趙芷玉，律澤，魏煒，韓曉墨

（沈陽(yáng)建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院，沈陽(yáng) 110168）

佳樂(lè)麝香（HHCB）是一種具有特殊香味的疏水性多環(huán)類有機(jī)物[1]，現(xiàn)已作為工業(yè)香料被廣泛地應(yīng)用于日用化工產(chǎn)業(yè)，如香水、洗發(fā)水、沐浴露、肥皂和洗衣粉等產(chǎn)品中[2]，且隨著污水灌溉和污泥農(nóng)田施用，在土壤中濃度也越來(lái)越高。HORII 等[3]對(duì)美國(guó)Kentucky和Georgia 的兩座大型污水處理廠進(jìn)水中的HHCB 殘留濃度分別進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明在進(jìn)水口中HHCB的殘留濃度最高達(dá)7 000 ng·L-1。GUERRA 等[4]對(duì)美國(guó)的兩座大型污水處理廠排出的污泥進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)HHCB 含量已達(dá)到14 300 μg·kg-1。陳多宏等[5]發(fā)現(xiàn)日用化妝品生產(chǎn)工廠排放的污泥中HHCB 濃度已達(dá)到566 mg·kg-1。隨著HHCB在自然環(huán)境中濃度增高，生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)也越來(lái)越大，導(dǎo)致其生態(tài)毒理效應(yīng)增強(qiáng)。HHCB 是潛在的內(nèi)分泌干擾物，李明等[6]發(fā)現(xiàn)HHCB可造成斑馬魚胚胎甲狀腺激素分泌和調(diào)節(jié)的紊亂。HHCB 的遺傳毒性效應(yīng)主要表現(xiàn)在生殖能力方面，MELMED[7]發(fā)現(xiàn)在動(dòng)物試驗(yàn)中，麝香酮可以使雄性動(dòng)物生殖器官萎縮。HHCB 對(duì)生物的生理生態(tài)效應(yīng)主要是對(duì)其生態(tài)結(jié)構(gòu)有影響，姜麗思等[8]發(fā)現(xiàn)較低劑量的HHCB 脅迫就能夠?qū)е绿}卜根尖基因組DNA 損傷，且隨濃度升高損傷加重。

目前，重金屬污染日益嚴(yán)重，隨著公眾的環(huán)境意識(shí)提高，重金屬污染受到越來(lái)越多的關(guān)注[9]。土壤中的Cd可移動(dòng)性強(qiáng)，且具有可積累性，積累到一定劑量就會(huì)影響人體健康。由于土壤中HHCB 與Cd 均可通過(guò)污水灌溉及污泥農(nóng)田施用途徑輸入土壤，土壤受二者復(fù)合污染的問(wèn)題也日益突出。

目前針對(duì)HHCB 與Cd 復(fù)合污染的研究大多集中于水生生物和陸生生物，對(duì)土壤微生物方面的研究相對(duì)較少。陳翠紅[10]研究發(fā)現(xiàn)多環(huán)麝香和Cd 對(duì)小麥根伸長(zhǎng)和芽伸長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，且存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。ZHANG等[11]研究發(fā)現(xiàn)HHCB和Cd對(duì)斑馬魚抗氧化系統(tǒng)具有聯(lián)合效應(yīng)，試驗(yàn)初期為Cd 起決定性作用，而在其余的暴露時(shí)間內(nèi)，HHCB 起主要作用，斑馬魚暴露于HHCB 時(shí)，其總蛋白減少，可能是斑馬魚損傷的重要原因。

在土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)中，微生物數(shù)量、酶活性等因素是一個(gè)隨著環(huán)境變化而變化的動(dòng)態(tài)過(guò)程。由于土壤酶主要來(lái)自土壤微生物的生命活動(dòng)，污染物的脅迫會(huì)導(dǎo)致土壤中微生物種群活細(xì)胞的數(shù)量和組成發(fā)生變化，因此，也影響了土壤微生物的活性。本研究以HHCB 和Cd 為污染物，在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)80 d 后，分別研究二者單一及復(fù)合污染下對(duì)土壤中微生物數(shù)量和土壤酶活性的影響，進(jìn)而研究二者復(fù)合污染對(duì)土壤的生態(tài)毒理效應(yīng)，可為復(fù)合污染土壤的生物修復(fù)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

供試土壤采集于遼寧省沈陽(yáng)市石佛寺灌渠渠首（42°08.611′N，123°20.705′E），取農(nóng)田表層（0～20 cm）土壤。土壤理化性質(zhì)如表1所示。

表1 土壤理化性質(zhì)Table1 Soil physical and chemical properties

1.2 供試藥品

HHCB 標(biāo)準(zhǔn)樣品購(gòu)于英國(guó)Promochem 公司，純度為75%，其分子式均為C18H26O。國(guó)產(chǎn)分析純CdCl2·2.5H2O購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

本試驗(yàn)采用微宇宙實(shí)驗(yàn)法，對(duì)培養(yǎng)80 d后的土壤中微生物數(shù)量以及酶活性進(jìn)行研究。新鮮土壤采集并揀去植物殘?bào)w后裝于聚乙烯塑料袋中保鮮，帶回實(shí)驗(yàn)室過(guò)2 mm 篩。稱取200 g（以干土計(jì)）土壤于500 mL 的塑料燒杯中，調(diào)節(jié)含水量至田間最大持水量的60%左右，用具有透氣作用的薄膜封口，防止水分過(guò)量蒸發(fā)和空氣中的菌體進(jìn)入，并將其置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光預(yù)培養(yǎng)7 d。預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，采用土壤染毒法進(jìn)行染毒。

將過(guò)2 mm 篩后的供試土壤采用二因素分別為4水平（HHCB 濃度分別為0、100、400 mg·kg-1和800 mg·kg-1）和2 水平（Cd 濃度分別為0 和10 mg·kg-1）的完全組合試驗(yàn)。分為CK、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7共8個(gè)處理組（表2），每個(gè)處理重復(fù)3次。

表2 不同處理中Cd與HHCB 濃度情況（mg·kg-1）Table2 Concentrations of Cd and HHCB in different treatments（mg·kg-1）

將各處理組的土樣充分混勻后，以80 d作為培養(yǎng)周期，將其置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，在整個(gè)過(guò)程中保持土壤濕度在最大持水量的60%左右，每2～3 d 調(diào)節(jié)一次土壤含水量，使培養(yǎng)過(guò)程中土壤含水量保持恒定。于培養(yǎng)第1 d 和第80 d 采集土壤，分別測(cè)定土壤中細(xì)菌、真菌和放線菌的數(shù)量以及土壤脲酶、蔗糖酶和酸性磷酸酶的活性。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 土壤微生物測(cè)定方法

（1）可培養(yǎng)微生物的測(cè)定方法：采用固體平板稀釋涂布培養(yǎng)計(jì)數(shù)法，其中細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，真菌采用馬丁培養(yǎng)基，放線菌采用高氏培養(yǎng)基。

（2）微生物總數(shù)的測(cè)定方法采用熒光qPCR 法。DNA 的提?。菏褂肍ast DNA-SPIN KitForSoil 試劑盒，從0.5 g 土壤中提取基因組DNA，并將其溶于50 μL水中，保存溫度為-20 ℃。測(cè)定基因的拷貝數(shù)：采用熒光定量qPCR 測(cè)定細(xì)菌16S rRNA、真菌18S rRNA和放線菌特異基因的拷貝數(shù)（以干土計(jì)）。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中的基因拷貝數(shù)根據(jù)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，然后換算成每克干土的基因拷貝數(shù)。

1.4.2 土壤酶活性測(cè)定方法

土壤脲酶活性測(cè)定采用苯酚鈉法；土壤蔗糖酶活性測(cè)定采用3、5-二硝基水楊酸法；土壤酸性磷酸酶活性測(cè)定采用對(duì)硝基酚比色法。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS 7.5 進(jìn)行處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用多因素方差分析中Turkey 多重比較檢驗(yàn)不同處理間的結(jié)果差異顯著性。顯著性水平為P＜0.05，極顯著水平為P＜0.01。試驗(yàn)作圖采用Origin 8。

2 結(jié)果與分析

2.1 HHCB與Cd污染對(duì)土壤中微生物數(shù)量的影響

土壤微生物對(duì)土壤的改變十分敏感[12]，因此可作為土壤質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)，在討論復(fù)合污染對(duì)土壤質(zhì)量影響時(shí)，可通過(guò)測(cè)定微生物的數(shù)量進(jìn)行土壤質(zhì)量的評(píng)定[13]。

2.1.1 HHCB和Cd污染對(duì)可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)的影響

不同處理可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)方差分析結(jié)果見圖1，培養(yǎng)時(shí)間為1 d 時(shí)，與CK 相比，所有處理可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)均表現(xiàn)為顯著降低（P＜0.05）。HHCB 單一污染對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)表現(xiàn)為抑制作用，H1、H2 和H3 中細(xì)菌數(shù)分別顯著低于CK 15.09%、15.99%和30.98%，且隨著濃度的增加，細(xì)菌數(shù)減少。Cd 單一污染對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)呈現(xiàn)出較大的抑制效果，H4 處理下細(xì)菌數(shù)顯著低于CK 49.96%。HHCB 與Cd 復(fù)合污染對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)也表現(xiàn)為抑制作用，H5、H6 和H7 中細(xì)菌數(shù)分別顯著低于CK 27.24%、43.29%和59.32%。

表3 細(xì)菌、真菌、放線菌引物和PCR條件Table3 Bacteria，fungi，actinomycetes primers and PCR conditions

培養(yǎng)時(shí)間為80 d 時(shí)，與CK 相比，除H1 和H4 外，其他處理均表現(xiàn)為差異顯著（P＜0.05）。HHCB 單一污染對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)表現(xiàn)為促進(jìn)作用，H2和H3中細(xì)菌數(shù)分別顯著高于CK 3.18 倍和3.34 倍。HHCB 與Cd 復(fù)合污染對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)也表現(xiàn)為促進(jìn)作用，H5、H6 和H7中細(xì)菌數(shù)分別顯著高于CK 2.25、4.82倍和5.09倍，H7對(duì)細(xì)菌的促進(jìn)效果最顯著。培養(yǎng)時(shí)間為80 d時(shí)，各處理濃度的細(xì)菌數(shù)均高于培養(yǎng)時(shí)間為1 d 的細(xì)菌數(shù)（CK、H1 除外），H2、H3、H4、H5、H6 和H7 分別為培養(yǎng)時(shí)間為1 d 時(shí)的3.33、4.25、1.09、4.64、9.13 倍和9.89倍，CK 和H1 的細(xì)菌數(shù)分別低于培養(yǎng)時(shí)間為1 d 時(shí)35.80%和24.60%。結(jié)果表明，培養(yǎng)時(shí)間為1 d 時(shí)，HHCB 與Cd 單一及復(fù)合污染對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)表現(xiàn)為抑制作用；培養(yǎng)時(shí)間為80 d 時(shí)，HHCB 單一及與Cd 復(fù)合污染對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)表現(xiàn)為促進(jìn)作用（H1除外）。

2.1.2 HHCB和Cd污染對(duì)可培養(yǎng)真菌數(shù)的影響

不同處理可培養(yǎng)真菌數(shù)方差分析結(jié)果見圖2，培養(yǎng)時(shí)間為1 d時(shí)，與CK相比，除H3和H7外，其他處理均表現(xiàn)為差異顯著（P＜0.05）。HHCB 單一污染對(duì)真菌生長(zhǎng)表現(xiàn)為促進(jìn)作用，H1和H2中真菌數(shù)分別顯著高于CK 2.14 倍和1.80 倍。Cd 單一污染對(duì)真菌生長(zhǎng)呈現(xiàn)出顯著的抑制效果，H4 處理下真菌數(shù)顯著低于CK 85.90%。HHCB 與Cd 復(fù)合污染對(duì)真菌生長(zhǎng)也表現(xiàn)為促進(jìn)作用，H5 和H6 中真菌數(shù)分別顯著高于CK 4.32倍和3.33倍。

培養(yǎng)時(shí)間為80 d時(shí)，與CK相比，除H4外，其他處理濃度均表現(xiàn)為差異顯著（P＜0.05）。HHCB 單一污染對(duì)真菌生長(zhǎng)表現(xiàn)促進(jìn)作用，H1、H2 和H3 中真菌數(shù)分別顯著高于CK 9.51、4.36 倍和4.30 倍。HHCB 與Cd 復(fù)合污染對(duì)真菌生長(zhǎng)表現(xiàn)為促進(jìn)作用，H5、H6 和H7 中真菌數(shù)分別顯著高于CK 10.69、5.62 倍和4.14倍。培養(yǎng)時(shí)間為80 d時(shí)，各處理濃度的真菌數(shù)均高于培養(yǎng)時(shí)間為1 d 的可培養(yǎng)真菌數(shù)，CK、H1、H2、H3、H4、H5、H6 和H7 分別高于培養(yǎng)時(shí)間為1 d 時(shí)的12.78%、175.00%、41.09%、169.00%、346.00%、43.70%、16.50%和431.00%。試驗(yàn)結(jié)果表明，HHCB單一及與Cd復(fù)合污染對(duì)真菌生長(zhǎng)表現(xiàn)為促進(jìn)作用。

2.1.3 HHCB和Cd污染對(duì)可培養(yǎng)放線菌數(shù)的影響

不同處理可培養(yǎng)放線菌數(shù)方差分析結(jié)果見圖3，培養(yǎng)時(shí)間為1 d 時(shí)，與CK 相比，所有處理濃度均表現(xiàn)為差異顯著（P＜0.05）。HHCB 單一污染對(duì)放線菌生長(zhǎng)表現(xiàn)抑制作用，H1、H2 和H3 處理的放線菌數(shù)分別顯著低于CK 57.22%、76.88%和91.32%。Cd 單一污染對(duì)放線菌生長(zhǎng)表現(xiàn)抑制作用，H4 處理的放線菌數(shù)顯著低于CK 80.97%。HHCB 與Cd 復(fù)合污染對(duì)放線菌生長(zhǎng)也表現(xiàn)抑制作用，H5、H6 和H7 處理的放線菌數(shù)分別顯著低于CK 63.38%、79.38%和90.21%。

培養(yǎng)時(shí)間為80 d時(shí)，與CK相比，所有的處理均表現(xiàn)為差異顯著（P＜0.05）。HHCB 單一污染對(duì)放線菌生長(zhǎng)表現(xiàn)為抑制作用，H1、H2 和H3 處理的放線菌數(shù)分別顯著低于CK 82.90%、97.10%和98.70%。Cd 單一污染對(duì)放線菌生長(zhǎng)表現(xiàn)為抑制作用，H4 處理的放線菌數(shù)顯著低于CK 78.78%。HHCB 與Cd 復(fù)合污染對(duì)放線菌生長(zhǎng)表現(xiàn)為抑制作用，H5、H6 和H7 處理的放線菌數(shù)分別顯著低于CK 76.50%、94.50% 和98.90%。培養(yǎng)時(shí)間為80 d 時(shí)，各處理濃度的放線菌數(shù)均低于培養(yǎng)時(shí)間為1 d 的放線菌數(shù)，CK、H1、H2、H3、H4、H5、H6 和H7 分別低于培養(yǎng)時(shí)間為1 d 時(shí)的16.50%、67.20%、89.10%、89.20%、6.67%、35.07%、67.05%和38.66%。試驗(yàn)結(jié)果表明，HHCB 與Cd 單一及復(fù)合污染對(duì)放線菌生長(zhǎng)均表現(xiàn)為抑制作用。

2.1.4 HHCB和Cd污染對(duì)微生物基因拷貝數(shù)的影響

（1）細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)

經(jīng)方差分析后可知，與CK 相比，只有H7 表現(xiàn)為差異顯著（P＜0.05）。由圖4 可知，在H7 處理下，細(xì)菌16S rRNA 基因拷貝數(shù)顯著高于CK 76.98%。HHCB單一及與Cd 復(fù)合污染（除H7 外），不同濃度的HHCB處理細(xì)菌16S rRNA 基因拷貝數(shù)均沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），但細(xì)菌基因拷貝數(shù)隨著HHCB 濃度的增加而增加。

（2）真菌18S rRNA基因拷貝數(shù)

經(jīng)方差分析后可知，與CK 相比，只有H4 表現(xiàn)為差異顯著（P＜0.05）。由圖5 可知，Cd 單一污染下，H4處理的真菌18S rRNA 基因拷貝數(shù)顯著高于CK 1.07倍。HHCB 單一及與Cd 復(fù)合污染下，不同濃度的HHCB 處理真菌18S rRNA 基因拷貝數(shù)均沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），但真菌基因拷貝數(shù)隨著HHCB 濃度的增加而減少。

（3）放線菌基因拷貝數(shù)

經(jīng)方差分析后可知，與CK相比，所有的處理均表現(xiàn)為差異顯著（P＜0.05）。由圖6 可知，HHCB 單一污染對(duì)放線菌生長(zhǎng)表現(xiàn)為抑制作用，H1、H2 和H3 處理的放線菌基因拷貝數(shù)分別顯著低于CK 38.59%、79.56%和84.78%。Cd 單一污染對(duì)放線菌生長(zhǎng)表現(xiàn)為抑制作用，H4 處理的放線菌基因拷貝數(shù)顯著低于對(duì)照組80.5%。HHCB 與Cd 復(fù)合污染對(duì)放線菌生長(zhǎng)表現(xiàn)為抑制作用，H5、H6 和H7 處理的放線菌基因拷貝數(shù)分別顯著低于CK 46.80%、68.02%和92.29%。試驗(yàn)結(jié)果表明，HHCB 與Cd 單一及復(fù)合污染對(duì)放線菌表現(xiàn)為抑制作用，且放線菌基因拷貝數(shù)隨著HHCB濃度的增加而減少。

2.2 HHCB與Cd污染對(duì)土壤酶活性的影響

土壤酶來(lái)源于土壤根系微生物的生命活動(dòng)，能夠有效地催化土壤根系活動(dòng)[14]。土壤酶能夠催化土壤內(nèi)復(fù)雜的生化反應(yīng)，例如腐殖質(zhì)的分解合成以及有機(jī)物的水解與轉(zhuǎn)化等，因此土壤酶活性反映了特定土壤條件下生化過(guò)程的相對(duì)強(qiáng)弱[15]。通過(guò)測(cè)定相應(yīng)酶的活性，能夠間接了解物質(zhì)在土壤中的代謝情況，因此可通過(guò)測(cè)定土壤酶活性來(lái)判斷土壤修復(fù)的程度。

2.2.1 HHCB與Cd污染對(duì)脲酶活性的影響

不同處理脲酶活性方差分析結(jié)果見圖7，培養(yǎng)時(shí)間為1 d時(shí)，與CK相比，除H3和H7外，其他處理濃度均表現(xiàn)為差異顯著（P＜0.05）。HHCB 單一污染對(duì)脲酶活性表現(xiàn)為抑制作用，H1和H2處理的脲酶活性分別顯著低于CK 11.67%和28.08%。Cd 單一污染對(duì)脲酶活性表現(xiàn)為促進(jìn)作用，H4 處理的脲酶活性顯著高于CK 67.17%。HHCB 與Cd 復(fù)合污染對(duì)脲酶活性也表現(xiàn)為抑制作用，H5和H6處理的脲酶活性的分別顯著低于CK 14.50%和26.24%。

培養(yǎng)時(shí)間為80 d時(shí)，與CK相比，所有的處理均表現(xiàn)為差異顯著（P＜0.05）。HHCB 單一污染對(duì)脲酶活性表現(xiàn)為抑制作用，H1、H2 和H3 處理的脲酶活性分別顯著低于CK 17.60%、32.25%和19.85%。Cd 單一污染對(duì)脲酶活性表現(xiàn)為促進(jìn)作用，H4 處理的脲酶活性顯著高于CK 50.42%。HHCB 與Cd 復(fù)合污染對(duì)脲酶活性表現(xiàn)為抑制作用，H5、H6 和H7 處理的脲酶活性分別顯著低于CK 15.01%、26.70%和18.9%。培養(yǎng)時(shí)間為80 d時(shí)，各處理濃度的脲酶活性均低于培養(yǎng)時(shí)間為1 d 的脲酶活性，CK、H1、H2、H3、H4、H5、H6 和H7 分別低于培養(yǎng)時(shí)間為1 d 時(shí)的0.90%、7.50%、6.60%、7.20%、9.85%、1.40%、0.60%和2.46%。試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)時(shí)間為1 d 時(shí)，HHCB 單一及與Cd 復(fù)合污染對(duì)脲酶活性表現(xiàn)為抑制作用（H3、H7 除外）。培養(yǎng)時(shí)間為80 d 時(shí)，HHCB 單一及與Cd 復(fù)合污染對(duì)脲酶活性表現(xiàn)為抑制作用。

2.2.2 HHCB與Cd污染對(duì)蔗糖酶活性的影響

不同處理下蔗糖酶活性方差分析結(jié)果見圖8，培養(yǎng)時(shí)間為1 d 時(shí)，與CK 相比，所有處理濃度均表現(xiàn)為差異顯著（P＜0.05）。HHCB單一污染對(duì)蔗糖酶活性表現(xiàn)為抑制作用，H1、H2 和H3 處理的蔗糖酶活性分別顯著低于CK 22.90%、54.20%和64.13%。Cd 單一污染對(duì)蔗糖酶活性表現(xiàn)為抑制作用，H4處理的蔗糖酶活性顯著低于CK 33.72%。HHCB 與Cd 復(fù)合污染對(duì)蔗糖酶活性表現(xiàn)為抑制作用，H5、H6 和H7 處理的蔗糖酶活性分別顯著低于CK 39.82%、55.39%和67.90%。

培養(yǎng)時(shí)間為80 d時(shí)，與CK相比，所有的處理均表現(xiàn)為差異顯著（P＜0.05）。HHCB 單一污染對(duì)蔗糖酶活性表現(xiàn)為抑制作用，H1、H2 和H3 處理的蔗糖酶活性分別顯著低于CK 16.80%、37.01%和51.98%。Cd單一污染對(duì)蔗糖酶活性表現(xiàn)為抑制作用，H4 處理的蔗糖酶活性顯著低于CK 10.70%。HHCB 與Cd 復(fù)合污染對(duì)蔗糖酶活性表現(xiàn)為抑制作用，H5、H6 和H7 處理的蔗糖酶活性分別顯著低于CK 22.40%、44.49%和56.97%。培養(yǎng)時(shí)間為80 d 時(shí)，各處理濃度下的蔗糖酶活性均低于培養(yǎng)時(shí)間為1 d的蔗糖酶活性，CK、H1、H2、H3、H4、H5、H6 和H7 分別低于培養(yǎng)時(shí)間為1 d 時(shí)的29.90%、24.40%、3.70%、6.20%、5.60%、9.70%、12.80%和5.90%。試驗(yàn)結(jié)果表明，HHCB 與Cd 單一及復(fù)合污染對(duì)蔗糖酶活性均表現(xiàn)為抑制作用。

2.2.3 HHCB與Cd污染對(duì)酸性磷酸酶活性的影響

不同處理下酸性磷酸酶活性方差分析結(jié)果見圖9，培養(yǎng)時(shí)間為1 d 時(shí)，與CK 相比，所有處理濃度均表現(xiàn)為差異顯著（P＜0.05）。HHCB 單一污染對(duì)酸性磷酸酶活性表現(xiàn)為抑制作用，H1、H2 和H3 處理的酸性磷酸酶活性分別顯著低于CK 24.20%、22.40%和16.48%。Cd 單一污染對(duì)酸性磷酸酶活性表現(xiàn)為抑制作用，H4 處理的酸性磷酸酶活性顯著低于CK 13.76%。HHCB 與Cd 復(fù)合污染對(duì)酸性磷酸酶活性表現(xiàn)為抑制作用，H5、H6 和H7 處理的酸性磷酸酶活性分別顯著低于CK 31.13%、13.39%和12.87%。

培養(yǎng)時(shí)間為80 d 時(shí)，與CK 相比所有處理濃度均表現(xiàn)為差異顯著（P＜0.05）。HHCB 單一污染下，H1對(duì)酸性磷酸酶活性表現(xiàn)為抑制作用，H2和H3對(duì)酸性磷酸酶活性表現(xiàn)為促進(jìn)作用。H1處理的酸性磷酸酶活性顯著低于CK 13.60%，H2 和H3 處理的酸性磷酸酶活性分別顯著高于CK 37.00%和81.70%。HHCB與Cd 復(fù)合污染下，H5 對(duì)酸性磷酸酶活性表現(xiàn)為抑制作用，H6 和H7 對(duì)酸性磷酸酶活性表現(xiàn)為促進(jìn)作用。H5 處理的酸性磷酸酶活性顯著低于CK 23.40%，H6和H7 處理的酸性磷酸酶活性分別顯著高于CK 37.80%和71.90%。培養(yǎng)時(shí)間為80 d 時(shí)，各處理濃度的酸性磷酸酶活性均高于培養(yǎng)時(shí)間為1 d的酸性磷酸酶活性，CK、H1、H2、H3、H4、H5、H6 和H7 分別高于培養(yǎng)時(shí)間為1 d 時(shí)的20.50%、37.40%、112.90%、162.30%、40.15%、34.09%、92.99%和137.80%。試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)時(shí)間為1 d 時(shí)，HHCB 與Cd 單一及復(fù)合污染下對(duì)酸性磷酸酶活性表現(xiàn)為抑制作用。培養(yǎng)時(shí)間為80 d 時(shí)，HHCB 單一及與Cd 復(fù)合污染對(duì)酸性磷酸酶活性表現(xiàn)為促進(jìn)作用（H1、H5 除外），H1 和H5對(duì)酸性磷酸酶活性表現(xiàn)為抑制作用。

3 討論

本研究中，HHCB 單一及與Cd 復(fù)合污染對(duì)真菌生長(zhǎng)表現(xiàn)為促進(jìn)作用。BARAN 等[16]發(fā)現(xiàn)在被有機(jī)物污染的土壤中產(chǎn)生的真菌具有降解污染物的能力。微生物適應(yīng)后，其呼吸強(qiáng)度、發(fā)育程度和降解污染物的能力都有所提高。由此推測(cè)產(chǎn)生該結(jié)果的原因主要是微生物對(duì)污染物的適應(yīng)作用或利用降解后污染物作為碳源和能量。

本研究中，培養(yǎng)時(shí)間為1 d 時(shí)，HHCB 與Cd 單一及復(fù)合污染顯著抑制了細(xì)菌和放線菌生長(zhǎng)，可能是由于HHCB 作為一種脂溶性化合物，使細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，外部的污染物質(zhì)更容易侵入微生物細(xì)胞，從而抑制微生物細(xì)胞生長(zhǎng)；而Cd 作為常見的重金屬毒性物質(zhì)，能夠在HHCB 的基礎(chǔ)上進(jìn)一步增加對(duì)微生物細(xì)胞的毒性[17]。

本研究中，HHCB 單一及與Cd 復(fù)合污染顯著抑制了脲酶和蔗糖酶的活性。該結(jié)果可能是由于HHCB 與土壤酶分子中的活性部分結(jié)合，與底物形成了競(jìng)爭(zhēng)作用，進(jìn)而抑制了脲酶的活性[18]；而土壤蔗糖酶可增加土壤中的易溶性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，HHCB 作為一種疏水性物質(zhì)，會(huì)降低易溶性的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)溶解，且有助于提高Cd2+生物有效性，促進(jìn)土壤對(duì)HHCB 的吸附固定，進(jìn)而抑制蔗糖酶活性；在培養(yǎng)時(shí)間為80 d 時(shí)，100 mg·kg-1HHCB 的單一及與Cd 復(fù)合污染顯著抑制酸性磷酸酶活性，而400、800 mg·kg-1HHCB 的單一及與Cd復(fù)合污染則顯著促進(jìn)酸性磷酸酶活性。這可能是由于隨著土壤中HHCB 濃度的增大，激活了土壤中能夠降解HHCB 的那部分微生物的活性，從而加快了酶的合成，提高了酶活性[19]。

HHCB 與Cd 單一及復(fù)合污染對(duì)脲酶、蔗糖酶和酸性磷酸酶的活性產(chǎn)生了不同程度的影響，其主要原因可能有兩點(diǎn)：其一，土壤酶在不同土壤環(huán)境中表現(xiàn)出的功能差異。脲酶與土壤中氮的轉(zhuǎn)化相關(guān)，酸性磷酸酶與土壤中有機(jī)磷的分解轉(zhuǎn)化有關(guān)，而蔗糖酶與土壤中有機(jī)質(zhì)的轉(zhuǎn)化有關(guān)，因此不同土壤酶對(duì)污染物的影響表現(xiàn)出不同的效應(yīng)[20]。其二，土壤酶對(duì)復(fù)合污染物的響應(yīng)機(jī)制相對(duì)復(fù)雜，并非單一污染物的簡(jiǎn)單疊加作用，土壤酶會(huì)隨著污染物種類、土壤類型以及自然條件下的環(huán)境因素的變化而變化[21]。此外，其他原因也能導(dǎo)致HHCB 單一及與Cd 復(fù)合污染對(duì)土壤酶活性的作用不同，這還需進(jìn)一步研究分析。

4 結(jié)論

（1）平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，HHCB 單一及與Cd復(fù)合污染培養(yǎng)時(shí)間為1 d時(shí)，對(duì)細(xì)菌表現(xiàn)為抑制作用，培養(yǎng)時(shí)間為80 d 時(shí)，對(duì)細(xì)菌表現(xiàn)為促進(jìn)作用（HHCB為100 mg·kg-1的單一污染除外），對(duì)真菌生長(zhǎng)均表現(xiàn)為促進(jìn)作用，對(duì)放線菌生長(zhǎng)均表現(xiàn)為抑制作用。熒光qPCR 法下，細(xì)菌16S rRNA 基因拷貝數(shù)隨著HHCB 濃度的升高而增加，而真菌18S rRNA基因拷貝數(shù)和放線菌拷貝數(shù)隨著HHCB濃度的升高而降低。

（2）培養(yǎng)時(shí)間為1 d 時(shí)，HHCB 單一及與Cd 復(fù)合污染對(duì)脲酶活性表現(xiàn)為抑制作用（HHCB 為800 mg·kg-1污染除外），對(duì)蔗糖酶和酸性磷酸酶表現(xiàn)為抑制作用；培養(yǎng)時(shí)間為80 d 時(shí)，對(duì)脲酶表現(xiàn)為抑制作用。培養(yǎng)時(shí)間為80 d 時(shí)，400、800 mg·kg-1HHCB 單一及與Cd復(fù)合污染對(duì)酸性磷酸酶活性表現(xiàn)為促進(jìn)作用。