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        枸杞多糖對獲能新鮮和凍后豬精子抗氧化能力的影響

        2021-09-06 05:44:40馮妮陳志英謝運(yùn)法李美珍馮顯鈐唐榮福胡傳活唐胤晟李銘
        畜牧與獸醫(yī) 2021年9期
        關(guān)鍵詞:新鮮精子試劑盒

        馮妮,陳志英,謝運(yùn)法,李美珍,馮顯鈐,唐榮福,胡傳活*,唐胤晟*,李銘*

        (1. 廣西大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,廣西 南寧 530004;2. 廣西畜禽品種改良站,廣西 南寧 530001;3. 廣西畜牧研究所,廣西 南寧 530001)

        隨著養(yǎng)豬生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展,人工授精技術(shù)被廣泛應(yīng)用,提高人工授精效率顯得尤為重要。人工授精過程中,精子發(fā)生頂體反應(yīng)之前,獲能是一個(gè)重要的生理先決條件[1]。而哺乳動(dòng)物精子獲能期間的一個(gè)早期事件是產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS)[2],ROS的產(chǎn)生和氧化應(yīng)激與氧化還原損傷直接相關(guān)[3]。研究表明,氧化應(yīng)激是損傷精子質(zhì)量的主要因素之一[4]。精子獲能過程中產(chǎn)生的過多氧化物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致精子受精所需的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變甚至丟失[5],極大地限制了人工授精技術(shù)的廣泛推廣。枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharides,LBP)是一種常見天然中藥提取物。近年來研究表明,LBP具有多種生物活性和藥理作用,可通過調(diào)節(jié)垂體性腺軸,維持生殖激素之間的平衡,進(jìn)而維持正常的生精環(huán)境[6]。此外,LBP已被證明在豬精液冷凍保存中是一種天然抗凍劑[7]。一系列研究還探討了LBP對睪丸組織的保護(hù)作用,表明其可以通過減少睪丸組織的氧化應(yīng)激進(jìn)而表現(xiàn)出對精子的保護(hù)作用[8]。LBP不僅能夠逆轉(zhuǎn)鎘引起的血清睪酮水平下降趨勢[9],還能阻斷生精細(xì)胞凋亡的相關(guān)途徑[10]。盡管研究表明LBP能用于治療多種疾病,并作為抗氧化劑促進(jìn)機(jī)體健康和長壽,但其對精子獲能過程中抗氧化功能的影響研究未見報(bào)道。本試驗(yàn)旨在評價(jià)LBP對獲能新鮮和凍后豬精子抗氧化能力的影響,為進(jìn)一步提高豬的人工授精效率提供理論參考。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        新鮮精液,手握法采自廣西科達(dá)畜禽改良有限責(zé)任公司體況相近的杜洛克公豬,按廣西大學(xué)動(dòng)物解剖實(shí)驗(yàn)室沿用方法[11]冷凍。精子培養(yǎng)液(Biggers-Whitten-Whittingham,BWW)購自上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司。LBP(純度50%)、總抗氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒、丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)、細(xì)胞熒光凋亡Hoechst 33342/PI雙染試劑盒和伊紅染液,均購自北京Solarbio Science有限公司。超微量紫外分光光度計(jì),購自天根生化科技有限公司。

        1.2 精子獲能處理

        離心富集后的新鮮與凍后精子以PBS液1 000 r/min離心5 min洗滌。同樣的離心重復(fù)2次后,加入BWW培養(yǎng)液,將不同濃度LBP(2、4、8和16 mg/mL)與處理后的精子混勻,按文獻(xiàn)[12]操作孵育精子。

        1.3 精子表觀指標(biāo)檢測

        按田恒玖[13]方法依次檢測獲能處理后豬精子活率、質(zhì)膜完整性、頂體完整率。精子線粒體活性和精子細(xì)胞凋亡Hoechst 33342/PI雙染按Solarbio Science公司說明操作。

        1.4 精子抗氧化能力的檢測

        使用最佳濃度LBP處理獲能精子后,分別按試劑盒操作說明測定精子T-AOC、SOD活性及MDA含量。

        1.5 精子SOD-1和Caspase-8 mRNA表達(dá)量分析

        精子在上述處理的基礎(chǔ)上加入1 μmol/L氯化鎘處理[14],誘導(dǎo)氧化應(yīng)激后采用TRIzol法提取各組精子的總RNA,使用超微量紫外分光光度計(jì)測定各組別RNA的A260/A280在1.8~2.0。隨后用Gene Star 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,采用華大基因有限公司合成的引物,按照SYBR Green方法檢測SOD-1(上游引物:ATGGTGTGGCCACTGTGTACA;下游引物:CCACCTCTGCCCAAGTCATC)和Caspase-8(上游引物:TCAAGTTCCTGAGCCTGGAC;下游引物:GCATGACCCTGTAGGCAGA) 基因mRNA表達(dá)水平。以β-actin(上游引物:CTAGTTACACACACGCGGCTCT;下游引物:CATGAATACCCTGCACAGATCG)作為內(nèi)參基因,每個(gè)樣本重復(fù)3次。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,40個(gè)循環(huán)。

        1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

        用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA),數(shù)據(jù)用 “平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,以P<0.05 為差異顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)。用GraphPad 7.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 不同濃度LBP對獲能新鮮和冷凍精子表觀指標(biāo)的影響

        由表1可見,新鮮精子中,2 mg/mL LBP獲能精子活率和頂體完整率顯著高于空白組和16 mg/mL組(P<0.05)。2 mg/mL LBP獲能精子質(zhì)膜完整性達(dá)到最高(P<0.05)。由表2可見,冷凍精子中,8 mg/mL LBP的獲能精子活率、線粒體活性和頂體完整率顯著高于空白組、2 mg/mL組、4 mg/mL組(P<0.05),而質(zhì)膜完整性則顯著低于空白組和其他試驗(yàn)組(P<0.05)。綜合分析,選取2和8 mg/mL LBP為鮮精和凍精最適濃度。

        表1 不同濃度LBP對獲能新鮮精子表觀指標(biāo)的影響 %

        表2 不同濃度LBP對獲能凍后精子表觀指標(biāo)的影響 %

        2.2 Hoechst 33342/PI雙染精子凋亡情況

        精子在最適濃度LBP處理后,Hoechst 33342/PI雙染結(jié)果顯示正常精子:弱紅色熒光+弱藍(lán)色;凋亡精子:弱紅色熒光+強(qiáng)藍(lán)色;壞死精子:強(qiáng)紅色+強(qiáng)藍(lán)色。圖1結(jié)果顯示:新鮮精子獲能試驗(yàn)組較獲能空白組中視野內(nèi)正常精子數(shù)目較多;凍后精子獲能試驗(yàn)組較獲能空白組中強(qiáng)紅色熒光信號較強(qiáng),獲能試驗(yàn)組精子壞死減少。

        圖1 精子Hoechst 33342/PI雙染結(jié)果(標(biāo)尺=50 μm)

        2.3 最適濃度LBP對獲能豬精子抗氧化指標(biāo)的影響

        T- AOC如圖2所示,新鮮精子和凍后精子中,相比較獲能空白組,獲能試驗(yàn)組T-AOC均顯著增加(P<0.05)。

        注:*表示差異顯著(P<0.05)。下同

        SOD活性如圖3所示,新鮮精子和凍后精子的獲能試驗(yàn)組較獲能空白組SOD活性均顯著增加(P<0.05);MDA含量如圖4所示,新鮮精子和凍后精子的獲能試驗(yàn)組與獲能空白組MDA含量均差異不顯著(P>0.05)。

        圖3 LBP對獲能新鮮(A)和凍后(B)豬精子SOD活性的影響

        圖4 LBP對獲能新鮮(A)和凍后(B)豬精子MDA含量的影響

        2.4 最適濃度LBP對獲能豬精子SOD-1和Caspase-8 mRNA表達(dá)量的影響

        由圖5可知,加氯化鎘誘導(dǎo)氧化應(yīng)激后,新鮮精子和凍后精子的獲能試驗(yàn)組較獲能空白組SOD-1 mRNA表達(dá)量均顯著增加(P<0.05)。

        圖5 LBP對獲能新鮮(A)和凍后(B)豬精子SOD-1 mRNA表達(dá)量的影響

        由圖6可知,新鮮精子和凍后精子的獲能試驗(yàn)組較獲能空白組Caspase-8 mRNA表達(dá)量均顯著下調(diào)(P<0.05)。

        圖6 LBP對獲能新鮮(A)和凍后(B)豬精子

        3 討論

        現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示,LBP作為一種常見的抗氧化劑,不僅能夠提高輻射誘導(dǎo)的少弱精子癥模型小鼠精子懸液SOD 活力、降低MDA含量,減輕睪丸組織氧化損傷,還能夠促進(jìn)生殖腺的發(fā)育和恢復(fù)[15],提高精子數(shù)量和活力[16],進(jìn)而保護(hù)精子的抗氧化系統(tǒng)。人工授精過程中,在精子發(fā)生頂體反應(yīng)之前,精子獲能是必要的。ROS是精子獲能過程中產(chǎn)生的物質(zhì)之一,ROS調(diào)節(jié)精子獲能,涉及精子與卵母細(xì)胞周圍的透明帶結(jié)合,誘導(dǎo)頂體反應(yīng),使卵母細(xì)胞受精[17]。過量的ROS,在生殖方面表現(xiàn)為影響精子細(xì)胞膜完整性、活率和活力等相關(guān)指標(biāo)[18]。雄性生殖系統(tǒng)本身就是一個(gè)產(chǎn)生高濃度ROS的部位,易導(dǎo)致精子DNA損傷、中斷或阻礙精卵融合,最終影響動(dòng)物繁殖能力[19]。因此當(dāng)抗氧化劑的含量越高時(shí),ROS的含量就會(huì)因此下降,可促進(jìn)精子保持完整的形態(tài),提高精卵結(jié)合率。

        Qiu等[20]證實(shí)了LBP可以顯著提高雞體內(nèi)GSH-Px和SOD活性。LBP還可以提高大鼠血清中GSH-Px和SOD 的活性[21]。本研究發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組較空白組相比SOD活性升高,這一結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道的LBP增加SOD活性結(jié)果一致。此外,LBP可以保護(hù)雄性大鼠的生殖功能,增加線粒體膜電位進(jìn)而緩解精子發(fā)生凋亡[22]。在本研究中,Hoechst 33342/PI雙染細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示,較未加LBP組,加LBP組獲能豬精子出現(xiàn)精子線粒體膜電位較高,同時(shí),凋亡現(xiàn)象相對較少。LBP所含的多種糖類物質(zhì)能影響膜對羥自由基的清除,從而影響精子抗氧化功能和MDA的產(chǎn)生[23]。然而,在本研究中,LBP對精子的MDA含量及質(zhì)膜完整性沒有明顯的改善作用,其原因有待于進(jìn)一步探索。

        加氯化鎘處理時(shí),獲能試驗(yàn)組較獲能空白組,SOD-1 mRNA表達(dá)量受LBP劑量的顯著影響。相比于凍后精子,新鮮精子在最適濃度LBP影響下,SOD-1 mRNA表達(dá)量上調(diào)顯著,這表明在氯化鎘體外誘導(dǎo)氧化應(yīng)激過程中,LBP能顯著增加獲能精子抗氧化能力,進(jìn)一步驗(yàn)證LBP在豬精子獲能過程中的抗氧化作用。在人體睪丸組織中,凋亡對于睪丸發(fā)育以及精子分化具有重要作用[24]。其中Caspase在凋亡機(jī)制中起著重要的作用,主要通過線粒體途徑和膜死亡受體途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡,Caspase-8 是其中最重要的啟動(dòng)因子之一[25]。從精子中分離出來的Caspase可以對射精后精子凋亡情況進(jìn)行反映[26]。新鮮精子和凍后精子試驗(yàn)組Caspase-8 mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)也更好地佐證LBP能夠減少獲能豬精子的自我損傷。

        綜上所述,在新鮮或凍融豬精子獲能過程中分別添加2 mg/mL和8 mg/mL LBP可以提高獲能精子SOD和T-AOC活性,影響精子獲能過程中SOD-1和Caspase-8 mRNA表達(dá)量,表明LBP能通過提高精子的抗氧化能力,減少精子的損傷,協(xié)助獲能反應(yīng)進(jìn)行。

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