段劍禮，陳 征，王玉琢

1.中山大學附屬第六醫(yī)院泌尿外科（廣州 510655）

2.暨南大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科（廣州 510630）

3.不列顛哥倫比亞大學泌尿系研究所（加拿大不列顛哥倫比亞省溫哥華市 V5Z1M9）

2021年最新數(shù)據(jù)顯示全球有超過141萬例前列腺癌（prostate cancer，PCa）新發(fā)病例，在全部腫瘤新發(fā)病例中高居第三，相關死亡病例有37.5萬例，是男性的第五大死因[1]。中國男性自60歲起進入PCa發(fā)病高峰期，且PCa發(fā)病率與死亡率隨年齡增長呈上升趨勢，并有逐步低齡化的征象[2-3]。研究數(shù)據(jù)表明，由于患者之間存在個體差異，約15%的PCa患者有較高的疾病進展風險，對相同的治療方案表現(xiàn)出高復發(fā)、易轉移和高致死率等特點，增加了患者預后的不確定性[4]。隨著精準醫(yī)學的發(fā)展，根據(jù)PCa患者的個體化腫瘤特征施行不同的治療方案是未來的主要發(fā)展方向[5-6]。在免疫缺陷的小鼠中構建人源性腫瘤異種移植（patient-derived tumor xenograft，PDX）模型，不僅可以避免腫瘤細胞被異體攻擊，更重要的是可借助小鼠體內(nèi)微環(huán)境模擬人體內(nèi)腫瘤細胞的適宜生長環(huán)境，更完整的保留親代基因型，降低外界對基因突變的干擾，較好的體現(xiàn)了個體化腫瘤特征[7]。PDX模型在研究癌癥進展、制定個體化治療方案和臨床前藥效測試等方面發(fā)揮著獨特的優(yōu)勢，被廣泛應用于腫瘤的研究中。本研究主要圍繞PDX模型在男性PCa中的相關研究進行綜述。

1 前列腺癌PDX模型的構建

完整的PDX模型構建包括人源腫瘤組織的獲取、免疫缺陷小鼠的選擇和植入部位的選擇三部分。

1.1 人源腫瘤組織的獲取

獲取人體PCa組織的主要方式是手術切除和腫瘤病灶穿刺。將獲取的腫瘤組織先放至培養(yǎng)液中轉運至實驗室，PBS清洗后在無菌操作下切成3～4 mm小碎塊或直接裂解為單個細胞的懸浮液，再將其導入小鼠的預定種植位置即完成前列腺腫瘤的初次接種[8]。為提高腫瘤種植的成功率，常將基質(zhì)膠或成纖維細胞等與腫瘤微環(huán)境相關的物質(zhì)一同注入小鼠體內(nèi)，腫瘤增長穩(wěn)定后，可進行再次傳代或凍存，但經(jīng)凍存的腫瘤組織其傳代效率相對較低[9-10]。

1.2 免疫缺陷小鼠的選擇

1976年，Schroeder等首次將人源性PCa組織種植到裸鼠中并成功回收，同時設計對照試驗驗證了雄激素在人PCa組織來源的異種移植中具有重要作用，此后裸鼠在PCa的PDX模型中被廣泛應用[11]。此類小鼠的優(yōu)勢在于通體無毛發(fā)較易觀察皮下成瘤的范圍，同時由于先天缺乏胸腺細胞導致裸鼠無細胞免疫，有利于異種腫瘤細胞的生長。但裸鼠的不同基因遺傳背景可影響異種移植的成功率，且裸鼠體內(nèi)仍保留部分體液免疫和非特異性免疫，使得裸鼠尚不能制成最理想的PDX模型[12]。SCID小鼠因Prkdc基因突變導致細胞免疫和體液免疫雙重缺失，減少了腫瘤被攻擊的可能性。該類小鼠擁有較完善的非特異性免疫系統(tǒng)，隨年齡增長體內(nèi)可能會產(chǎn)生T細胞和B細胞，稱為滲漏現(xiàn)象[13]。基于此，后續(xù)研究對SCID小鼠進行改良，開發(fā)出擁有低活性NK細胞和低滲漏率的NOD-SCID小鼠和缺乏NK細胞的NSG小鼠，并在PCa-PDX模型構建中均取得不錯的效果[14-15]。由于NOD-SCID和 NSG小鼠價格昂貴，對生長環(huán)境要求較高，目前在PCa-PDX模型構建中應用最廣泛的仍是裸鼠和SCID小鼠。

1.3 植入部位的選擇

常用的植入部位包括皮下種植、原位種植和腎包膜種植。皮下種植指將人源性腫瘤碎片直接種植于小鼠皮下，優(yōu)點包括操作簡便，易上手，同時可清晰監(jiān)測腫瘤生長。裸鼠的皮下種植均可肉眼觀測腫瘤的生長情況，方便測量與完善實驗計劃。皮下種植部位常取血供相對豐富之處，如雙側腹股溝及腋下等，但由于皮下血供的天然劣勢，皮下移植的成功率不穩(wěn)定，在20%～75%范圍內(nèi)波動[16-17]。同時，皮下種植的腫瘤很少發(fā)生轉移和擴散，常為聚集性成團，不利于腫瘤侵襲性實驗的開展。

原位種植指直接將人源性PCa接種在小鼠前列腺部位，其血供相對皮下更為豐富，一定程度上提高了種植的成功率。原位種植可模擬最接近人類PCa發(fā)生發(fā)展的微環(huán)境，充分考慮了實驗調(diào)控指標及各項體內(nèi)因素對PCa生長的影響，使PDX模型實驗數(shù)據(jù)更加可信。接種于原位的腫瘤可增加轉移的成功率，較好的模擬腫瘤在前列腺部位的進展過程，故在大多數(shù)PCa轉移模型研究中均優(yōu)先考慮使用原位種植[18-19]。但原位種植技術難度較高，需耗費大量時間學習及操作，種植后通常需要借助超聲或探查性手術來確認腫瘤的生長情況，在日常腫瘤測量及轉移檢測中均離不開影像學的支持。

Wang等率先成功將人體PCa組織種植于腎包膜下，開創(chuàng)了腎包膜下種植體系[20]。相比前兩種方案，腎包膜下種植更好地體現(xiàn)了人源性PCa的特征，不僅完整保留了原發(fā)PCa組織的分子特征、腫瘤異質(zhì)性、轉移能力以及對治療的反應性等關鍵生物學特性，還因血供充足大幅度提高了腫瘤種植的成功率（50%～95%）。同時，該技術還可從冷凍庫中回收PDX，提高模型的使用效率。目前活體腫瘤實驗室（the living tumor laboratory，LTL）使用腎包膜下移植技術，已成功建立超過250種可移植的PDX模型，廣泛用于各種良惡性腫瘤的基礎研究、轉化研究以及個體化研究中，體現(xiàn)了腎包膜下種植的獨特價值。但該技術仍有不足之處：①操作復雜，需要熟練的技術人員完成；②對小鼠手術損傷較大，增加了感染的風險；③因小鼠腎臟較小且腎包膜較脆弱，操作過程需更加精細；④與原位種植一樣，該方式也需要依靠影像學技術進行長期觀察[21]。

值得注意的是，種植成功率除受構建PDX模型時的操作步驟和方式選擇影響外，還受以下因素影響：①雄激素水平，高、低劑量的雄激素補充對腫瘤種植的生長有不同影響，故在補充雄激素時需預先估測閾值；②組織的離體時間，由于離體組織內(nèi)部處于缺氧狀態(tài)，離體時間越長，種植成功率越低，提示種植時應保持組織的新鮮，并盡可能切成薄片以利于組織的氧供；③基質(zhì)微環(huán)境，PDX模型的生長與載體的基質(zhì)微環(huán)境息息相關，使用新生鼠精囊間質(zhì)、基質(zhì)膠或?qū)诱尺B蛋白等與腫瘤切片混合可重建小鼠體內(nèi)腫瘤基質(zhì)微環(huán)境，提高種植成功率[22-25]。

2 PDX模型的優(yōu)勢與不足

C4-2、LNcap、DU145等PCa細胞系的體外模型或?qū)⒓毎抵苯臃N植至小鼠體內(nèi)構建體內(nèi)模型仍是目前應用最廣泛的研究工具，但由于細胞系本身與患者自身腫瘤差異性較大，時常會導致實驗結果與臨床應用并不一致[26]。相比于傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)和類器官模型，PDX模型的優(yōu)勢在于：①完整保留了人體腫瘤的基因，擁有更加接近于個體的異質(zhì)性，有利于腫瘤基因組的研究和治療；②保持了腫瘤在組織學上的持續(xù)性，在腫瘤轉移的研究中作用顯著；③接受體內(nèi)微環(huán)境調(diào)控和內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響使實驗結論更為客觀。

但PDX模型也存在一定缺陷。如模型構建相對復雜且成本昂貴，目前仍缺乏大規(guī)模量產(chǎn)的技術。初代PDX生長速率幾天到幾個月不等，而次代及后續(xù)的PDX模型大約需要40～50天才能獲得理想大小的腫瘤[27]，且大多數(shù)會在數(shù)次傳代中停止增殖并逐步衰老[28]。此外，鑒于動物體內(nèi)微環(huán)境與人類有所差異，該技術的發(fā)展還受限于異種動物的免疫系統(tǒng)。

值得一提的是，使用同一親本來源的組織樣本進行體內(nèi)外雙重驗證已逐步成為精準醫(yī)學的共識。類器官是一種三維的培養(yǎng)方式，即提取來自人體的器官細胞在特定培養(yǎng)環(huán)境下增殖成類似器官的小團，為組織功能的體外實驗提供了新方式。由于類器官和原始PDX模型之間的轉錄組和基因組特征高度一致，故可進行相關PDX模型的藥物敏感性篩選和基因編輯等實驗。有研究利用類器官培養(yǎng)技術實現(xiàn)了去勢抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer，CRPC）PDX模型的體外擴增和機制研究[29]。條件性重編程細胞（conditional reprogramming cell，CRC）技術是指提取人源性細胞并與射線照射后的小鼠成纖維細胞Swiss 3T3-J2進行共培養(yǎng)，從而使人源性細胞長期穩(wěn)定傳代，該技術改良了原代細胞培養(yǎng)模式，提高了人源性細胞的擴增產(chǎn)量[30]。Ci等將PCa組織在體外培養(yǎng)成穩(wěn)定擴增的CRC細胞，再將該細胞移植于NOD / SCID小鼠的腎包膜下，構建自發(fā)性神經(jīng)內(nèi)分泌型前列腺癌（neuroendocrine prostate cancer，NEPC）的PDX模型，不僅保持了腫瘤與人體的基因一致性，還解決了PDX模型不能大量擴增的難題，同時亦可以在體內(nèi)外實現(xiàn)高通量化學藥物篩選和基因修飾，為PDX模型的構建和應用提供了新的思路[31]。PCa中傳統(tǒng)細胞系、類器官培養(yǎng)、PDX模型差異見表1。

表1 PCa中傳統(tǒng)細胞系、類器官和PDX模型的比較Table 1.Comparison of traditional cell lines,organoids and PDX models in PCa

3 PDX模型在前列腺癌中的應用

3.1 PDX模型在局限性前列腺癌中的應用

PC-82是1977年建立的第一個雄激素依賴的PCa PDX模型，來源于1例行根治性切除術的58歲男性患者，經(jīng)過去勢和雌激素治療后，該模型的生長速度可逐步減緩并退化[32]。隨后，PCa各個類型的 PDX模型開始被建立并逐步在體內(nèi)實驗中發(fā)揮重要作用（表2）。在1991年至2005年期間，有研究分別從156例患者中收集了261個PCa樣本，并將其皮下植入雄性SCID小鼠中，這些PDX模型被統(tǒng)一命名為LuCaP PDX[33]，LuCaP 系列基本涵蓋了常見的PCa類型，其中從21個原位PCa組織中成功構建了4個局限性PCa的PDX模型，它們很好地驗證了人類PCa的主要基因組和表型特征的改變，如雄激素受體的擴增、PTEN缺失、TP53缺失和突變、RB1丟失、TMPRSS2-ERG重排、SPOP突變等。

表2 部分PCa PDX模型的構建及應用總結Table 2.Construction and application of PDX Model in PCa

原發(fā)性PCa的轉移機制是當前研究熱點。一項研究將局限性PCa不同部位的組織切片制成不同的PDX模型，通過原位種植到小鼠前列腺中來測試每個亞系的轉移能力，發(fā)現(xiàn)LTL-220N和LTL-221N亞系是非轉移性的，而LTL-220M亞系在體內(nèi)可自發(fā)轉移，提示在局限性PCa中只有少數(shù)癌細胞具有轉移潛能[34]。將局限性PCa組織種植于雌性小鼠體內(nèi)可顯著抑制腫瘤生長，提示雌二醇可以通過與雄激素作用無關的機制在動物模型中抑制PCa的生長，對PCa的早期治療有指導意義[35]。值得注意的是，PCa PDX模型用來評估藥物的治療效果時成本較高且不一定時時準確，有研究將PCa PDX模型中的腫瘤組織切片，在體外培養(yǎng)約6天后測試其對雄激素拮抗劑的敏感性，發(fā)現(xiàn)恩雜魯胺可顯著降低AR陽性腫瘤切片的增殖能力，促進細胞凋亡并降低了PSA的分泌，此結果與體內(nèi)實驗一致，提示這種離體組織切片擁有與本體一致的藥敏特點，合理利用此模型可極大降低實驗動物的數(shù)量和成本[36]。

3.2 PDX模型在轉移性前列腺癌中的應用

轉移是PCa致死的主要原因，尋找檢測指標和新型治療方法至關重要。若能準確預測原發(fā)PCa的轉移情況，將為患者提供更加精準的治療方案。Lin等將來自患者的轉移性PCa組織塊種植到腎包膜下，經(jīng)5次連續(xù)種植后進行原位種植，觀察腫瘤轉移的發(fā)生和進展，其中PCa1-met是從淋巴結中分離出的亞型，已證明在47個宿主中均可侵犯至多個器官，如淋巴結、肺、肝、腎、脾臟和骨骼等，同時在與局限性PCa進行基因組對比分析時發(fā)現(xiàn)，ASAP1與PCa的轉移緊密相關，可作為新型腫瘤標志物[42-43]。另一研究對5個不同類型PCa-PDX模型進行全基因組及全轉錄組測序，發(fā)現(xiàn)間質(zhì)來源的轉移信號是PCa轉移的獨立預測指標，不僅可以預測早期腫瘤的轉移潛能，還對早期PCa患者的治療選擇有指導意義[38]。EphA2在PCa中的表達與腫瘤的侵襲性有關，而一線用藥恩雜魯胺會誘導其在PDX模型高表達，使用EphA2降解劑可極大減少原位種植腫瘤的轉移，提示該藥在轉移性PCa中有廣闊的應用前景[44]。

目前已經(jīng)開發(fā)出多種高轉移性PCa模型。LAPC-9是在長期去勢環(huán)境中產(chǎn)生的適應性雄激素非依賴型PDX模型[45]。BM18是應用較多的骨轉移PDX模型，顯示出PSA、AR和CK-18蛋白陽性并對雄激素敏感，且BM18對紫杉烷類化合物和多激酶抑制劑表現(xiàn)出較高的敏感性[46]。利用LAPC-9和BM18在不同激素水平下的差異進行分析，發(fā)現(xiàn)雄激素敏感性不同的轉移性PCa PDX模型觸發(fā)了不同的基質(zhì)反應，并鑒定出具有50個基因的基質(zhì)標記分子，這些基質(zhì)標記分子與格里森評分、轉移進展和無進展生存率等呈線性關系[47]。

3.3 PDX模型在去勢抵抗性前列腺癌中的應用

雄激素剝奪治療是轉移性PCa的標準治療方案，但是多數(shù)患者最終會進展為CRPC，對CRPC的機制研究和臨床處理仍是泌尿外科的難點。從基因?qū)用娣治鯟RPC改變的原因能夠更好的診斷與判斷預后，有研究成功構建了20個來源于CRPC患者的PDX模型，并證實傳代后腫瘤染色體改變與患者中的基本一致[29]。通過對8例CRPC-PDX模型的分析，發(fā)現(xiàn)AR陰性的CRPCPDX模型中UBE2C基因的表達顯著高于AR陽性的腺癌模型，且CRPC-PDX模型中的AR、RB和CCND1啟動子區(qū)域均未甲基化[48]。

對CRPC患者的臨床治療評估也是研究的重點。阿比特龍對部分CRPC患者有效，但會產(chǎn)生耐藥性，將CRPC-PDX模型用阿比特龍進行治療，利用基因表達和免疫組化等方式探索阿比特龍耐藥機制和潛在靶點，借此發(fā)現(xiàn)阿比特龍耐藥相關的分子標志物，并證明了阿比特龍耐藥時會產(chǎn)生持續(xù)的AR / GR信號，對后續(xù)CRPC患者的治療提供新的思路[49]。有研究利用CRPC-PDX模型進一步證實了轉錄共激活因子CBP / p300對維持CRPC生長的意義，并由此開發(fā)出CBP / p300小分子抑制劑，在體內(nèi)外抑制了PCa的生長[50-51]。耐阿比特龍的PDX模型LuCaP 58被用于研究CRPC患者骨轉移的治療方案，發(fā)現(xiàn)鐳-223可有效抑制腫瘤誘導的成骨細胞生長并保護了正常的骨骼結構，同時還能降低小鼠體內(nèi)PSA水平并縮小腫瘤的總體積，提示鐳-223可限制骨中PCa的增殖[52]。近期，靶向降解劑研究在PCa中取得突破性進展，其中小分子ARV-110是一種降解AR的口服靶向嵌合體類藥物，與AR特異性結合并介導其降解，在所有癌細胞系及PDX模型中，該藥對恩雜魯胺治療不敏感的腫瘤顯示出有效的抑制性。對在標準治療方案上有所進展的mCRPC患者有極大幫助，目前美國Arvinas 公司已開始對ARV-110進行相關的臨床試驗[53]。

3.4 PDX模型在神經(jīng)內(nèi)分泌型前列腺癌中的應用

PCa發(fā)展的晚期階段通常以對雄激素不敏感的快速增殖狀態(tài)為特征，一些晚期腫瘤主要由神經(jīng)內(nèi)分泌細胞組成，稱為NEPC。NEPC體內(nèi)研究的基礎是構建合適的PDX模型，LuCaP系列已成功建立了5種NEPC-PDX模型，其中LuCaP 49穩(wěn)定增殖了4年，該模型來源于1例BII期PCa患者的轉移性淋巴結，擁有更快的倍增時間（平均6.5天），對雄激素剝奪治療不敏感，缺乏AR和PSA但表達突觸素、CD57等神經(jīng)內(nèi)分泌蛋白等特征。此外，源于前列腺尿道切除術的LuCaP 93、肝轉移的LuCaP 145.1和LuCaP 173.1以及淋巴結轉移的LuCaP 145.2等均表現(xiàn)出NEPC特征和相似的基因組特征[33,39]。LTL通過穿刺活檢提取組織制成局限性PCa PDX模型，去勢后長時間暴露于缺乏雄激素的環(huán)境中自動轉化為NEPC，由此建立了首個由腺癌自發(fā)向NEPC轉分化的PDX模型，稱為LTL331/331R。該模型可完全表征供體患者的疾病特征，其發(fā)展方式提示局限性PCa可以通過適應性反應直接演變?yōu)楦呶Ｐ訮Ca[24,31]。目前，LTL331/331R模型被用于整個轉分化過程中的基因組、轉錄組和表觀遺傳學等研究方向。利用該模型在NEPC的多項研究中發(fā)現(xiàn)DEK蛋白、轉錄因子BRN2、絲氨酸/精氨酸重復基質(zhì)4（SRRM4）、異染色質(zhì)蛋白1α（HP1α）、轉錄調(diào)節(jié)因子ONEUCT2等特異標志物表達升高[40,54-57]。該自發(fā)模型的廣泛應用增進了對NEPC發(fā)生發(fā)展的理解，為NEPC潛在生物學特性的研究和治療靶標提供了新的方向。

精準診斷及治療NEPC離不開對其發(fā)生發(fā)展機制的研究。神經(jīng)內(nèi)分泌表型與CRPC的進展有關，對相關患者及PDX模型進行全基因組微陣列分析，提示同一部位神經(jīng)內(nèi)分泌狀態(tài)和腺癌狀態(tài)可能是同時存在的，CHRPC + / SYP +雙重陽性可做為神經(jīng)內(nèi)分泌型CRPC的分子表型，且該表型不一定與AR活性有關[58]。在一項涉及18例NEPC-PDX模型的研究中，發(fā)現(xiàn)PSMA基因受到明顯抑制，進而使得SSTR2表達上調(diào)，提示可使用PSMA作為NEPC診斷的靶向分子[59]。有研究將NEPC-PDX和腺癌之間的蛋白質(zhì)組進行差異性分析，發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)發(fā)生、細胞周期調(diào)控和DNA修復相關的蛋白質(zhì)在NEPC中均有所升高，而與線粒體功能有關的蛋白質(zhì)水平則降低，同時發(fā)現(xiàn)轉錄抑制因子REST可直接調(diào)節(jié)神經(jīng)元基因表達，對NEPC患者的治療和預后較為重要[60]。

針對NEPC患者的治療目前尚無明確有效的方案，部分原因是其分子表征較差。伊立替康（一種拓撲異構酶I抑制劑）與順鉑的聯(lián)用被證明在NEPC PDX模型LTL352中具有良好的治療效果，該方案不僅可抑制腫瘤的繼續(xù)生長，還在一定程度上殺傷腫瘤細胞，減少腫瘤體積[41]。Aurora-A是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在NEPC中有明顯的過表達，體內(nèi)外實驗及LTL352模型研究均證實NEPC對Aurora-A激酶抑制劑有高度敏感性，提示Aurora-A激酶抑制劑可單獨或協(xié)助治療NEPC和CRPC，但仍需繼續(xù)進行相關臨床驗證[61-62]。

4 結語

綜上所述，PCa PDX模型構建的理論基礎與技術水平逐步趨于成熟，包括LTL在內(nèi)的各大實驗室正努力構建一個品系齊全的PCa PDX模型庫，并逐步推進其商業(yè)化進程。從現(xiàn)有研究看，PDX模型在各階段PCa的基因分析、靶標檢測、藥物測試和新藥驗證等方面均有顯著作用，促進了個體化醫(yī)療的可能性，為體內(nèi)研究提供了穩(wěn)定可靠的載體。未來如何繼續(xù)提高PDX模型的成功率、實現(xiàn)PDX模型批量化生產(chǎn)及形成完整優(yōu)質(zhì)產(chǎn)業(yè)鏈是值得思考的新方向。