朱文博，張秋萍，許繼飛，2*，龐小可，劉建國，趙吉，2

（1.內(nèi)蒙古大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，呼和浩特 010021；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)環(huán)境污染控制與廢物資源化重點實驗室，呼和浩特 010021；3.內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué)能源與動力工程學(xué)院，呼和浩特 010051）

在畜牧養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展的同時，大量畜禽糞便產(chǎn)生，我國每年畜禽糞污產(chǎn)生量高達38 億t，其中牛糞占比最高，這些糞便若不能得到合理處置，將造成不容忽視的環(huán)境污染[1-2]。近年來，畜禽糞便中的抗生素抗性污染問題日益凸顯，抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）在畜禽糞便中被頻繁檢出，尤其是四環(huán)素類抗性基因（Tetracycline resistance genes，TRGs）[3-5]。當(dāng)糞便進入環(huán)境后，糞源ARGs 會在環(huán)境微生物間轉(zhuǎn)移和傳播，從而對人類健康和生態(tài)系統(tǒng)造成長期、不可逆的危害[6-7]。厭氧消化是糞便資源化利用的一種主要方式，也是在源頭上削減環(huán)境抗生素抗性的管控措施之一[8]。因此，許多研究關(guān)注厭氧消化對畜禽糞便中ARGs 尤其是牛糞中TRGs 的削減作用[9-12]。

消化原料是畜禽糞便厭氧消化的一個重要因素[13]，對ARGs 的削減效果有顯著影響[14]。CHENG等[4]的研究表明，來源于不同養(yǎng)殖場的豬糞經(jīng)厭氧消化后ARGs 的變化不同。CHEN 等[15]和SUI 等[16]發(fā)現(xiàn)厭氧消化對同一養(yǎng)豬場不同時間段豬糞原料中ARGs的去除效果也具有顯著差異。消化原料的差異實質(zhì)上是理化性質(zhì)的差異，其可能是養(yǎng)殖規(guī)模大小、牲畜飲水浪費水量、清糞方式（干清糞或水清糞）甚至季節(jié)間的差異等造成的[17]。對于養(yǎng)殖場，無論是清糞方式還是牲畜飲水浪費水量的不同都將在糞便的收集過程中造成廢水干預(yù)，直接影響消化原料的理化性質(zhì)[18]。另外，原料的差異也會影響厭氧消化過程中的微生物群落[19]，而微生物群落又是改變ARGs 行為特征的主要因素[19-21]。由此可知，廢水干預(yù)必然會改變糞便的理化性質(zhì)，進而影響厭氧消化對ARGs 的去除效果。然而，以廢水干預(yù)后的糞便為消化原料，對消化過程中ARGs豐度變化的研究鮮有報道。

溫度也是影響厭氧消化和ARGs 豐度變化的一個重要工藝參數(shù)，研究表明高溫厭氧消化較中溫相比產(chǎn)氣量更高且在ARGs 的削減方面更有優(yōu)勢[9，22]。因此，本研究開展不同牛糞原料濃度的高溫厭氧消化試驗，以TRGs為研究對象，主要探究廢水干預(yù)下的牛糞原料在厭氧消化過程中ARGs 的變化特征，并探尋不同原料濃度條件下ARGs、微生物群落和理化因子間的相互關(guān)系，從ARGs 削減角度為畜禽糞便的管理提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在內(nèi)蒙古呼和浩特某規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場的非沖洗時間段采集糞便收集池中的牛糞，4 ℃保存運回實驗室。牛糞樣品總固體含量（TS）為3%，pH 為6.86，氨氮（TAN）濃度為789.19 mg·L-1，可溶性COD（SCOD）濃度為6 828.57 mg·L-1，總揮發(fā)酸（TVFAs）濃度為7 120 mg·L-1，總磷（TP）含量為46.33 mg·L-1。牛糞樣品為液態(tài)，因此直接添加蒸餾水將牛糞分別稀釋至原濃度的100%（不稀釋）、75%、50%和25%，作為厭氧消化的不同原料。選用體積為1.1 L 的厭氧瓶，加入1 L 不同濃度消化原料后通氮氣5～8 min。采用并未檢測出ARGs 的厭氧微生物菌劑（廣州微生源，中國）作為接種物，其主要為水解發(fā)酵菌和產(chǎn)甲烷菌等厭氧微生物，接種率為0.1%。反應(yīng)溫度為（55±1）℃，每組處理設(shè)置3個重復(fù)。

1.2 樣品的采集與測定

通過排水法收集氣體，并記錄每24 h 的產(chǎn)氣量。在反應(yīng)前、第6 d、第14 d 和反應(yīng)結(jié)束時采集樣品，每次采集樣品1 mL 于離心管內(nèi)，12 000 r·min-1離心5 min，上清液用于理化性質(zhì)的測定，沉淀物于-80 ℃保存，用于ARGs、intⅠ1和16S rRNA的定量分析以及微生物群落分析。

甲烷含量采用沼氣分析儀（MRU Optima7，德國）測定；SCOD 采用重鉻酸鉀法測定；TAN 采用納氏試劑光度法測定；TVFAs 通過酸性氯化鐵比色法測定；pH通過pH計（PHS-3E，上海雷磁）測定；TP通過鉬銻抗分光光度法測定。

1.3 ARGs、intⅠ1和16S rRNA的定量分析

基因組DNA 的提?。翰捎眉S便基因組DNA 提取試劑盒（天根DP-328，北京）提取每毫升樣品沉淀物中的DNA，具體步驟參照試劑盒說明書。所提取DNA 用超微量紫外分光光度計（Nanodrop-2000，美國）檢測其含量和純度（A260/280為1.7～2.0）。

實時熒光定量PCR（qPCR）：通過普通PCR 儀（ABI 9902，美國）對糞便原料中17 種ARGs（tetA、tetB、tetC、tetE、tetG、tetO、tetQ、tetT、tetW、tetX、sul1、sul2、dfrA1、dfrA7、ermB、ermC和ermF）進行檢測，共有7 種TRGs 呈陽性，包括編碼外排泵基因（tetC、tetG）、編碼核糖體保護蛋白基因（tetO、tetQ、tetT、tetW）和轉(zhuǎn)座酶修飾基因（tetX）[23]。接著采用熒光定量系統(tǒng)（Bio-Rad CFX96，美國）對7個TRGs、Ⅰ類整合酶基因intⅠ1 和16S rRNA 基因進行定量分析，qPCR 所用引物序列、退火溫度和反應(yīng)程序等詳見文獻[12，21]。

1.4 高通量測序

將提取的DNA 委托上海派森諾生物公司，利用Illumina Novaseq 平臺進行16S rRNA 高通量測序。測序區(qū)域為V3～V4 區(qū)，引物為338F（ACTCCTACGGCAGGCAGCA）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）。原始序列經(jīng)質(zhì)控后得到高質(zhì)量序列，并在SILVA 16S rRNA數(shù)據(jù)庫中進行比對。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Office 2013 進行原始數(shù)據(jù)整理，SPSS 22.0 進行單因素方差分析和Pearson 相關(guān)性分析，Canoco 5.0 完成冗余分析，Origin Pro 9.0 和R 3.5.3作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 厭氧消化性能

不同厭氧消化過程中產(chǎn)沼氣速率如圖1 所示。消化前期產(chǎn)氣速率迅速上升，在第5～7 d 達到產(chǎn)氣高峰，隨后逐漸下降，直至30 d 以后產(chǎn)氣速率穩(wěn)定。不同原料濃度厭氧消化之間產(chǎn)氣速率相似，最大產(chǎn)氣速率略有差異，100%、75%、50%、25%原料濃度條件下的最大產(chǎn)氣速率分別為43.56、45.03、46.67 mL·g-1·d-1和54.00 mL·g-1·d-1。相應(yīng)地，消化后總產(chǎn)氣量分別為358.83、372.44、384.44 mL·g-1和400.89 mL·g-1。與其他關(guān)于牛糞高溫厭氧消化的研究相比，本研究中100%原料濃度的最大產(chǎn)氣速率高于其他研究[24-25]的21.96 mL·g-1·d-1和32.78 mL·g-1·d-1，總產(chǎn)氣量處于其總產(chǎn)氣量182.28 mL·g-1和388.24 mL·g-1之間。原料濃度越低，單位質(zhì)量總固體產(chǎn)氣量越高，這可能是因為原料經(jīng)稀釋后有機物水解速率增大，產(chǎn)酸產(chǎn)氣菌可利用的有機質(zhì)增加。杜連柱等[26]在關(guān)于豬糞原料濃度對厭氧消化產(chǎn)氣性能影響的研究中也得出了相似結(jié)論，即隨著原料濃度降低產(chǎn)氣量升高。厭氧消化結(jié)束時NH+4-N 濃度為554.72～1 474.14 mg·L-1，低于氨氮抑制濃度[27-28]，且整個厭氧消化過程中pH 基本維持在7～8，表明不同原料濃度厭氧消化系統(tǒng)均穩(wěn)定運行。

2.2 ARGs和intⅠ1豐度變化

大規(guī)模養(yǎng)殖場牛糞中檢出7 種ARGs，包括tetC、tetG、tetO、tetQ、tetT、tetW 和tetX，均為TRGs，這是因為四環(huán)素類藥物在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中使用量最大，在畜禽糞便中的殘留也最高[29]。ZHU 等[3]的研究也表明TRGs在動物糞便中檢出頻率最高。7 種TRGs 中，tetW 的絕對豐度最高，為1.70×109copies·mL-1，占總豐度的61.34%，這可能是由于tetW 與一個編碼功能蛋白的mob基因有關(guān)，從而使其更易在動物腸道菌和病原菌之間轉(zhuǎn)移[30]，因此，tetW 是厭氧消化過程中的重點關(guān)注對象。

為了在同一水平對比不同處理對TRGs 的作用，用基因相對豐度（基因拷貝數(shù)與16S 拷貝數(shù)的比值）來反映TRGs 的變化。如圖2 所示，牛糞原料中7 種TRGs 的總相對豐度為3.59×10-2，隨著厭氧消化反應(yīng)的推進，總相對豐度顯著增加。消化結(jié)束后，100%、75%、50%、25%原料濃度條件下的總相對豐度分別為7.10×10-1、7.79×10-1、5.55×10-1和5.04×10-1，隨著原料濃度的降低，總相對豐度呈先升高后降低的趨勢，在75%和25%時分別達到最大值和最小值。tetW 在消化開始后相對豐度增加且占比增加，達到94.84%～99.70%，這也是總相對豐度升高的主要原因。除去tetW，6種TRGs的總相對豐度均隨消化過程進行而降低，且100%條件下最低，25%條件下最高。由此可見，若要對比不同處理對TRGs削減的影響，還需分析單個TRGs的變化趨勢。

圖3 為各TRGs 相對豐度在厭氧消化前后的倍數(shù)變化值（消化后豐度與消化前豐度的比值），倍數(shù)變化值小于1 表示基因被削減，大于1 表示基因被富集。tetC 和tetG 在厭氧消化后均被富集，相對豐度分別為消化前的1.32～14.34 倍和2.65～31.26 倍。隨著原料濃度的降低，tetC的倍數(shù)變化值呈鋸齒狀上升，tetG則先降低后升高，且二者均在25%條件下富集程度最高。tetO、tetQ 和tetT 幾乎在所有條件下被削減，只有50%條件下的tetO 相對豐度升高至原來的2.07 倍。對比不同處理可知，tetO和tetQ的倍數(shù)變化值在100%條件下均最低，而tetT 的倍數(shù)變化值在25%條件下最低，表明較低原料濃度抑制了tetO 和tetQ 的削減，但一定程度上促進了tetT 的去除。如前所述，tetW 相對豐度的增加是總相對豐度增加的主導(dǎo)因素之一，其倍數(shù)高達22 倍以上，其中75%和25%條件下的倍數(shù)分別為最大（34.99 倍）和最小（22.51 倍），與總相對豐度的規(guī)律一致。tetX 的相對豐度在50%條件下增加至原來的2.25 倍，而在其他3 種條件下降低，且25%時降低幅度最大。

由以上分析可知，不同原料濃度下的TRGs 變化具有顯著差異，且原料濃度對TRGs 的削減規(guī)律不一致。整體來看，較低濃度的厭氧消化增加了大部分TRGs的富集程度。許多研究表明理化性質(zhì)和微生物群落貢獻了ARGs 的變化[19-21]。當(dāng)原料濃度較低時，一些對氨氮耐受程度較低的微生物出現(xiàn)競爭優(yōu)勢，其有可能攜帶ARGs從而導(dǎo)致豐度升高[31]。又或者原料含水量高時有機物水解能力增大，使得一些產(chǎn)酸產(chǎn)氣菌的代謝活動增強，這類微生物通常也攜帶ARGs，從而導(dǎo)致ARGs 富集程度明顯增加[32]。ARGs 在微生物間的傳播也是ARGs 富集的主要原因之一，intⅠ1 作為一類整合子通常參與ARGs的水平基因轉(zhuǎn)移[33]。如圖3 所示，intⅠ1 的相對豐度在消化后均增加，且較低原料濃度條件（75%～25%）下其倍數(shù)變化值遠大于1，這表明較低濃度的牛糞經(jīng)厭氧消化后TRGs 傳播的風(fēng)險增強。從大部分TRGs 以及intⅠ1 變化的角度考慮，實際工程中廢水的干預(yù)可能不利于厭氧消化對牛糞TRGs 的削減作用。

2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)

前人研究表明微生物群落的變化是ARGs 變化的驅(qū)動因子，因此，探究不同處理間TRGs變化的差異需從微生物群落入手，分析不同處理間微生物群落的差異。圖4 為消化過程中門水平微生物群落結(jié)構(gòu)，從圖中可以看出，消化原料中Firmicutes 為第一優(yōu)勢菌門，相對豐度為68.22%，其次為Bacteroidetes 和Proteobacteria，相對豐度分別為23.32%和6.29%。消化后不同處理中優(yōu)勢菌門有所改變，100%和75%原料濃度條件下Firmicutes 仍為第一優(yōu)勢菌門，相對豐度均為40.46%，而50%和25%原料濃度條件下的第一優(yōu)勢菌門變?yōu)镻roteobacteria，相對豐度分別為34.98%和35.57%。另外，整個消化過程中Firmicutes 的相對豐度均隨著原料濃度的減小而降低，而Proteobacteria的相對豐度呈相反趨勢。這是由于Firmicutes在纖維素的降解中起關(guān)鍵作用，隨著有機物含量的減少，可供Firmicutes 吸收利用的物質(zhì)減少，其豐度不斷減小[34]；Proteobacteria 可能為兼性或?qū)Ｐ詤捬跫毦蚬褷I養(yǎng)菌，其在厭氧環(huán)境或有機物質(zhì)含量較少的情況下更易生存[35]。

圖5 為厭氧消化過程中屬水平微生物（前50）的豐度變化情況，其中按行（樣本）進行標(biāo)準(zhǔn)化。經(jīng)厭氧消化后，屬水平微生物變化較為明顯。一些菌屬經(jīng)消化后相對豐度顯著降低甚至被殺滅，如Oscillospira、Sedimentibacter和Paludibacter等；而一些菌屬經(jīng)消化后相對豐度顯著增加，如Rhodococcus、Bosea和unidentified_Christensenellaceae等。不同處理間屬水平微生物差異也較為明顯。消化初期（第6 d），Sedimentibacter、unidentified_Peptostreptococcaceae和unclassified_Clostridiales等的相對豐度隨著原料濃度的降低而減小，而Oscillospira、unidentified_p-2534-18B5和Aquabacterium的相對豐度呈相反趨勢，且Pseudomonas、Comamonas和Brevundimonas等的相對豐度在75%條件下最高。隨著消化反應(yīng)的進行，第14 d 時Aquabacterium、Pseudomonas和Arcobacter等的相對豐度隨著原料濃度的降低而增加，且Dechloromonas和unclassified_Pseudomonadaceae的相對豐度在75%時最高。直至消化結(jié)束，一些消化過程中相對豐度較高的菌屬反而降低，如Aquabacterium、Pseudomonas、Comamonas和Brevundimonas等。較低原料濃度條件下（50%和25%）菌屬Dechloromonas、Rhodococcus和Bosea的相對豐度較高，而較高原料濃度條件下（100%和75%）菌屬unclassified_Ruminococcaceae、unclassified_Bacteroidaceae、Treponema、Clostridium和Syntrophomonas的相對豐度較高。

以上證據(jù)皆表明不同原料濃度條件下的厭氧消化微生物群落差異較為明顯，尤其是菌門Firmicutes和Proteobacteria，及菌屬Dechloromonas、Rhodococcus、Syntrophomonas和Treponema等。WANG 等[36]的 研 究中表明Firmicutes 和Proteobacteria 通常是ARGs 的潛在宿主菌門，Treponema和Syntrophomonas等是ARGs的潛在宿主菌屬。由此可知，這些微生物在不同處理間的差異可在一定程度上解釋不同處理間TRGs變化的差異，微生物與TRGs間的相關(guān)關(guān)系需進一步確認。

2.4 TRGs與intⅠ1、理化性質(zhì)和微生物間的相關(guān)關(guān)系

ARGs與微生物之間的相關(guān)性（P＜0.05）可以表示ARGs 的潛在宿主信息[37]，當(dāng)厭氧消化條件改變時，ARGs 的潛在宿主也可能改變。不同處理條件下的TRGs、intⅠ1和微生物之間的相關(guān)性如圖6所示。隨著原料濃度從100%降低至25%，tetC 的潛在宿主菌由4個逐漸減少為1 個（unclassified_Pseudomonadaceae），盡管潛在宿主菌數(shù)目變少，但25%時unclassified_Pseudomonadaceae較高的相對豐度造成了tetC在此條件下的相對豐度最大。tetG 的潛在宿主菌數(shù)目則隨著原料濃度的降低而增加，且在25%時tetG 與intⅠ1有相關(guān)關(guān)系，這可能是tetG 的倍數(shù)變化值隨原料濃度降低而增大的原因。在50%條件下，tetO 潛在宿主菌數(shù)目較多（3 個），且其相對豐度在消化后高于其他處理，反映了tetO 只在此條件下被富集。tetQ 和tetT的潛在宿主菌相似，這些潛在宿主菌相對豐度經(jīng)消化后減小則代表了tetQ 和tetT 的削減。對于tetW，unidentified_Bacteroidales、unidentified_Ruminococcaceae和Sphaerochaeta只在50%或25%條件下為其潛在宿主菌，這3種菌屬在50%或25%條件下較低的相對豐度也代表了tetW 較低的相對豐度。tetX 在50%條件下的潛在宿主菌為unclassified_Clostridiales，同時此菌屬也為50%條件下tetO 的潛在宿主菌，這反映了tetX 的相對豐度變化與tetO 一致，即50%條件下的倍數(shù)變化值遠高于其他條件。IntⅠ1 與TRGs 的潛在宿主菌幾乎未有重合，說明厭氧消化過程中TRGs 的變化更多地歸因于微生物群落演替而不是水平基因轉(zhuǎn)移。

宿主菌的變化代表了ARGs 的變化，而理化性質(zhì)的變化又影響了宿主菌的變化[18，30]。因此，通過冗余分析來探究不同處理中影響宿主菌變化的關(guān)鍵理化因子（圖7）。數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理，一軸和二軸對潛在宿主菌變化的解釋度占總變量的52.01%，不同處理之間潛在宿主菌的變化差異較為明顯（P=0.001）。原點與unclassified_Pseudomonadaceae、unidentified_R4-45B和unidentified_RPF12的連線指向25%條件，表示這幾種菌屬的相對豐度在此條件下較高，且它們?yōu)閠etC 和tetG 在此條件下的潛在宿主菌，與TAN 呈負相關(guān)，表明這些菌屬可能不耐受高TAN 濃度，25%條件下TAN 濃度較低時菌屬相對豐度較高，從而解釋了此條件下tetC 和tetG 富集程度最大的原因。TAN 和pH 也與tetQ 和tetT 的潛在宿主菌Proteiniclasticum、Oscillospira和Paludibacter呈負相關(guān)，表明較高原料濃度條件下（100%和75%）TAN 和pH 較高時菌屬的相對豐度較低，反映了此條件下tetQ 和tetT 的削減效果較好。tetO 在50%條件下的潛在宿主菌Bosea和W22與SCOD 和TVFAs 呈負相關(guān)，表明此菌屬可能為寡營養(yǎng)菌，當(dāng)SCOD 和TVFAs 濃度較低時菌屬的相對豐度較高，使得tetO 在此條件下富集。Sphaerochaeta和unidentified_Bacteroidales為tetW 在50%和25%條件下的潛在宿主菌，其與TAN 呈正相關(guān)，50%和25%條件下TAN 濃度較低，從而潛在宿主菌的豐度較低，tetW 的富集程度較弱。結(jié)合圖6 與圖7，TAN 和pH 與tetQ 和tetT 的潛在宿主菌Proteiniclasticum、Oscillospira和Paludibacter，tetC 和tetG 的潛在宿主菌unclassified_Pseudomonadaceae、unidentified_R4-45B和unidentified_RPF12以及tetW 的潛在宿主菌Sphaerochaeta和unidentified_Bacteroidales均存在相關(guān)關(guān)系，SCOD 和TVFAs 與tetO 的潛在宿主菌Bosea和W22存在相關(guān)關(guān)系。由此可知，理化因子在一定程度上解釋了潛在宿主菌的變化及其對TRGs 變化的影響，即TAN 和pH 與大部分TRGs 如tetC、tetG、tetQ、tetT 和tetW 的變化有關(guān)，而SCOD 和TVFAs 與tetO 的變化有關(guān)。

3 結(jié)論

（1）原料濃度對產(chǎn)氣速率無明顯影響，但總產(chǎn)氣量隨著原料濃度的降低而逐漸增加。

（2）經(jīng)厭氧消化后，tetC、tetG、tetO 和tetX 以及intⅠ1 在較低原料濃度條件下（75%～25%）相對豐度更高，富集程度更明顯。

（3）隨著原料濃度的降低，優(yōu)勢菌門從Firmicutes變?yōu)镻roteobacteria，且TRGs潛在宿主菌的種類和數(shù)目均改變。理化因子通過影響潛在宿主菌的變化從而影響TRGs的變化，TAN和pH與tetC、tetG、tetQ、tetT和tetW的變化有關(guān)，SCOD和TVFAs與tetO的變化有關(guān)。

（4）與100%原料濃度相比，75%～25%原料濃度條件下大部分TRGs 和intⅠ1 的相對豐度更高，說明廢水的干預(yù)不利于糞便中TRGs 的削減，從而增加糞便后續(xù)土地利用過程中TRGs的傳播風(fēng)險。