張淑萍

（吳江高級(jí)中學(xué) 江蘇蘇州 215200）

表觀遺傳學(xué)（epigenetics）是近年來興起的一門研究生物體或細(xì)胞表觀遺傳變異的遺傳學(xué)分支學(xué)科，它建立在孟德爾經(jīng)典遺傳學(xué)的基礎(chǔ)上，主要研究在沒有DNA序列變化的基礎(chǔ)上，基因表達(dá)的可遺傳性改變。表觀遺傳現(xiàn)象在生物體的生長、發(fā)育和衰老等生命過程中普遍存在，是非常重要的生命現(xiàn)象。其可以從DNA甲基化、組蛋白的修飾（乙?；?、去乙酰化、磷酸化等）、染色質(zhì)重塑、非編碼RNA等多個(gè)水平上調(diào)控基因表達(dá)。

非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）是一類不編碼蛋白質(zhì)的RNA，根據(jù)長度可分為長鏈非編碼RNA（lncRNA）和短鏈非編碼RNA（ncRNA），后者包括干擾小 RNA（siRNA）、微 RNA（miRNA）、核內(nèi)小 RNA（snRNA）、核仁小 RNA（snoRNA）、胞質(zhì)小 RNA（scRNA）、與Piwi蛋白相互作用的RNA（piRNA）和XistRNA等。其中siRNA、miRNA、lncRNA和piRNA影響基因表達(dá)，在基因沉默方面發(fā)揮重要作用進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)。

1 siRNA與表觀遺傳學(xué)

1.1 siRNA的發(fā)現(xiàn)

1999年Hamilton等人在植物中的后轉(zhuǎn)錄基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）現(xiàn)象中發(fā)現(xiàn)了siRNA，并發(fā)表于《科學(xué)》。2年后，Elbashir S等人發(fā)現(xiàn)合成的siRNA可誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物體內(nèi)RNAi作用。

1.2 siRNA的結(jié)構(gòu)

siRNA呈雙鏈結(jié)構(gòu)，其長度通常為21 nt，中間19 nt形成配對(duì)雙鏈，兩端為具有磷酸化的5′端和兩個(gè)不配對(duì)的核苷酸的羥基化3′端，結(jié)構(gòu)圖如圖1所示。

圖1 siRNA的結(jié)構(gòu)示意圖

1.3 siRNA的生物合成

siRNA的生物合成主要包括3個(gè)步驟：被Dicer切割形成雙鏈小片段；組裝復(fù)合物（RISC）；活化RISC復(fù)合物。

1.3.1 Dicer切割

Dicer是一類RNaseⅢ蛋白，當(dāng)病毒基因、人工轉(zhuǎn)入基因和轉(zhuǎn)座子等外源性基因隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，會(huì)在宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生于外源基因互補(bǔ)的dsRNA，隨后dsRNA被Dicer酶切割成大小為21～23 nt的雙鏈siRNA。在siRNA二聚體中，與靶mRNA互補(bǔ)、指導(dǎo)其沉默的一條鏈（反義鏈）為“向?qū)А辨?，介?dǎo)mRNA的降解；另一條鏈（正義鏈）為“旅客”鏈，在siRNA形成有功能的復(fù)合體前被降解。

1.3.2 RISC形成

siRNA的裝載需要雙鏈RNA結(jié)合蛋白R(shí)2D2的幫助，首先R2D2與引導(dǎo)鏈3′端結(jié)合，然后與Dicer、siRNA形成RISC裝載復(fù)合體。R2D2招募Argonaute蛋白，開始組裝RISC。

1.3.3 RISC活化

Argonaute首先與Dicer發(fā)生相互作用，進(jìn)行交換后，結(jié)合到siRNA雙鏈的一端，再與R2D2交換，將整個(gè)雙鏈小RNA都轉(zhuǎn)載到Argonaute中。之后，Argonaute將乘客鏈降解，形成有活性的RISC。

1.4 siRNA介導(dǎo)的基因沉默機(jī)制

siRNA介導(dǎo)的基因沉默機(jī)制分為轉(zhuǎn)錄前水平的基因沉默（TGS）和轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默（PTGS）兩類，其中PTGS指轉(zhuǎn)錄后的mRNA的降解進(jìn)而基因不能表達(dá)。

1.4.1 TGS

TGS包括染色體異染色質(zhì)化和RNA介導(dǎo)的DNA甲基化（RdDM）兩個(gè)過程。RITS復(fù)合體吸引RDRC復(fù)合體（RNA指導(dǎo)的RNA聚合酶復(fù)合體，RNA-directed RNA polymerase complex）中的RdRP，RDRC可以擴(kuò)增雙鏈siRNA。通過與該DNA直接配對(duì)或與其轉(zhuǎn)錄物配對(duì)，siRNA將RITS護(hù)送到基因組相應(yīng)位點(diǎn)上。然后，RITS直接募集Clr4，也可以募集組蛋白H3 Lys9甲基轉(zhuǎn)移酶。甲基化的Lys9募集Swi6，Clr4和Swi6相互作用導(dǎo)致染色體異染色質(zhì)化。

RdDM現(xiàn)象是Wessenegger在2000年類病毒感染的轉(zhuǎn)基因植物中發(fā)現(xiàn)的。在植物中接種有復(fù)制活性的類病毒后，通過轉(zhuǎn)基因整合入植物基因組的類病毒cDNA拷貝發(fā)生從頭甲基化，生成的類病毒RNA能夠誘導(dǎo)植物基因組中的同源DNA序列發(fā)生甲基化。此后，在大量非致病性的轉(zhuǎn)基因植物體系中都發(fā)現(xiàn)了RdDM現(xiàn)象。

1.4.2 PTGS

在核酸酶以及Mg2+的協(xié)助下，siRNA將mRNA切割成長度約為21～23nt的片段，其切割的片段長度由siRNA與mRNA互補(bǔ)配對(duì)位置所決定。

1.5 siRNA生物學(xué)意義

由于siRNA具有特異性強(qiáng)、安全持久等特點(diǎn)，可以通過制備特定的siRNA導(dǎo)入生物體內(nèi)有目的地抑制靶基因的表達(dá)，如目前發(fā)現(xiàn)其對(duì)肺癌和腦膠質(zhì)瘤等癌細(xì)胞均有抑制作用。但是，由于其被發(fā)現(xiàn)運(yùn)用的時(shí)間比較短，尚有許多問題有待解決，如導(dǎo)入率不高、穩(wěn)定性較差等，故還需對(duì)其進(jìn)行更深層次的研究。

2 miRNA與表觀遺傳學(xué)

2.1 miRNA的發(fā)現(xiàn)

1993年，Victor Ambros最早在線蟲的基因中發(fā)現(xiàn)了miRNA lin-4的存在。lin-4是調(diào)控線蟲胚胎后期發(fā)育的重要基因，經(jīng)過序列對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，lin-4轉(zhuǎn)錄物的小片段和lin-14 mRNA的3′端UTR區(qū)域的重復(fù)序列互補(bǔ)配對(duì)，可以形成lin-4∶lin-14 RNA-RNA雜交結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)lin-4對(duì)lin-14的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。之后，人們?cè)谒哪はx、植物、動(dòng)物和人體中均發(fā)現(xiàn)了不同的miRNA。

2.2 miRNA的結(jié)構(gòu)

miRNA是一種長度為18～25 nt類似于siRNA的單鏈非編碼RNA，其5′端有一個(gè)磷酸基團(tuán)，3′端為羥基，不具有開放閱讀框架和蛋白質(zhì)編碼基團(tuán)。

2.3 miRNA的生物合成

miRNA通常位于基因間或內(nèi)含子區(qū)域被轉(zhuǎn)錄，與許多真核生物基因的轉(zhuǎn)錄物相似，miRNA是其啟動(dòng)子與RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合轉(zhuǎn)錄而來，其最初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為較長的pri-miRNA，中間有一段不完全配對(duì)的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。經(jīng)過一次切割為pre-miRNA，再經(jīng)過一次切割產(chǎn)生雙鏈miRNA，雙鏈解鏈形成成熟的單鏈miRNA，經(jīng)過5′端有加帽，3′端有多腺苷酸結(jié)構(gòu)則成為成熟的miRNA。

2.4 miRNA介導(dǎo)的基因沉默機(jī)制

miRNA主要通過靶mRNA降解和翻譯抑制2種方式調(diào)控基因表達(dá)。

2.4.1 靶mRNA降解

在植物體細(xì)胞內(nèi)，miRNA與靶mRNA作用機(jī)制與siRNA基本相同，但是miRNA是由Dicer酶加工具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA（正常的細(xì)胞產(chǎn)物）雙鏈部分形成的。在動(dòng)物體細(xì)胞內(nèi)還需要GW182、脫腺苷基因（NOT1/CAF1）、脫帽相關(guān)基因（DCP）等對(duì)其進(jìn)行“脫帽脫尾”作用。

2.4.2 翻譯抑制

2002年，Caudy AA在核糖體組分中發(fā)現(xiàn)了miR?NA。2年后，Xuemei Chen在研究擬南芥中發(fā)現(xiàn)，miR?NA-172幾乎可以同來自花器官的同源異性基因APETALA2的mRNA進(jìn)行完全堿基互補(bǔ)配對(duì)，可見它不是通過mRNA的降解途徑，而是阻斷翻譯來沉默目標(biāo)基因的表達(dá)。

2.5 miRNA生物學(xué)意義

miRNA具有進(jìn)化保守性與多樣性，只能在特定的組織和發(fā)育階段表達(dá)，可見其在細(xì)胞生長和發(fā)育等生理過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。miRNA不僅可以調(diào)控細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)，而且有不少的證據(jù)表明，在植物和無脊椎動(dòng)物中，還能作為抗病毒因子抵御病毒mRNA。而在脊椎動(dòng)物中，miRNA不僅可以抵抗病毒mRNA，而且其本身也是干擾系統(tǒng)的產(chǎn)物。miRNA作為新發(fā)現(xiàn)的小分子調(diào)節(jié)物質(zhì)，只有少數(shù)的miRNA的功能已經(jīng)明確，大部分miRNA的功能還有待深入研究。

3 lncRNA與表觀遺傳學(xué)

3.1 lncRNA的發(fā)現(xiàn)

2002年，Okazaki等對(duì)小鼠cDNA文庫大規(guī)模測(cè)序過程中發(fā)現(xiàn)了長鏈非編碼RNA（lncRNA）。

3.2 lncRNA的結(jié)構(gòu)

lncRNA是一類長度大于200 nt的非編碼RNA轉(zhuǎn)錄物。根據(jù)染色體上基因組位點(diǎn)或相關(guān)的DNA鏈特征，lncRNA可分為正義lncRNA（基因位點(diǎn)通過共享相同的啟動(dòng)子和某個(gè)蛋白編碼基因有重疊）、反義ln?cRNA（基因位點(diǎn)以反向的方式插入在某個(gè)一直的蛋白編碼基因中）、基因內(nèi)lncRNA（基因位于某個(gè)蛋白編碼基因的內(nèi)含子內(nèi)）、基因間lncRNA（編碼lncRNA的基因位點(diǎn)位于兩個(gè)蛋白編碼的基因中）、增強(qiáng)子ln?cRNA（編碼lncRNA的基因位點(diǎn)位于某一蛋白編碼基因的增強(qiáng)子區(qū)域）和環(huán)狀lncRNA（通過共價(jià)鍵形成閉合的環(huán)lncRNA，其一般來自可變剪切的編碼蛋白基因，其形成機(jī)制有多種方式），如圖2所示。

圖2 lncRNA的類型

3.3 lncRNA的生物合成

lncRNA的來源不同，主要有以下5種：①蛋白編碼基因的結(jié)構(gòu)中段形成一段lncRNA；②染色體重排，即兩個(gè)未轉(zhuǎn)錄的基因與另一個(gè)獨(dú)立的基因串聯(lián)，產(chǎn)生含多個(gè)外顯子的lncRNA；③非編碼基因在復(fù)制過程中的反移位產(chǎn)生lncRNA；④局部的復(fù)制子串聯(lián)產(chǎn)生lncRNA；⑤基因中插入一個(gè)轉(zhuǎn)座成分而產(chǎn)生有功能的非編碼RNA。

3.4 lncRNA介導(dǎo)的基因沉默機(jī)制

研究顯示多種來源的lncRNA在基因表達(dá)的調(diào)控方面具有相似的作用。近年來研究表明，lncRNA主要通過3個(gè)方面控制基因表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮表觀遺傳學(xué)作用：①基因組印跡：通過生物化學(xué)途徑，在一個(gè)基因或基因組簇上標(biāo)記其親本來源信息的遺傳學(xué)過程，如在小鼠胎盤中，lncRNA Kcnqlot1和Air能聚集在所沉默的等位基因的啟動(dòng)子染色質(zhì)區(qū)域，并以等位基因特異性介導(dǎo)對(duì)組蛋白修飾的抑制。②劑量補(bǔ)償效應(yīng)：以性染色體上的版型連鎖基因在兩種性別里，以相對(duì)等同的劑量進(jìn)行有效表達(dá)的遺傳學(xué)機(jī)制，如在哺乳動(dòng)物中，表現(xiàn)為雌性個(gè)體細(xì)胞同型配子XX中，其中一條X染色體隨機(jī)失活，在其上面的等位基因完全沉默，不轉(zhuǎn)錄也不表達(dá)任何蛋白產(chǎn)物。③染色質(zhì)修飾：ln?cRNA招募染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合體到特定位點(diǎn)進(jìn)而介導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)沉默，如HOXC基因簇轉(zhuǎn)錄的lncRNA HOTAIR，會(huì)募集染色質(zhì)修飾復(fù)合體PRC2，并將其定位到HOXD基因簇位點(diǎn)，改變?cè)搮^(qū)域染色質(zhì)修飾狀態(tài)，進(jìn)而抑制HOXD基因表達(dá)。

3.5 lncRNA生物學(xué)意義

lncRNA在表觀遺傳調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，具有協(xié)調(diào)DNA甲基化、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重塑和組蛋白化學(xué)修飾等作用。lncRNA的作用機(jī)制還有許多模糊的地方，但研究發(fā)現(xiàn)有些lncRNA在腫瘤中非常敏感，這為治療癌癥提供了新思路。

4 piRNA與表觀遺傳學(xué)

4.1 piRNA的發(fā)現(xiàn)

2006年7月，Girard等人在Nature和Science等雜志幾乎同時(shí)報(bào)道了哺乳動(dòng)物睪丸組織中特表達(dá)的內(nèi)源性一類非編碼小RNA，由于其能與Argonaute家族的Piwi亞家族蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合體（piRC），故命名為Piwi-interacting RNA，簡稱piRNA。2006年，Lau等人從大鼠睪丸中將此復(fù)合體純化出來，發(fā)現(xiàn)piRNA與生殖細(xì)胞發(fā)育密切相關(guān)。目前piRNA在小鼠和人體中均有發(fā)現(xiàn)。

4.2 piRNA的結(jié)構(gòu)

piRNA是一類長度為26～31 nt的單鏈小RNA，與miRNA一樣，成熟的piRNA分子3′末端具有2′-O-甲基化修飾特征，5′末端第一個(gè)核苷酸有尿嘧啶偏向性。不同生物在染色體上分布不同，在小鼠中主要分布在X染色體上，在人體中主要在常染色體上，在果蠅中非常普遍。該甲基化修飾反應(yīng)是由Huaenhancer（Hen1）催化的，當(dāng)piRNA完成與Ago3蛋白結(jié)合后，便發(fā)生了甲基化修飾。有2′-O-甲基化修飾的結(jié)果可以維持piRNA的穩(wěn)定性，避免被RNA小解酶消化和降解。

4.3 piRNA的生物合成

piRNA起源于長單鏈RNA前體，與siRNA和miR?NA不同，其產(chǎn)生與Dicer無關(guān)，是通過某種核酸內(nèi)切酶剪切長單鏈RNA前體（pre-piRNA）的3′末端而形成的。之后，通過與Piwi、AUB和Ago3結(jié)合的互補(bǔ)性機(jī)制進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增，即所謂的“兵乓模型”。

4.4 piRNA介導(dǎo)的基因沉默機(jī)制

Piwi-piRNA復(fù)合體通過兩種方式抑制基因表達(dá)：一種是通過調(diào)控形成異染色質(zhì)和介導(dǎo)DNA甲基化修飾等方式，從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平基因的表達(dá)；另一種是依賴有活性的催化酶沉默轉(zhuǎn)座子mRNA，進(jìn)而進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后控制抑制基因表達(dá)。

4.5 piRNA生物學(xué)意義

piRNA作為表觀遺傳調(diào)控因子，對(duì)生殖干細(xì)胞發(fā)揮正常的功能起著重要的作用。piRNA的發(fā)現(xiàn)豐富了非編碼小分子RNA的研究內(nèi)容，但是對(duì)piRNA的研究還有許多未知領(lǐng)域。到目前為止，關(guān)于piRNA的研究在生殖系統(tǒng)、腫瘤治療、精子發(fā)生和心臟方面已經(jīng)取得了階段性的成果，在醫(yī)學(xué)上具有非常廣闊的應(yīng)用前景。

近幾年表觀遺傳學(xué)作為一個(gè)新的前沿學(xué)科，在個(gè)體遺傳和發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，而非編碼RNA對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制還未完全清晰，也成為生命科學(xué)中的一個(gè)研究熱點(diǎn)，需要人們進(jìn)一步探索。