[22]。在本研究中，Hoechst 33342/PI雙染細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，較未加LBP組，加LBP組獲能豬精子出現(xiàn)精子線粒體膜電位較高，同時(shí)，凋亡現(xiàn)象相對(duì)較少。LBP所含的多種糖類物質(zhì)能影響膜對(duì)羥自由基的清除，從而影響精子抗氧化功能和MDA的產(chǎn)生[23]。然而，在本研究中，LBP對(duì)精子的MDA含量及質(zhì)膜完整性沒(méi)有明顯的改善作用，其原因有待于進(jìn)一步探索。

加氯化鎘處理時(shí)，獲能試驗(yàn)組較獲能空白組，SOD-1 mRNA表達(dá)量受LBP劑量的顯著影響。相比于凍后精子，新鮮精子在最適濃度LBP影響下，SOD-1 mRNA表達(dá)量上調(diào)顯著，這表明在氯化鎘體外誘導(dǎo)氧化應(yīng)激過(guò)程中，LBP能顯著增加獲能精子抗氧化能力，進(jìn)一步驗(yàn)證LBP在豬精子獲能過(guò)程中的抗氧化作用。在人體睪丸組織中，凋亡對(duì)于睪丸發(fā)育以及精子分化具有重要作用[24]。其中Caspase在凋亡機(jī)制中起著重要的作用，主要通過(guò)線粒體途徑和膜死亡受體途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，Caspase-8 是其中最重要的啟動(dòng)因子之一[25]。從精子中分離出來(lái)的Caspase可以對(duì)射精后精子凋亡情況進(jìn)行反映[26]。新鮮精子和凍后精子試驗(yàn)組Caspase-8 mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)也更好地佐證LBP能夠減少獲能豬精子的自我損傷。

綜上所述，在新鮮或凍融豬精子獲能過(guò)程中分別添加2 mg/mL和8 mg/mL LBP可以提高獲能精子SOD和T-AOC活性，影響精子獲能過(guò)程中SOD-1和Caspase-8 mRNA表達(dá)量，表明LBP能通過(guò)提高精子的抗氧化能力，減少精子的損傷，協(xié)助獲能反應(yīng)進(jìn)行。