張靜，付強(qiáng)，高閆堯

空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科1、泌尿外科2，陜西 西安710038

膀胱癌是起源于膀胱的惡性腫瘤，好發(fā)于50歲以上的男性，發(fā)病與環(huán)境、吸煙、職業(yè)暴露等因素有關(guān)[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，2018年我國(guó)膀胱癌的發(fā)病率在各惡性腫瘤發(fā)病中位居16位，其中男性發(fā)病率是女性的3~4倍，并且呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢(shì)，年輕化趨勢(shì)也較為明顯[2]。手術(shù)治療、藥物治療等均為膀胱癌的常見治療手段[3]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)微小核糖核酸(miRNA)與惡性腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系，集中表現(xiàn)為對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲能力影響，屬于小分子RNA[4]。既往有報(bào)道指出，在結(jié)腸癌、乳腺癌等惡性腫瘤中，miR-147a可以作為腫瘤抑制因子實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤進(jìn)程的負(fù)性調(diào)控[5]。本研究旨在探究miR-147a在膀胱癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖及細(xì)胞侵襲能力的影響，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院2017年1月至2020年3月間采集到的人體膀胱癌組織標(biāo)本、癌旁正常組織標(biāo)本30對(duì)進(jìn)行分析。全部標(biāo)本所對(duì)應(yīng)的患者均被確診為膀胱癌，且行根治性膀胱切除術(shù)手術(shù)治療。術(shù)前所有患者均未接受放療、化療或者其它相關(guān)的藥物治療手段。全部標(biāo)本中男性21例，女性9例；年齡35~78歲，平均(57.46±2.58)歲，其中＜40歲3例，40~59歲7例，≥60歲20例；確診時(shí)病程2~8年，平均(4.65±0.38)年，其中4年以下16例，4年以上14例。本研究在患者知情情況下簽署了同意書，所采集到的用于實(shí)驗(yàn)研究的組織標(biāo)本，均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(科倫審[2016]56號(hào))。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自于Gibco公司，10%新生牛血清購(gòu)自于Hyclon公司，β-actin和miR-147a一抗以及二抗購(gòu)自于ATCC公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 一組為miR-147a mimics組(轉(zhuǎn)染miR-147a mimics序列)，另一組為miR NC組(轉(zhuǎn)染miR NC序列)。觀察um-uc-3細(xì)胞密度的生長(zhǎng)情況，若在80%左右，則將mi R-147a mimics和miR NC序列分別轉(zhuǎn)染進(jìn) um-uc-3細(xì)胞，此過程要求嚴(yán)格執(zhí)行LipofectamineTM2000說明書步驟。

1.3.2 qRT-PCR檢測(cè)法 提取各組細(xì)胞RNA，采用Trizol法進(jìn)行提取，取0.2 g逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，經(jīng)qPCR儀進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，嚴(yán)格執(zhí)行PCR試劑盒要求以及相關(guān)引物要求。檢測(cè)后，所獲取的數(shù)據(jù)行2-ΔΔCt方法分析，分析和比較miR-147a表達(dá)量。

1.3.3 MTT實(shí)驗(yàn) 對(duì)um-uc-3細(xì)胞進(jìn)行接種處理，所接種的場(chǎng)所為96孔板。接種時(shí)控制好接種的密度，盡可能地在5×104/mL左右。調(diào)整培養(yǎng)的條件：溫度為37℃，培養(yǎng)箱含5%的CO2，培養(yǎng)時(shí)間為24 h、48 h、72 h、96 h。培養(yǎng)時(shí)，將10 μL MTT加入至每孔，培養(yǎng)4 h后，再將100 μL二甲基亞砜加入至每孔中。檢測(cè)570 nm處的光密度(OD570)值(酶標(biāo)儀)，反復(fù)檢測(cè)3次，計(jì)算平均值作為最終數(shù)值。

1.3.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后膀胱癌細(xì)胞的遷移能力48 h，接種miR-147a mimics和miR-NC組膀胱癌5637和T24細(xì)胞于6孔板中，待細(xì)胞匯合到90%時(shí)用10 μL移液槍頭沿垂直方向劃痕，反復(fù)沖洗3次(PBS溶液)，于培養(yǎng)基(不含血清)中進(jìn)行培養(yǎng)。24 h后，使用顯微鏡對(duì)細(xì)胞劃痕間距進(jìn)行觀測(cè)，根據(jù)“(0 h劃痕間距~24 h劃痕間距)/0 h劃痕間距×100%”這一公式計(jì)算細(xì)胞遷移率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟-件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌和正常組織、細(xì)胞的miR-147a表達(dá)水平比較 膀胱癌組織的miR-147a表達(dá)為(0.37±0.06)%，正常膀胱組織的miR-147a為(1.20±0.15)%，膀胱癌組織明顯低于正常膀胱組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.256，P＜0.05)。 膀 胱 癌 細(xì) 胞miR-147a表 達(dá) 為(0.41±0.08)%，正常膀胱細(xì)胞miR-147a表達(dá)為(1.69±0.25)%，膀胱癌細(xì)胞明顯低于正常膀胱細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.108，P＜0.05)。

2.2 miR-147a轉(zhuǎn)染效率 如圖1所示，miR-147a mimics組的miR-147a表達(dá)量上升，由此判定miR-147a成功整合并表達(dá)。

圖1 miR-147a表達(dá)情況

2.3 miR-147a對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖的影響miR-147a mimics組在不同時(shí)間點(diǎn)OD值相對(duì)較低，轉(zhuǎn)染后72 h、96 h，miR-147a mimics組OD值明顯低于miR-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 miR-147a對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖的影響(±s)

表1 miR-147a對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖的影響(±s)

組別OD值24 h48 h72 h96 h miR-147amimics組0.32±0.050.50±0.110.75±0.261.30±0.38 miR-NC組0.33±0.050.53±0.121.06±0.341.71±0.46 t值0.4470.5832.2902.173 P值0.6600.5670.0340.043

2.4 miR-147a對(duì)um-uc-3細(xì)胞遷移能力的影響miR-147a mimics組的細(xì)胞遷移能力明顯低于miR-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖2和表2。

表2 miR-147a對(duì)um-uc-3細(xì)胞遷移能力的影響(±s)

表2 miR-147a對(duì)um-uc-3細(xì)胞遷移能力的影響(±s)

組別 細(xì)胞遷移數(shù)(株)細(xì)胞侵襲數(shù)(株)miR-147amimics組123.06±25.1691.48±16.74 miR-NC組314.75±68.52252.30±57.23 t值8.6209.256 P值0.0010.001

圖2 膀胱癌細(xì)胞遷移能力(結(jié)晶紫染色×200)

3 討論

膀胱癌是臨床泌尿系統(tǒng)最為常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病后多數(shù)可見無痛血尿，也有尿頻、尿急、尿痛、排尿困難等癥狀，腫瘤侵襲或轉(zhuǎn)移可累及系統(tǒng)相關(guān)癥狀[6]。數(shù)據(jù)調(diào)查顯示，惡性腫瘤死亡中，膀胱癌致死約占3%[7]。至今，膀胱癌發(fā)病原因并不明確，但可以肯定的是多種因素作用產(chǎn)物，包括內(nèi)在遺傳因素、外在環(huán)境因素。根治性手術(shù)是治療膀胱癌的常見術(shù)式，可有效將病灶切除，但從臨床報(bào)道來看仍有一定的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率，從而導(dǎo)致患者5年生存率偏低[8]。隨著臨床對(duì)膀胱研究的不斷深入，遺傳學(xué)逐漸成為了研究的重要方向。為此，本研究從遺傳學(xué)的角度出發(fā)，深入了解膀胱癌的發(fā)病機(jī)制。

既有研究指出，非編碼RNA在其中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[9-11]。另有研究表明，惡性腫瘤受到miRNA的調(diào)節(jié)，惡性腫瘤的調(diào)節(jié)，其機(jī)制表現(xiàn)為：靶向結(jié)合mRNA的3非編碼區(qū)互補(bǔ)配對(duì)序列→調(diào)節(jié)RNA的表達(dá)量→引起下游生物學(xué)改變[12-14]。miR-147a是miRNA家族的重要一員，于2002年由Lagos Quin-tana團(tuán)隊(duì)從小鼠脾臟中克隆出來，定位在人類基因組9q33.2。研究發(fā)現(xiàn)，miR-147在慢性粒細(xì)胞白血病、結(jié)腸癌和乳腺癌中作為一個(gè)腫瘤抑制因子，能夠負(fù)性調(diào)控腫瘤的進(jìn)程[15]。目前，學(xué)界關(guān)于其在惡性腫瘤中的調(diào)控作用研究并不少見，尤其是在結(jié)腸癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌等惡性腫瘤中，其表達(dá)會(huì)直接影響腫瘤的發(fā)展，同時(shí)在慢性粒細(xì)胞白血病中的低表達(dá)現(xiàn)象也同樣存在[1-17]。目前，盡管在惡性腫瘤中，miR-147a的作用比較明確，但是對(duì)于膀胱癌患者而言并不清楚[18-19]。本研究結(jié)果顯示，相較于癌旁正常組織、細(xì)胞的miR-147a表達(dá)水平，膀胱癌組織、細(xì)胞的miR-147a表達(dá)水平明顯更低(P＜0.05)，說明了在膀胱癌的發(fā)生過程中，miR-147a扮演著抑癌的角色，而這也可能成為膀胱癌潛在的診斷分子靶點(diǎn)。為進(jìn)一步揭示miR-147a對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖的影響，本研究采用MTT實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示對(duì)于膀胱癌患者而言，miR-147a的表達(dá)水平上升，可有效地抑制細(xì)胞的增殖能力，這與臨床有關(guān)乳腺癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤中，miR-147a表達(dá)對(duì)于癌細(xì)胞增殖的抑制報(bào)道一致[20-21]，因此有較高的可信度。另外，本研究關(guān)于miR-147a對(duì)癌細(xì)胞遷移能力的影響分析，通過觀察miR-147a對(duì)膀胱癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響，結(jié)果顯示miR-147a可明顯一致um-uc-3細(xì)胞遷移能力。盡管本研究取得了上述研究成果，但是也存在一定的局限性，比如納入研究的樣本數(shù)量偏少，可能會(huì)對(duì)研究結(jié)果的科學(xué)性產(chǎn)生影響，因此在日后的研究中需不斷加以改進(jìn)。

綜上所述，在膀胱癌組織、細(xì)胞中，miR-147a的表達(dá)呈現(xiàn)低表達(dá)，其參與了疾病的發(fā)生、發(fā)展過程，這可能成為膀胱癌診斷及治療的潛在生物學(xué)新靶點(diǎn)，但其通過何種信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)抑制仍有待進(jìn)一步探究。