孫欽勇，馮中，高帆俐，楊斌，張貴民（魯南制藥集團(tuán)股份有限公司，國家手性制藥工程技術(shù)研究中心，山東臨沂 273400）

孟魯司特鈉（montelukast sodium），作為新一代非甾體抗炎藥，可選擇性地拮抗白三烯與其受體結(jié)合，抑制白三烯的致炎活性。孟魯司特鈉于1988年由美國默克公司申請上市，臨床主要用于治療哮喘及支氣管炎等。目前孟魯司特鈉市售劑型有片劑、咀嚼片和顆粒劑。但在哮喘急性發(fā)作期，患者因處于氣阻狀態(tài)而服藥不便，且哮喘患者多為老人、兒童等吞咽能力較弱的群體[1-3]。凍干口腔崩解片因其富含孔隙及可溶性基質(zhì)而具有崩解迅速和口感良好的優(yōu)勢，可大幅提高患者服藥順應(yīng)性。部分藥物可以通過舌下黏膜吸收，避開藥物首過效應(yīng)，提高生物利用度[4-6]。本實驗采用冷凍干燥技術(shù)制備10 mg 規(guī)格的孟魯司特鈉口腔崩解片，優(yōu)化其處方與工藝，并與孟魯司特鈉咀嚼片參比制劑進(jìn)行溶出曲線對比，對本法制得的孟魯司特鈉口腔崩解片進(jìn)行初步質(zhì)量評價。

1 材料

1.1 儀器

XS204 型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；HH-ZK2 智能數(shù)顯多功能油水浴鍋（鄭州豫華儀器制造有限公司）；RO 10 磁力攪拌器（德國IKA 公司）；Seven Compact S210 型pH 計（瑞士Mettler Toledo 公司）；BME-100LX 高剪切混合乳化機(jī)（上海威宇機(jī)電有限公司）；片劑硬度儀（美國Logan）；LYOBETA MINI 2P 型凍干機(jī)（西班牙Telstar 公司）；HX204 型鹵素水分測試儀（瑞士Mettler Toledo 公司）；Distek 2500 型系列智能溶出儀（美國Distek 公司）；UltiMate 3000型高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 試藥

孟魯司特鈉對照品（美國USP 標(biāo)準(zhǔn)品，含量：100.0%，批號：G0L231）；孟魯司特鈉咀嚼片（參比制劑，MSD Merck 公司，規(guī)格：4 mg，批號：H006461）；孟魯司特鈉原料藥（山東新時代藥業(yè)有限公司，含量：99.0%，批號：RS-190501）；甘露醇（美國Merck KGaA 公司）；明膠（美國NutraSweet）；麥芽糖糊精（江蘇維多股份有限公司）；交聯(lián)聚維酮（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；阿斯帕坦（湖北信康醫(yī)藥化工有限公司）；薄荷香精（上海昌為醫(yī)藥輔料技術(shù)有限公司）；三氟乙酸（北京化學(xué)試劑公司）；乙腈（德國Fisher Scientific 公司）；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 孟魯司特鈉口腔崩解片的初步制備方法

通過參考其他市售凍干崩解片的處方，初步確定孟魯司特鈉片所需輔料種類，包括賦形劑甘露醇、黏合劑明膠、崩解劑交聯(lián)聚維酮（PVPP）、矯味劑阿司帕坦及少量薄荷香精，采用冷凍干燥技術(shù)進(jìn)行制備，試制工藝如下：① 將8 mg 的明膠置于50 mL 燒杯中，加入適量純化水，經(jīng)60℃水浴加熱溶解后備用；② 稱取孟魯司特鈉原料藥10 mg、甘露醇15 mg、交聯(lián)聚維酮3 mg，置于100 mL 剪切杯中使之混合均勻，加少量純化水?dāng)嚢枋蛊淙咳芙猓虎?將①加入到②中，攪拌均勻，采用高剪切混合乳化機(jī)進(jìn)行乳化（3000 r·min－1，5 min），用純化水定容至40 g，攪拌均勻，再進(jìn)行第二次剪切（3000 r·min－1，5 min）；④ 將上述藥液轉(zhuǎn)移至250 mL 脫氣瓶內(nèi)，于常溫下磁力攪拌，并進(jìn)行抽真空脫氣至無氣泡；⑤ 用移液槍將藥液注入泡罩中，每片400 μL，－60℃預(yù)凍5 min，最后經(jīng)真空干燥，分裝，得孟魯司特鈉口腔崩解片共100 片[7]。

2.2 孟魯司特鈉口腔崩解片的評價指標(biāo)

2.2.1 外觀性狀 觀察其外觀是否平整飽滿，色澤是否均一。取出片劑，觀察鋁窩上是否有藥品黏壁。

2.2.2 崩解時限 參照《中國藥典》2020年版四部建立本研究崩解時限測定方法，取自研孟魯司特鈉口腔崩解片，置兩端開口且一端包封的26 目篩網(wǎng)（孔徑約688 μm）的玻璃管（直徑1.5 cm、長10 cm）中，將玻璃管固定，其下放一容器接收廢液，用刻度滴管量取37℃水1 mL，在距篩網(wǎng)高度5 cm 處，于30 s 內(nèi)勻速滴加于片面上，滴加同時計時，觀察崩解情況，1 min 內(nèi)應(yīng)崩解完全，另量取37℃水1 mL 沖洗，應(yīng)全部通過篩網(wǎng)。每個處方測定6 片，記錄崩解時間并計算平均值[8]。

2.2.3 硬度 用片劑硬度測定儀測定自研片的硬度。

2.2.4 口感 選3 名志愿者進(jìn)行評價，溫水漱口，將自研片置于舌上，待藥片完全崩解后漱口，記錄志愿者的口感評價。

2.2.5 水分測定 取孟魯司特鈉口腔崩解片，按《中國藥典》2020年版四部通則0832 水分測定法第一法Karl Fischer 法進(jìn)行測定，平均含水量不得超過5.0%[9]。

2.2.6 再分散性 取孟魯司特鈉口腔崩解片1 片，置純化水中，振搖觀察溶液狀態(tài)。

2.3 孟魯司特鈉口腔崩解片輔料篩選

在預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)孟魯司特鈉冷凍干燥過程中會形成塌陷，其可能原因為孟魯司特鈉水溶性較好，冷凍過程中形成低共熔混合物，在處方中加入凍干保護(hù)劑可有效解決上述問題，現(xiàn)對處方中凍干保護(hù)劑、黏合劑種類，矯味劑的用量進(jìn)行篩選[10]。

2.3.1 凍干保護(hù)劑的篩選 凍干保護(hù)劑可使藥物有效成分在凍干過程及凍干結(jié)束后儲運階段保護(hù)凍干片的藥效。本實驗從常用的乳糖、葡萄糖和麥芽糖糊精中篩選出合適的凍干保護(hù)劑，并設(shè)置不加凍干保護(hù)劑制備的凍干片作空白對照。固定單片中主藥孟魯司特鈉用量為10 mg，并添加30%的甘露醇、5%明膠和25%交聯(lián)聚維酮，改變凍干保護(hù)劑的種類及用量，結(jié)果見表1。

表1 凍干保護(hù)劑的篩選Tab 1 Screening of freeze-dried protective agents

由實驗結(jié)果可知，空白對照組塌陷不成型，加入5%凍干保護(hù)劑可改善片型，考察的3 種凍干保護(hù)劑中，麥芽糖糊精明顯優(yōu)于其他兩種，其對片型的改善最為明顯，且在符合崩解時限小于30 s 要求的同時，對凍干片的機(jī)械強(qiáng)度有了更大的加強(qiáng)作用。故本實驗選擇麥芽糖糊精為凍干保護(hù)劑，輔助賦形劑甘露醇調(diào)節(jié)孟魯司特鈉凍干口崩片的成型。

2.3.2 基質(zhì)/黏合劑的篩選 擬考察明膠、黃原膠、阿拉伯膠3 種常用的黏合劑，將上述黏合劑分別在水中溶脹溶解（其中明膠需要在60℃水中加熱使其完全溶解）后將溶液稀釋至50 mL，分置于容積為0.5 mL 的模具中，按照“2.1”項下方法制備孟魯司特鈉凍干片，結(jié)果見表2。

表2 黏合劑的篩選Tab 2 Screening of adhesives

因后續(xù)需要對黏合劑的用量進(jìn)行進(jìn)一步確定，故使用黃原膠有崩解時限超限的可能；使用阿拉伯膠制成的凍干片片型和色澤都略次于明膠，阿拉伯膠還有導(dǎo)致過敏反應(yīng)的風(fēng)險，相比較而言，明膠是由動物的膠原蛋白水解制得，易于吸收的同時安全性高。故本實驗選擇明膠作為黏合劑，其所需濃度在后續(xù)過程中進(jìn)一步研究。

2.3.3 阿司帕坦用量考察 用矯味劑和芳香劑來改善凍干口腔崩解片的口感是一種簡單易行的手段。本研究采用在凍干制劑中應(yīng)用最廣泛的矯味劑阿司帕坦和芳香劑薄荷香精來改善凍干口腔崩解片的口感，此種方法經(jīng)驗證安全性較高，且阿斯帕坦甜度約為蔗糖的180 倍，無需大量添加便可掩蓋藥物的不良?xì)馕?，對藥物的其他性質(zhì)影響較小。本實驗固定單片中主藥孟魯司特鈉用量為10 mg，并添加30%的甘露醇、5%麥芽糖糊精、5%明膠和25%交聯(lián)聚維酮，對阿斯帕坦的用量進(jìn)行考察，結(jié)果見表3。

表3 阿司帕坦用量考察Tab 3 Aspartame dosage

由結(jié)果可知，阿司帕坦用量增加藥物苦味逐漸被掩蓋，達(dá)到2.5%以上時已經(jīng)察覺不到苦味，但是阿司帕坦的代謝物苯丙氨酸會對中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成一定損害，因此，選擇自研片中阿司帕坦的用量為2.5%，即單片中阿司帕坦的添加量為1 mg。

2.4 Box-Behnken 效應(yīng)面法優(yōu)化處方

按照“2.1”項下方法制備孟魯司特鈉口腔崩解片。由預(yù)實驗結(jié)果可知，孟魯司特鈉自研藥在水中溶解迅速，口服生物利用度達(dá)60%左右[10]，但其機(jī)械強(qiáng)度太小，無法滿足片型及硬度的要求，為制得片型良好且崩解時限符合要求的孟魯司特鈉口腔崩解片，對主要處方因素即賦形劑甘露醇、凍干保護(hù)劑麥芽糖糊精、崩解劑PVPP 和黏合劑明膠的用量進(jìn)行考察。

設(shè)置甘露醇和麥芽糖糊精的質(zhì)量比（A）、PVPP 用量（B）和明膠用量（C）為考察因素，每因素設(shè)三水平，因素水平見表4，以自研片的崩解時限（Y1）和硬度（Y2）為評價指標(biāo)，同時設(shè)置Y1最大限度為30 s，取最小值；設(shè)置Y2范圍為15 ～20 N，在此范圍內(nèi)取最大值，并且讓兩個指標(biāo)產(chǎn)生交互，最后用 Design-Expert 8.06 軟件對結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析從而獲得實驗最優(yōu)值和相應(yīng)的實驗條件。響應(yīng)面圖見圖1，各因素對自研片崩解時限和硬度的影響結(jié)果見表5。

圖1 Y1 對AB 的單位響應(yīng)面圖（A）和Y2 對AC 的三維響應(yīng)面圖（B）Fig 1 Y1 three-dimensional response surface plots（A）for AB and Y2 three-dimensional response surface plots（B）for AC

表4 Box-Behnken 設(shè)計因素水平表Tab 4 Factor and level for Box-Behnken design

表5 各因素對自研片崩解時限的影響Tab 5 Effect of various factors on dissolution

采用多元回歸分析得到的回歸擬合方程為：

Y1＝123.25－34.22A－14.45B－0.95C－0.42AB－0.02AC－0.02BC＋6.29A2＋1.10B2＋0.02C2

Y2＝127.75－37.07A－11.97B＋0.45C＋0.22AB－0.09AC＋0.08BC＋6.37A2＋0.92B2－0.03C2

二項式模型擬合的P值均小于0.0001，該方法精密度良好，建立的模型可預(yù)測實驗結(jié)果，能應(yīng)用于自研片的處方優(yōu)化篩選。最終獲得處方中各輔料用量的最優(yōu)解見表6。

表6 Box-Behnken 效應(yīng)面法擬合結(jié)果Tab 6 Fitting results by Box-Behnken response surface method

以片劑硬度和崩解時限為指標(biāo)計算得該模擬所得最優(yōu)處方為：孟魯司特鈉10 mg、甘露醇7.41 mg、麥芽糖糊精4.52 mg、PVPP 3.01 mg、明膠7.87 mg、阿斯帕坦1 mg、薄荷香精0.2 mg。根據(jù)上述結(jié)果結(jié)合其他因素綜合考慮，最終確定單片孟魯司特鈉口腔崩解片的處方為：孟魯司特鈉10 mg、甘露醇9 mg、麥芽糖糊精3 mg；PVPP 3 mg、明膠8 mg、阿斯帕坦1 mg、薄荷香精0.2 mg。

2.5 凍干工藝優(yōu)化

凍干口腔崩解片由于其富有孔隙及可溶性基質(zhì)故可迅速崩解。凍干工藝對于凍干品的質(zhì)量具有重要影響，本實驗在處方組成確定的基礎(chǔ)上對凍干曲線進(jìn)行考察，結(jié)果如表7所示。凍干曲線3 凍干時出現(xiàn)塌陷現(xiàn)象，推測是由于一次干燥溫度設(shè)置太高，導(dǎo)致產(chǎn)品中途融化，復(fù)水性較差。采用凍干曲線1 和凍干曲線2 制備的成品較好，且質(zhì)量上無明顯差異。但凍干曲線1 采用－40 ℃上料，屆時板層結(jié)霜造成上料困難。綜合考慮最終選取凍干曲線2 作為最后的凍干工藝。

表7 凍干曲線考察結(jié)果Tab 7 Freeze-drying curve

2.6 處方和工藝驗證

按照前期摸索出的處方稱取孟魯司特鈉及相應(yīng)輔料，按照“2.1”項下方法制備孟魯司特鈉口腔崩解片3 批（批號分別為201006、201007、201008，每批100 片），檢測孟魯司特鈉口腔崩解片的各項指標(biāo)，結(jié)果見表8。3 批樣品的各項指標(biāo)均符合要求，驗證了該處方及工藝的可行性。

表8 驗證試驗結(jié)果Tab 8 Verification test

2.7 色譜條件

色譜柱為Kromasil C18柱（4.6 mm×50 mm，1.8 μm）；流速1.2 mL·min－1；柱溫25 ℃；檢測波長238 nm；進(jìn)樣量25 μL，流動相及線性梯度洗脫程序見表9，記錄色譜圖[11]。

表9 流動相及梯度洗脫條件Tab 9 Mobile and gradient elution

2.8 溶出度方法學(xué)考察

孟魯司特鈉溶解度屬于BSC Ⅰ類藥物，據(jù)溶解性實驗結(jié)果表明，孟魯司特鈉在0.5%SDS 水溶液中易溶，但在pH 1.0 ～6.8 的水溶液中幾乎不溶或不溶[11]。因此本實驗分別配制0.5%SDS 水溶液、0.1 mol·L－1HCl 溶液（濃鹽酸8.5 mL 和SDS 5 g，加水至1 L）、pH 4.0 乙酸鹽緩沖液（54.4 g 醋酸鈉、92 mL 冰醋酸、5 g SDS，加水至1 L）、pH 6.8磷酸鹽緩沖溶液（磷酸二氫鉀6.8 g、氫氧化鈉0.9 g、SDS 5 g，加水至1 L），在這4 種溶出介質(zhì)中考察自研片和參比制劑的溶出度。由于孟魯司特鈉原料藥進(jìn)口注冊標(biāo)準(zhǔn)JX20100276 項下規(guī)定溶出介質(zhì)為0.5%SDS，故采用該介質(zhì)進(jìn)行方法學(xué)驗證。

2.8.1 專屬性考察 按照處方量制備孟魯司特鈉口崩片空白片，取空白片1 片，置于100 mL 量瓶中，加0.5%SDS 溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為空白輔料儲備液；精密量取10 mL 置于100 mL 量瓶，用溶出介質(zhì)稀釋至刻度，即得空白輔料溶液。按照“2.7”項下色譜條件分別對溶出介質(zhì)、空白輔料溶液和供試品溶液進(jìn)行測定，結(jié)果顯示輔料與溶出介質(zhì)對主成分的測定均無干擾，該方法專屬性較好。

2.8.2 線性關(guān)系考察 取孟魯司特鈉對照品約20 mg，精密稱定，置200 mL 量瓶中，加0.5%SDS溶解并稀釋至刻度，搖勻，作對照品儲備液。從對照品儲備液中分別量取2、6、10、12、20 mL溶液置100 mL 量瓶中，用溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，制得含孟魯司特鈉1.998、5.994、9.990、11.988、19.980 μg·mL－1的對照品溶液，照“2.7”項下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，以峰面積（A）對質(zhì)量濃度（C）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：A＝3.52×104C －3.14×103，R2＝0.9998， 表明孟魯司特鈉在1.998 ～19.98 μg·mL－1內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（n＝6）。

2.8.3 精密度考察 取“2.8.2”項下質(zhì)量濃度為9.990 μg·mL－1的孟魯司特鈉對照品溶液適量，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄對照品峰面積，結(jié)果峰面積RSD＝0.51%，表明儀器精密度良好。

2.8.4 回收試驗 取孟魯司特鈉對照品適量，精密稱定，以0.5%SDS 稀釋，將其制備成含80%、100%、120%樣品濃度的溶液各3 份，并加入處方量等比例的空白輔料，用0.5%SDS 稀釋至刻度，搖勻，過濾。取該藥液的續(xù)濾液作為供試品溶液，取質(zhì)量濃度為9.990 μg·mL－1的對照品溶液作為對照。按“2.7”項下色譜條件測定，并計算回收率，結(jié)果顯示低、中、高質(zhì)量濃度的樣品平均回收率分別為97.68%、99.43%、98.62%，RSD分別為0.09%、0.08%、0.11%（n＝3）。

2.8.5 濾膜吸附性實驗 按照“2.9.1”項下方法，取供試品溶液適量，分成兩份，一份用0.45 μm微孔濾膜過濾，分別棄去初濾液1、2、4、6 mL，取續(xù)濾液進(jìn)樣，一份經(jīng)離心后取上清液進(jìn)樣。結(jié)果顯示棄去1、2、4、6 mL 初濾液的過濾樣品和離心后的樣品相比，主峰面積分別為離心所得上清液的99.53%、99.46%和99.59%，說明濾膜對樣品溶液的吸附可忽略不計。

2.9 溶出度曲線考察

2.9.1 溶出度測定方法 按照《中國藥典》2020年版四部附錄溶出度測定方法第二法槳法，取12 片樣品，分別以“2.8”項下4 種溶出介質(zhì)各900 mL為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為50 r·min－1，依法操作[9]。于1、3、5、10、15、20、30 min 各取樣10 mL，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作供試品溶液，并補充相同溫度、相同體積的溶出介質(zhì)。

另取孟魯司特鈉對照品適量精密稱定，用溶出介質(zhì)溶解并稀釋至質(zhì)量濃度約為10 μg·mL－1對照品溶液，取上述供試品及對照品溶液各10 μL，照“2.7”項下色譜條件測定，按外標(biāo)法計算出每個時間點的溶出量，并繪制孟魯司特鈉的溶出曲線。最后計算自研片在各個時間點的累積釋放度。

2.9.2 溶出曲線相似性評價 取自研制劑（201006 批）與參比制劑照“2.9.1”項下方法分別考察自制制劑與參比制劑的溶出度，結(jié)果見表10，繪制這4 種溶出介質(zhì)下的溶出曲線結(jié)果見圖2。由結(jié)果可知，參比制劑與自研制劑在15 min內(nèi)平均溶出度均大于85%，推定兩者溶出行為相似且都屬于速釋制劑。選擇pH 6.8 磷酸緩沖溶液模擬口腔中性環(huán)境，測定3 批自研制劑在其中的溶出行為，結(jié)果見表11。由結(jié)果可知，自研孟魯司特鈉口崩片制劑工藝穩(wěn)定，批間差異小。

表10 參比制劑和自研制劑(201006 批)在不同介質(zhì)中的累積溶出度(n ＝12)Tab 10 Cumulative dissolution of original preparation and self-developed preparation (201006) in different media (n ＝12)

表11 3 批自研制劑在 pH 6.8 磷酸緩沖溶液中的累積溶出度(n ＝12)Tab 11 Cumulative dissolution of 3 batches of self-developed agents in pH 6.8 phosphate buffer solution (n ＝12)

圖2 自研制劑與參比制劑在4 種溶出介質(zhì)下的溶出曲線（n ＝12）Fig 2 Dissolution curve of self-made and reference listed drug in the 4 dissolution media（n ＝12）

3 討論

本實驗參考了其他市售的凍干口腔崩解片成熟的處方及工藝對孟魯司特鈉片進(jìn)行開發(fā)，甘露醇和麥芽糖糊精都可以作為凍干保護(hù)劑，起到凍干賦形的效果，但單用甘露醇藥片成形性不好，難以從泡罩中取出，故本實驗采用甘露醇∶麥芽糖糊精＝3∶1 的配比，甘露醇和麥芽糖糊精作為凍干保護(hù)劑性能優(yōu)越，其口感均較好，微甜無沙礫感，甘露醇有一定的抗氧化活性，麥芽糖糊精還具備一定的黏性，可減少明膠的用量[12]。根據(jù)文獻(xiàn)記載，PVPP 作為崩解劑具有很好的水合能力和毛細(xì)管活性，遇水迅速溶脹使藥片發(fā)生崩解，前期實驗表明，藥片的崩解時間隨PVPP 用量變多，其崩解時間由快變慢，綜合考慮藥片的口感、崩解時間與機(jī)械強(qiáng)度，確定PVPP 的用量在8%左右為宜[13]。

本研究制備的孟魯司特鈉口腔崩解片在片重和包裝形式上參考了日本杏林制藥開發(fā)的孟魯司特鈉口腔崩解片。一般來說，片劑的崩解時限越小，其機(jī)械強(qiáng)度也隨之減小，由前期實驗可知藥片的硬度至少達(dá)到15 N 才能滿足該制劑儲運方面的需求[14]。采用單因素分析和Box-Behnken 效應(yīng)面法對孟魯司特鈉片處方進(jìn)行篩選優(yōu)化，最終制得了質(zhì)量符合預(yù)期的產(chǎn)品。

由溶出實驗可知，自研制劑和參比制劑的體外溶出行為相似。后續(xù)將對孟魯司特鈉片進(jìn)行體內(nèi)藥動學(xué)研究，并對自研制劑的穩(wěn)定性和安全性進(jìn)行考察，驗證該處方及工藝的重現(xiàn)性，判斷該制劑是否能通過仿制藥一致性評價。