曾民，曾黎瓊，王玲仙，李娥賢，鐘巧芳，趙白英，郭蓉

（1.云南農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，昆明 650223；2.云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650223；3.云南農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，昆明 650205；4.元江縣農(nóng)村產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心，云南 元江 653300）

2014 年《全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)約2.0×107hm2耕地受到重金屬的污染，占總耕地面積的19.4%，其中鎘（Cd）污染位列第一[1]。水稻是我國(guó)第一大糧食作物，我國(guó)有2/3 的人口以水稻為主食，與其他作物相比，水稻具有大量吸收積累鎘的特性[2]，因此稻米安全成為事關(guān)糧食安全的重要課題[3]。研究表明，不同水稻品種對(duì)鎘的吸收和富集存在明顯的品種間遺傳差異[4]。因此篩選鎘低積累水稻資源，培育低鎘品種是解決水稻鎘污染問(wèn)題最直接且最經(jīng)濟(jì)的方法[5]。目前，已從現(xiàn)有品種中篩選出多份鎘低積累品種[6-7]，但這些品種多屬于現(xiàn)代栽培稻，是以產(chǎn)量、品質(zhì)為育種目標(biāo)進(jìn)行選育的，為加快育種進(jìn)程，除目標(biāo)性狀外，會(huì)選擇其他性狀均相對(duì)一致的材料作為其親本，這將造成其后代遺傳背景相對(duì)狹窄，導(dǎo)致鑒定到的與鎘低積累相關(guān)的基因相對(duì)較少，進(jìn)一步增加了低鎘新種質(zhì)篩選的難度[8]。

野生稻是現(xiàn)代栽培稻的祖先，是水稻種質(zhì)資源的天然基因庫(kù)，在漫長(zhǎng)的獨(dú)立進(jìn)化過(guò)程中，野生稻經(jīng)受各種災(zāi)害和不良環(huán)境的自然選擇，形成了極其豐富的遺傳多樣性，擁有栽培稻所不具有的或已消失的許多優(yōu)良遺傳基因。研究表明，從野生稻中發(fā)掘新耐性基因的幾率是現(xiàn)代栽培稻的50倍[9]。

本試驗(yàn)在鎘污染稻田種植120 份元江普通野生稻滲入系材料，通過(guò)測(cè)定各材料籽粒的鎘含量，篩選出鎘低積累和高富集的稻種資源，并分析元江普通野生稻滲入系后代籽粒鎘含量與田間主要農(nóng)藝性狀之間的相關(guān)性，探討能否通過(guò)田間農(nóng)藝性狀初步判斷滲入系株系籽粒鎘含量。本研究不僅可拓寬水稻在鎘吸收富集方面的遺傳背景，還可為低鎘品種的選育和水稻鎘積累機(jī)理的研究提供種質(zhì)材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及地點(diǎn)

選取元江普通野生稻BC3F4群體中表型差異的120 份滲入系株系作為試驗(yàn)材料，將其種植于鎘污染的農(nóng)田。該群體是以元江普通野生稻為母本，合系35 為父本，通過(guò)雜交、胚挽救、回交等方法形成的研究群體材料。120份滲入系株系包括秈稻78份，粳稻30份，彩色稻12份（包括紅米、紫米、黑米等）。

試驗(yàn)地位于滇南某鎘污染水稻主產(chǎn)區(qū)，該地土壤為水稻土，依照網(wǎng)格布點(diǎn)法采集土樣，測(cè)得的土壤基本性質(zhì)如表1所示。

表1 供試土壤的基本性質(zhì)Table1 Basic properties of the tested soil

1.2 田間試驗(yàn)方法

供試材料于2019 年3 月育秧并移栽于鎘污染的稻田內(nèi)。120 份株系材料按照水稻田間育種的方法安排試驗(yàn)，即每份株系材料捆成3份，120份材料作為一組，共分為3 組。每組采用隨機(jī)區(qū)組方式種植，120份材料每份均種植3 行，每行種10 株，株距15 cm，行距20 cm，材料與材料間隔25 cm。每個(gè)小區(qū)面積為0.54 m2（135 cm×40 cm）。田間記錄各小區(qū)苗數(shù)、株高、分蘗數(shù)、生育期、產(chǎn)量、生物量等農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)。

1.3 樣品采集與分析

水稻成熟后按小區(qū)單收，測(cè)定生物量，經(jīng)脫粒后晾曬烘干測(cè)定小區(qū)產(chǎn)量，將各小區(qū)的部分谷粒用礱谷機(jī)脫殼、粉碎機(jī)粉碎后，裝入干凈的10 號(hào)自封袋中保存?zhèn)溆?。所有籽粒樣品根?jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中鎘的測(cè)定》（GB/T 5009.15—2014）標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定，樣品用濕式消解法消解后，用石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定鎘含量，利用大米植物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)參比物質(zhì)GBW10010（GSB-1）和空白樣進(jìn)行分析質(zhì)量控制。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Microsoft Excel 2007 進(jìn)行均值、標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算和繪圖，利用SPSS 19.0 進(jìn)行方差分析和LSD多重比較，相關(guān)性分析采用皮爾遜（Pearson）相關(guān)系數(shù)法，采用非參數(shù)檢驗(yàn)中K個(gè)獨(dú)立樣本檢驗(yàn)不同類型水稻的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 元江普通野生稻滲入系材料籽粒鎘積累的差異性

120 份滲入系材料鎘含量為0.05～3.57 mg·kg-1，最大值是最小值的71.4 倍，差異極顯著，其平均鎘含量為0.31 mg·kg-1。如圖1所示，滲入系材料籽粒鎘含量呈正態(tài)分布，其中14 份材料的鎘積累量＜0.10 mg·kg-1，40 份材料的鎘含量為0.10～0.19 mg·kg-1，25 份材料的鎘含量為0.20～0.29 mg·kg-1，20 份材料的鎘含量為0.30～0.39 mg·kg-1，11 份材料的鎘含量為0.40～0.49 mg·kg-1，7份材料的鎘含量為0.50～0.99 mg·kg-1，3 份材料鎘含量＞1.00 mg·kg-1，鎘含量＜0.10 mg·kg-1的占比11.7%，鎘含量在0.10～0.19 mg·kg-1間的占比33.3%。結(jié)果表明元江普通野生稻滲入系材料籽粒鎘含量多態(tài)性豐富，其中含有大量鎘低積累材料，可作為鎘低積累品種種質(zhì)資源，大部分籽粒鎘含量分布在父母親本籽粒鎘含量的范圍內(nèi)（元江普通野生稻籽粒鎘含量為0.10 mg·kg-1，合光35 籽粒鎘含量為0.42 mg·kg-1），符合雜交組合的遺傳分配定律。

2.2 不同類型滲入系材料鎘積累的差異性

依據(jù)性狀將120 份滲入系材料分為秈稻、粳稻和彩色稻3 種類型，如表2 所示，3 種類型水稻籽粒鎘含量均在種內(nèi)存在顯著差異，其變異系數(shù)較大，3種類型籽粒鎘含量最高值為最低值的75.8 倍。其中彩色稻的籽粒鎘含量與秈稻、粳稻間存在顯著差異（P＜0.05）；秈稻與粳稻間籽粒鎘含量不存在顯著差異。

表2 不同類型滲入系材料籽粒鎘含量Table2 Variations of Cd content in grain within 3 types of rice

2.3 滲入系籽粒鎘含量與農(nóng)藝性狀的相關(guān)性

籽粒鎘含量與滲入系株系農(nóng)藝性狀的相關(guān)性分析結(jié)果表明，株高、分蘗數(shù)、生物量及生育期等性狀與籽粒鎘含量均無(wú)相關(guān)性。如圖2 所示，籽粒鎘含量與水稻產(chǎn)量、結(jié)實(shí)率之間存在極顯著正相關(guān)性（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.666和0.646。

對(duì)3 種類型滲入系株系進(jìn)行籽粒鎘含量與水稻產(chǎn)量、結(jié)實(shí)率的相關(guān)性分析：有色稻的籽粒鎘含量與水稻產(chǎn)量、結(jié)實(shí)率無(wú)相關(guān)性，粳稻和秈稻的籽粒鎘含量與水稻產(chǎn)量、結(jié)實(shí)率之間均呈極顯著正相關(guān)（圖3、圖4）。因此，可將產(chǎn)量和結(jié)實(shí)率作為篩選滲入系株系籽粒鎘含量的田間性狀。

對(duì)低鎘株系（籽粒鎘含量＜0.2 mg·kg-1）進(jìn)行產(chǎn)量和結(jié)實(shí)率的相關(guān)分析，如圖5 所示，產(chǎn)量與結(jié)實(shí)率呈極顯著正相關(guān)（r=0.511，P＜0.01）。這表明結(jié)實(shí)率是影響產(chǎn)量的主要因素之一。

3 討論

低鎘水稻品種選育的關(guān)鍵是挖掘與鎘累積相關(guān)的基因。不同水稻品種對(duì)鎘的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和分配的差異，本質(zhì)是基因不同導(dǎo)致的[10]。水稻根系通過(guò)Nrapm5、Nramp1等基因吸收土壤鎘[11-15]，HMA2、HMA3等基因參與鎘從根部到地上部的運(yùn)輸[16]，LCT1等基因?qū)㈡k轉(zhuǎn)運(yùn)到籽粒[17-19]。水稻基因解析了水稻對(duì)鎘的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)及積累的過(guò)程，但依然未在水稻中發(fā)現(xiàn)顯著影響籽粒鎘含量的基因，在硬質(zhì)小麥中已發(fā)現(xiàn)能顯著降低籽粒鎘含量的基因，并加以應(yīng)用[20]。因此應(yīng)進(jìn)一步發(fā)掘水稻中與鎘積累相關(guān)的基因，更好地解析水稻吸收積累鎘的機(jī)制，為水稻低鎘品種選育提供理論依據(jù)。

新種質(zhì)資源引入有利于發(fā)掘到與鎘積累相關(guān)的基因[21-22]。云南土壤鎘背景值（0.218 mg·kg-1）極顯著高于全國(guó)水平（0.097 mg·kg-1），元江普通野生稻原生境就位于鎘高背景值區(qū)域范圍內(nèi)[23]。研究表明，元江普通野生稻與現(xiàn)代栽培稻相比具有有益礦質(zhì)元素含量高、有害重金屬含量低等特點(diǎn)[24-25]。研究材料元江普通野生稻滲入系后代群體，它是通過(guò)雜交、胚挽救、回交和自交等方法將元江普通野生稻染色體片段滲入到后代株系中，該群體株系遺傳背景相似，但存在不同大片段元江野生稻基因，是進(jìn)行野生稻基因挖掘的優(yōu)良群體材料。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)120 份滲入系后代籽粒鎘積累量的分析，發(fā)現(xiàn)滲入系后代籽粒鎘含量差異顯著，從中獲得了一批籽粒鎘低積累材料。這表明元江普通野生稻滲入系后代群體對(duì)鎘吸收積累方面的遺傳多樣性豐富，可能存在與籽粒鎘低積累相關(guān)的基因，但這還需要進(jìn)一步研究。

利用基因的連鎖遺傳來(lái)尋找與鎘相關(guān)的基因。水稻鎘研究難點(diǎn)之一是只能通過(guò)測(cè)定才能確定籽粒鎘含量，田間很難判斷，尤其在群體材料多時(shí)。基因并不是單獨(dú)存在于染色體上，而是和其他基因共同存在于染色體上，因此相鄰基因間存在連鎖遺傳的特性。與鎘積累相關(guān)的基因是和其他基因一起存在于染色體上，若其距離很近則會(huì)存在連鎖遺傳，如果能將籽粒鎘含量和其他性狀聯(lián)系起來(lái)則可以通過(guò)其他性狀間接對(duì)鎘積累相關(guān)基因進(jìn)行篩選，從而找到與鎘積累相關(guān)的基因?，F(xiàn)有品種是以產(chǎn)量、品質(zhì)等性狀為育種目標(biāo)，通過(guò)系統(tǒng)選育方法選育而成，其遺傳背景相似、遺傳多樣性差。同樣育種要求導(dǎo)致其產(chǎn)量等相關(guān)農(nóng)藝性狀趨于一致，因此很難從農(nóng)藝性狀上分辨其差異，也不可能尋找到其與籽粒鎘含量間的關(guān)系。而元江普通野生稻滲入系群體形態(tài)差異性明顯，多保留有野生稻的各種性狀，因此可能存在與籽粒鎘含量有關(guān)系的性狀。由于滲入系群體的選育周期長(zhǎng)、世代多、群體材料數(shù)量繁多，而且檢測(cè)成本較高，無(wú)法完全通過(guò)檢測(cè)的方法確定籽粒鎘含量。所以通過(guò)120 份滲入系材料籽粒鎘含量與田間農(nóng)藝性狀間的相關(guān)性研究，尋找到與籽粒鎘含量相連鎖的基因或者性狀，這有利于與鎘積累相關(guān)的滲入系后代群體的選擇、保存及研究。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)結(jié)實(shí)率、產(chǎn)量與籽粒鎘含量存在極顯著的相關(guān)性，這表明滲入系群體內(nèi)與產(chǎn)量和結(jié)實(shí)率有關(guān)的基因可能也與籽粒對(duì)鎘的吸收積累相關(guān)，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行分子水平研究，是否能夠發(fā)現(xiàn)與水稻籽粒鎘積累相關(guān)的基因或者某種連鎖的基因，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

（1）元江普通野生稻滲入系材料籽粒鎘積累差異極顯著，籽粒鎘含量遺傳多態(tài)性豐富，含有豐富的鎘低積累材料，鎘含量＜0.2 mg·kg-1的有54 份，占比為45%。

（2）元江普通野生稻滲入系籽粒鎘含量與水稻農(nóng)藝性狀中的產(chǎn)量和結(jié)實(shí)率顯著相關(guān)，與株高、分蘗數(shù)、生物量及生育期等性狀不存在相關(guān)性。

（3）元江普通野生稻滲入系后代所形成的3 種類型水稻籽粒鎘含量在秈稻、粳稻間差異不顯著，但二者均與彩色稻的籽粒鎘含量差異顯著。秈稻、粳稻的產(chǎn)量及結(jié)實(shí)率與籽粒鎘含量存在極顯著相關(guān)性。