趙瑩 陳甘牛 路兆軍 馬旭升 苗杰

摘要 [目的]建立苦糖果再生體系，保存種質(zhì)資源。[方法]以苦糖果種子誘導(dǎo)的幼嫩莖段為外植體，接種在附加6-BA、IBA等不同濃度植物激素和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基上，研究不同培養(yǎng)條件對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化的影響。[結(jié)果]在不同的培養(yǎng)基、激素種類和激素濃度條件下，愈傷組織的誘導(dǎo)形成有很大差異。相同濃度激素條件下，以MS為基本培養(yǎng)基可誘導(dǎo)出苦糖果愈傷組織，最佳配方為MS+6-BA 0.5 mg/L +IBA 1.0 mg/L，誘導(dǎo)率為76.26%，而1/2MS培養(yǎng)基上無(wú)愈傷組織出現(xiàn)。經(jīng)過(guò)愈傷組織的增殖和分化培養(yǎng)，最佳分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L +IBA 0.05 mg/L，芽分化率達(dá)67.40%。[結(jié)論]該研究實(shí)現(xiàn)了苦糖果愈傷組織誘導(dǎo)并獲得再生植株，初步建立起苦糖果植株再生體系。

關(guān)鍵詞 苦糖果;莖段;愈傷組織;不定芽;分化

中圖分類號(hào) S 723 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2021）14-0098-03

Abstract [Objective]To establish the regeneration system of ?L.fragrantissima ?ssp. standishii ?（Carr.） and preserve the germplasm resources.[Method]The young and tender stem segments induced from the seed of ?L.fragrantissima ?ssp. standishii ?（Carr.） were used as explants and cultured on medium supplemented with different kinds of plant hormones and nutrients.The effect of 6-BA，IBA and culture conditions for callus induction and adventitious bud differentiation were described respectively.[Result]Under the condition of the same concentration of hormone，MS as the basic medium could induce callus.The best formula was MS + 6-BA 0.5 mg/L + IBA 1.0 mg/L，the induction rate was 76.26%.However，there was no callus appeared when 1/2MS medium was used.After callus proliferation and differentiation culture，the best differentiation medium was MS + 6-BA 1.0 mg/L + IBA 0.05 mg/L，and the bud differentiation rate reached 67.40%.[Conclusion]In this study，callus induction and plant regeneration of ?L.fragrantissima ?ssp. ?standishii ?（Carr.） were achieved，and plant regeneration system was established.

Key words ?L.fragrantissima ?ssp. ?standishii ?（Carr.）;Stem;Callus;Adventitious bud;Differentiation

基金項(xiàng)目 山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018GNC113005）。

作者簡(jiǎn)介 趙瑩（1989—），女，山東東營(yíng)人，助理工程師，碩士，從事林業(yè)植物生理研究。*通信作者，工程師，碩士，從事森林培育和林木遺傳育種研究。

收稿日期 2020-10-23

苦糖果[ Lonicera fragrantissima ?ssp. ?standishii ?（Carr.） Hsu et H.J.Wang]，又名羊奶子、衩八果、褲襠果、驢馱布袋，忍冬科 （Caprifoliaceae） 忍冬屬郁香忍冬的亞種[1]。該植物果實(shí)富含糖[1]，色紅汁甜，嫩枝葉還可入藥，祛風(fēng)除濕，清熱止痛[2]，還是優(yōu)良的水土保持樹(shù)種[3]?？嗵枪谖覈?guó)廣泛分布，多生長(zhǎng)于海拔100～2 000 m向陽(yáng)坡地內(nèi)或溪澗旁，現(xiàn)存植株大部分為野生種，人工集中種植較少，目前僅上海、杭州、武漢等地有零星栽培[4]，致使其繁育的植物材料極其有限。為了保存苦糖果優(yōu)良種質(zhì)資源和盡早實(shí)現(xiàn)野生資源的開(kāi)發(fā)和利用，采用組織培養(yǎng)進(jìn)行有性繁殖，具有繁殖速度快，生長(zhǎng)周期短，不受季節(jié)影響，保存量成數(shù)量級(jí)增長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，是短時(shí)間內(nèi)解決資源短缺的有效途徑之一[5]。目前，有關(guān)于苦糖果愈傷組織誘導(dǎo)及分化方面的研究國(guó)內(nèi)鮮見(jiàn)報(bào)道，該研究利用苦糖果離體莖段進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)、增殖及分化，初步建立苦糖果植株再生體系，旨在為苦糖果野生種質(zhì)資源保存和開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 供試材料取自煙臺(tái)市林業(yè)科學(xué)研究所萊山曲村苗圃。

1.2 方法

1.2.1 種子滅菌和接種。種子脫毒根據(jù)朱建華等[6]的方法，取成熟飽滿種子300粒浸泡24 h后置于超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌濾紙吸干水分，70%乙醇浸泡30 s，再用0.2% HgCl2浸泡9 min，期間翻動(dòng)材料，然后用無(wú)菌水沖洗4次，每次1 min左右，后將種子置于無(wú)菌濾紙上吸干水分。接種在MS空白培養(yǎng)基上，調(diào)節(jié)pH 為5.8，含蔗糖3%，瓊脂0.7%，每瓶接種10粒種子，共25瓶。培養(yǎng)條件：光照強(qiáng)度1 500 lx，12 h光照，溫度（25±1） ℃，約56 d后可長(zhǎng)成4～5 cm的苗。

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)。

將種苗切去葉片和根部，留取中間部分，切成0.3～0.5 cm的莖段，水平放置在培養(yǎng)基表面上，以1/2MS、MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度6-BA與IBA組合，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)不同培養(yǎng)基和激素濃度配比的培養(yǎng)基（表1），每瓶接種3個(gè)外植體，每組10瓶，調(diào)節(jié)pH為5.8，含蔗糖3%，瓊脂0.7%，光照強(qiáng)度2 000～3 000 lx，12 h光照，溫度（25±1） ℃，光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每7 d觀察1次生長(zhǎng)狀況并作記錄，21 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織外植體塊數(shù)，統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。

愈傷組織誘導(dǎo)率=（產(chǎn)生愈傷組織外植體數(shù)/接入外植體數(shù)）×100%

1.2.3 分化培養(yǎng)基篩選及分化培養(yǎng)。

根據(jù)苦糖果愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果進(jìn)行一次繼代，設(shè)計(jì)愈傷組織分化培養(yǎng)基。以MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的6-BA及IBA，培養(yǎng)條件同“1.2.2”，各種濃度設(shè)置見(jiàn)表2。將繼代的愈傷組織切成5 mm×5 mm，接入分化培養(yǎng)基，每瓶接種3塊，每處理10瓶。每7 d 觀察1次分化狀況并作記錄，50 d時(shí)統(tǒng)計(jì)各處理愈傷組織出芽情況。

愈傷組織分化率=（出芽的愈傷組織數(shù)/愈傷組織總數(shù)）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 苦糖果愈傷組織的誘導(dǎo)

將莖段接種到8種培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，培養(yǎng)42 d后，發(fā)現(xiàn)只有MS培養(yǎng)基可以誘導(dǎo)出愈傷組織，而1/2MS培養(yǎng)基上并未發(fā)現(xiàn)愈傷組織。培養(yǎng)14 d后，可以明顯看到M2處理莖段兩頭開(kāi)始出現(xiàn)透明膨大細(xì)胞（圖1A），比較疏松，呈黃綠色，培養(yǎng)到第6周時(shí)，可以看到莖段形成明顯的愈傷組織（圖1B）。

由表3可知，不同濃度激素培養(yǎng)基上愈傷組織誘導(dǎo)率不同，M2處理誘導(dǎo)率最高，達(dá)76.26%;其次為M1處理，為58.61%，M4處理最低，僅21.38%。4種培養(yǎng)基產(chǎn)生的愈傷組織質(zhì)量也不同，M1、M2處理的愈傷組織顏色呈淡黃色、顆粒狀且質(zhì)地緊密;而M3處理愈傷組織顏色較深，質(zhì)地較硬，較干燥;M4處理愈傷組織玻璃化現(xiàn)象比較嚴(yán)重，呈半透明狀，質(zhì)量較差，愈傷組織上有根毛和芽的出現(xiàn)。M2處理誘導(dǎo)的愈傷組織適宜作為愈傷組織分化材料，因此選取M2處理誘導(dǎo)的愈傷組織進(jìn)行分化試驗(yàn)。

2.2 苦糖果愈傷組織的分化

將M2處理誘導(dǎo)的愈傷組織進(jìn)行芽的分化培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)約70 d的分化，愈傷組織上產(chǎn)生不定芽（圖2）。表4結(jié)果顯示，不同處理對(duì)愈傷組織芽分化影響明顯。含有6-BA和IBA植物激素的處理中均有芽的出現(xiàn)，但是不同濃度誘導(dǎo)芽的分化率不同。以F4處理芽的分化率最高，達(dá)67.40%，其經(jīng)過(guò)42 d的分化培養(yǎng)，分化出芽時(shí)間最快，質(zhì)量最好，同時(shí)在附加1.0 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基上（F4、F5、F6處理），芽的分化率普遍較高，數(shù)量較多，生長(zhǎng)健壯，葉片呈現(xiàn)綠色;在附加0.5、2.0 mg/L 6-BA培養(yǎng)基上（F1、F2、F3和F10、F11、F12）的愈傷組織誘導(dǎo)率較低，但是在0.1 mg/L IBA濃度下（F2、F5、F8、F11處理）誘導(dǎo)的不定芽生長(zhǎng)健壯，葉片較大，愈傷組織上少有不定根的產(chǎn)生，說(shuō)明一定濃度的生長(zhǎng)素可以提高愈傷組織不定芽的質(zhì)量;附加2.0 mg/L 6-BA培養(yǎng)基的分生不定芽數(shù)量偏少，葉片細(xì)小且未展開(kāi)，說(shuō)明質(zhì)量較差，這可能與細(xì)胞分裂素濃度較高有關(guān)。綜合愈傷組織芽分化質(zhì)量及分化率的高低確定適宜的分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L +IBA 0.05 mg/L。

3 討論

該研究采用苦糖果莖段誘導(dǎo)出愈傷組織，并從愈傷組織中分化出芽，成功獲得了再生苗，為苦糖果種質(zhì)資源保存、擴(kuò)大及栽培推廣奠定基礎(chǔ)。

有關(guān)于忍冬科組織培養(yǎng)與快繁的報(bào)道已有不少，但外植體多以頂芽、腋芽、葉片等為主[7]。該試驗(yàn)以無(wú)菌苗的莖段為外植體，從培養(yǎng)基和植物激素2方面研究了苦糖果愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響因素?？嗵枪鷤M織誘導(dǎo)率及愈傷組織質(zhì)量受不同培養(yǎng)基的影響，該試驗(yàn)采用1/2MS、MS培養(yǎng)基附加不同濃度植物激素誘導(dǎo)愈傷組織，發(fā)現(xiàn)只有在MS培養(yǎng)基上產(chǎn)生愈傷組織，說(shuō)明大量元素減半并不適用于苦糖果愈傷組織誘導(dǎo)，這與蕊帽忍冬芽的誘導(dǎo)不同，即采用1/2MS為基本培養(yǎng)基附加激素即可誘導(dǎo)不定芽的產(chǎn)生[8]，而采用MS誘導(dǎo)的愈傷組織結(jié)構(gòu)疏松、分裂速度快、生長(zhǎng)濕潤(rùn)，質(zhì)量較好，有利于苦糖果不定芽的誘導(dǎo)[9]。在誘導(dǎo)愈傷組織過(guò)程發(fā)現(xiàn)，莖段不僅長(zhǎng)出愈傷組織，而且在M1、M3培養(yǎng)上長(zhǎng)出根毛且M1培養(yǎng)基根的數(shù)量偏多，這可能是由于接種莖段受種子內(nèi)自帶激素相互作用且生長(zhǎng)素濃度較高。

在組織培養(yǎng)過(guò)程中，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和組織分化有明顯的調(diào)節(jié)作用[10]。劉志紅[11]利用帶腋芽的莖段，采用MS+6-BA 2.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L誘導(dǎo)獲得健壯的芽，楊培君等[12]以蒙花忍冬莖段為外植體成功獲得了再生植株。該研究采用不同濃度6-BA、IBA進(jìn)行苦糖果不定芽的誘導(dǎo)，結(jié)果表明，隨著細(xì)胞分裂素濃度的升高，不定芽分化率隨之增大，但是濃度越大，不定芽質(zhì)量越差，生長(zhǎng)緩慢，有不定根形成，這可能是由于細(xì)胞分裂素濃度過(guò)高，抑制了維管組織的分化，從而阻礙不定芽的分化。低濃度細(xì)胞分裂素條件下有不定芽的發(fā)生，但是不定芽生長(zhǎng)細(xì)弱，葉片伸展不良，愈傷組織后期變黑變褐。只有適當(dāng)濃度的6-BA和IBA才能誘導(dǎo)不定芽的產(chǎn)生，該試驗(yàn)結(jié)果得出，當(dāng)6-BA濃度為1.0 mg/L，IBA濃度為0.05 mg/L為苦糖果不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基。

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