楊廷芳，王麗，張勇

0 引言

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，死亡率達8.3%，位于全球癌癥死因第三位[1]。從1990年到2017，肝癌在我國前25位死因中排第五位[2]。手術(shù)、放化療及靶向治療是主要治療手段，但其死亡率和復(fù)發(fā)率仍然很高[3]。肝癌的發(fā)生涉及基因異常表達并且存在腫瘤細胞異質(zhì)性[4-6]，從基因水平探討肝癌的發(fā)生發(fā)展機制及其與預(yù)后的相關(guān)性，有利于發(fā)現(xiàn)新的分子診斷和治療靶點。

FOXO1（叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O1），也稱FKHR，在細胞增殖和癌癥生物學(xué)中起著重要作用[7]。FOXO1基因異常表達與多種腫瘤發(fā)生有關(guān)[8]，如過表達與橫紋肌肉瘤[9]、乳腺癌[10]及卵巢癌[11]等有關(guān)，低表達與結(jié)腸癌[12]和前列腺癌[13]有關(guān)。目前多數(shù)研究是關(guān)于FOXO1與肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）的機制和預(yù)后關(guān)系的小樣本研究，而關(guān)于FOXO1與肝膽管癌（hepatocholangiocarcinoma,HCC-CC）及肝纖維板層癌（fibrolamellar carcinoma,FL-Ca）的發(fā)生發(fā)展機制及預(yù)后關(guān)系的研究未見報道。因此，本研究采用TCGA數(shù)據(jù)庫結(jié)合HPA數(shù)據(jù)庫從大樣本層面分析FOXO1在三種主要病理類型的肝癌中的轉(zhuǎn)錄水平、蛋白質(zhì)表達情況及與預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料獲取

從TCGA 數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）獲得407例肝癌和58例癌旁組織的mRNA表達水平及患者臨床信息。肝癌患者相關(guān)臨床信息包括年齡、性別、生存時間、死亡狀態(tài)、病理組織類型、腫瘤分級及TNM分期。

1.2 分析TCGA數(shù)據(jù)庫中FOXO1在肝癌和癌旁組織中的表達差異

采用非參秩檢驗（Wilcox Test）和R軟件（4.0.2版）Beeswarm包分析從TCGA數(shù)據(jù)庫中獲得的FOXO1 mRNA在肝癌和癌旁組織中的表達差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.3 臨床相關(guān)性分析

采用R包ggpubr分析FOXO1基因與肝癌的臨床病理特征的相關(guān)性。

1.4 分析TCGA數(shù)據(jù)庫中FOXO1表達與肝癌患者預(yù)后關(guān)系

根據(jù)病理組織類型，從TCGA數(shù)據(jù)庫中獲取到3類肝癌，分別為HCC、FL-Ca及HCC-CC。按FOXO1 mRNA表達水平的中位數(shù)將所有肝癌病例分為高、低表達組，R包survival和survminer利用Kaplan-Meier曲線進行生存分析。首先，分析FOXO1基因表達與所有肝癌病例預(yù)后的關(guān)系，得到截尾數(shù)據(jù)為OS的Kaplan-Meier生存曲線。進一步按病理組織類型進行3個亞組（HCC、FL-Ca和HCCCC）的生存分析，Log rank檢驗進行不同組間生存率的比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.5 與生存相關(guān)的獨立預(yù)后分析

分別采用單因素和多因素Cox分析，評估FOXO1基因、患者年齡、腫瘤組織學(xué)類型、性別、腫瘤分級和TNM分期與患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果以森林圖顯示。

1.6 FOXO1與肝癌腫瘤微環(huán)境中腫瘤浸潤免疫細胞（tumor-infiltrating immune cells,TIICs）的關(guān)系

通過CIBERSORT分析工具（https://cibersort.stanford.edu/）分析TIICs在肝癌FOXO1高表達組和低表達組的表達差異，以小提琴圖顯示，并分析TIICs與FOXO1表達水平的相關(guān)性。

1.7 KEGG信號通路富集分析

下載C2.cp.kegg.v7.1.symbols.gmt數(shù)據(jù)，利用GSEA軟件（4.1.0版）對FOXO1基因在肝癌中的潛在功能進行KEGG信號通路富集分析，尋找顯著富集在FOXO1高表達組和低表達組的相關(guān)通路。設(shè)置過濾條件為錯誤發(fā)現(xiàn)率＜0.25且P＜0.05。

1.8 FOXO1在人類不同正常組織及不同腫瘤組織中的蛋白表達差異

從HPA數(shù)據(jù)庫（www.proteinatlas.org）分別 獲取FOXO1基因在人類不同正常組織和不同癌組織中的表達差異。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

肝癌和癌旁組織之間FOXO1基因表達差異采用非參秩檢驗（Wilcox Test）。FOXO1基因表達與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系采用Kaplan-Meier曲線表示，組間生存率比較采用Log rank檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫中FOXO1在肝癌組織和癌旁組織中的表達差異及臨床相關(guān)性分析

TCGA 數(shù)據(jù)庫中，與癌旁組織相比較，F(xiàn)OXO1在肝癌組織中低表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=1.321E-15）。

FOXO1表達與患者年齡、性別、腫瘤組織學(xué)類型、腫瘤分級和TNM分期等臨床特征無明顯相關(guān)性，見圖1。

圖1 FOXO1在肝癌和癌旁組織中的表達差異(A)及與臨床病理特征(B～I)的關(guān)系Figure 1 Difference of FOXO1 expression between tumor and adjacent tissues(A) and its correlation with clinical features(B-I)

2.2 FOXO1與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系

與FOXO1低表達組相比，高表達組肝癌患者的總生存時間顯著延長（P=0.014）。進一步亞組分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO1表達水平對肝細胞肝癌患者預(yù)后有顯著影響（P=0.019），而在肝纖維板層癌（P=0.713）及肝膽管癌（P=0.811）中，其表達水平對預(yù)后無顯著影響，見圖2A～D。

2.3 與生存相關(guān)的獨立預(yù)后分析

單因素Cox分析顯示臨床分期、T、M分期可作為預(yù)后分析指標(biāo)，見圖2E；多因素Cox分析顯示FOXO1不能作為肝癌獨立預(yù)后影響因子，見圖2F。

圖2 FOXO1與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系及肝癌預(yù)后因子Figure 2 Correlation between FOXO1 and survival of liver cancer patients and prognostic factors of liver cancer

2.4 FOXO1與肝癌TME中TIICs的關(guān)系

與肝癌FOXO1低表達組相比，在肝癌FOXO1高表達組中：幼稚B細胞（P=0.005）密度增加，巨噬細胞M2密度降低（P=0.026），見圖3A。肝癌TME中有4種腫瘤浸潤免疫細胞與FOXO1表達水平有關(guān)：幼稚B細胞（P＜0.001）和靜息CD4記憶性T細胞（P=0.030）與其正相關(guān)；巨噬細胞M2型（P=0.018）和活化的CD4記憶性T細胞（P=0.028）與其負(fù)相關(guān)，見圖3B～E。

圖3 肝癌FOXO1高和低表達組腫瘤浸潤免疫表達差異(A)及其與FOXO1表達的相關(guān)性(B-E)Figure 3 Distribution of TIICs in liver cancer patients with high and low FOXO1 expression(A) and relation between TIICs and FOXO1 expression(B-E)

2.5 KEGG信號通路富集分析

分析了18條最顯著富集在FOXO1高表達組及8條最顯著富集在FOXO1低表達組的KEGG信號通路，見表1；發(fā)現(xiàn)10條腫瘤相關(guān)信號通路，見圖4，數(shù)條與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞周期及內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)的KEGG信號通路顯著富集在FOXO1高表達組。

圖4 10條腫瘤相關(guān)KEGG通路富集圖Figure 4 Enrichment plots of 10 tumor-related KEGG pathways

表1 FOXO1高表達和低表達組相關(guān)KEGG信號通路Table 1 KEGG pathways enriched in high and low FOXO1 expression groups

2.6 FOXO1在人類不同正常組織及腫瘤組織中的蛋白表達差異

從HPA數(shù)據(jù)庫獲取FOXO1基因在人體不同的正常組織和不同腫瘤組織中的蛋白水平表達差異，見圖5。FOXO1蛋白在肝臟等多數(shù)組織中低表達，在約60%的肝癌患者中可檢測到其表達。

圖5 FOXO1在人體正常組織及腫瘤組織中的蛋白表達水平Figure 5 Protein expression of FOXO1 in normal and cancer tissues

3 討論

肝癌近十多年來呈現(xiàn)出年輕化趨勢[14]，手術(shù)和系統(tǒng)性化療仍是目前主要的治療手段。盡管作為里程碑式的靶向治療藥物索拉菲尼極大地改善了晚期肝細胞肝癌患者的預(yù)后，但是僅約25%的腫瘤含有驅(qū)動基因[15]，高死亡率和復(fù)發(fā)率是亟待解決的問題[3]。肝癌基因異常表達和腫瘤細胞的異質(zhì)性提示，尋找相關(guān)的重要基因不僅利于肝癌的早期診斷和預(yù)后判斷，而且有望發(fā)現(xiàn)新的治療靶點，加深對其發(fā)生發(fā)展機制的認(rèn)識。

FOXO1編碼的蛋白質(zhì)是重要的細胞增殖[16]和細胞死亡的調(diào)控因子，在細胞凋亡、轉(zhuǎn)移、代謝和癌癥生物學(xué)中也起著重要作用[7]，且促進肝細胞糖異生[17]，尤其是在長期進食或饑餓及氧化應(yīng)激時靶向胰島素信號通路以維持內(nèi)環(huán)境平衡。研究[8]表明FOXO1表達上調(diào)抑制HCC進展；其表達下調(diào)促進HCC發(fā)生和進展，導(dǎo)致不良預(yù)后。此外，Chi等[18]發(fā)現(xiàn)FOXO1介導(dǎo)促凋亡蛋白Bim的表達導(dǎo)致HCC化療耐藥及遠處轉(zhuǎn)移。Calvisi等[19]發(fā)現(xiàn)FOXO1泛素化可促進HCC進展，且FOXO1表達高的HCC患者預(yù)后更好。Jiang等[20]發(fā)現(xiàn)抑癌基因PTEN（phosphate and tensin homology）促進FOXO1核轉(zhuǎn)位，PTEN-蛋白酶體軸是治療PTEN缺陷型膽管癌的潛在靶點。Frampton等[21]發(fā)現(xiàn)原顆粒蛋白PGRN在膽管癌中過表達，導(dǎo)致FOXO1在膽管細胞內(nèi)積聚，刺激小鼠膽管癌細胞增殖。肝癌具有高度異質(zhì)性及不同的病理組織類型，發(fā)生發(fā)展機制復(fù)雜。

我們基于TCGA數(shù)據(jù)庫挖掘FOXO1基因在肝癌中的表達情況，發(fā)現(xiàn)FOXO1在肝癌組織中低表達。按FOXO1 mRNA表達水平將肝癌病例分為高、低表達組后，生存分析顯示：高表達FOXO1的肝癌患者總生存率高于低表達者。按肝癌病理組織類型進行亞組分析顯示，高表達FOXO1的HCC患者預(yù)后更好，與已有研究結(jié)果一致[8,19]。FOXO1的表達與肝纖維板層癌及肝膽管癌預(yù)后無關(guān)。多因素Cox分析顯示FOXO1不能作為獨立預(yù)后指標(biāo)。我們采用HPA數(shù)據(jù)庫評估FOXO1基因在人體不同正常組織及不同腫瘤組織中的蛋白表達差異，60%的肝癌患者中（包括肝細胞肝癌、肝纖維板層癌及肝膽管癌）可檢測到FOXO1蛋白低到中等程度表達。

FOXO1蛋白對調(diào)節(jié)細胞因子和趨化因子的分泌至關(guān)重要[22]。隨著免疫治療的應(yīng)用，一系列研究正在揭示FOXO1在腫瘤微環(huán)境中的功能。Wang等[22]發(fā)現(xiàn)在食管鱗癌TME中，巨噬細胞M2浸潤的FOXO1依賴性機制，即FOXO1上調(diào)并通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控趨化因子配體20和集落刺激因子-1，促進TME中巨噬細胞M0向巨噬細胞M2極化并募集巨噬細胞M2，導(dǎo)致ESCC患者預(yù)后較差；且發(fā)現(xiàn)FOXO1（+）腫瘤誘導(dǎo)的M2巨噬細胞通過FAK-PI3K-AKT途徑促進腫瘤增殖，PI3K抑制劑能有效地抑制腫瘤的進展。Zheng等[23]對肝癌患者的腫瘤、癌旁及外周血進行單細胞測序，發(fā)現(xiàn)T細胞與肝癌免疫有關(guān)。Zhang等[24]證實腫瘤微環(huán)境中高密度腫瘤浸潤幼稚B細胞肝癌患者預(yù)后更好，且幼稚B細胞可作為其獨立預(yù)后因子。有研究表明腫瘤浸潤淋巴細胞及其分級是黑色素瘤患者生存期和前哨淋巴結(jié)狀態(tài)的獨立預(yù)測因子，且腫瘤浸潤淋巴細胞密度高的患者預(yù)后更好[25]。為探索FOXO1相關(guān)的肝癌病理進展機制，本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫從免疫細胞與肝癌微環(huán)境的關(guān)系，利用CIBERSORT進行22種TIICs在肝癌TME的表達差異分析及TIICs與FOXO1表達水平相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)幼稚B細胞在肝癌FOXO1高表達組中浸潤密度增加，且其與FOXO1表達水平成正相關(guān)關(guān)系；巨噬細胞M2在肝癌FOXO1高表達組中浸潤密度降低，且其與FOXO1表達水平成負(fù)相關(guān)關(guān)系。結(jié)合本研究的生存分析結(jié)果：在預(yù)后更好的FOXO1高表達組中，F(xiàn)OXO1表達水平越高，幼稚B細胞浸潤密度越大而巨噬細胞M2浸潤密度越低，分別與Zhang[24]及Wang[22]等研究結(jié)果一致。因此，我們推測高表達FOXO1的肝癌患者預(yù)后更好的可能原因：一方面FOXO1促進腫瘤微環(huán)境中幼稚B細胞浸潤調(diào)節(jié)免疫；另一方面FOXO1抑制巨噬細胞M2浸潤從而抑制血管生成和腫瘤侵襲。此外，我們發(fā)現(xiàn)在肝癌腫瘤微環(huán)境中，靜息CD4記憶性T細胞也與FOXO1表達水平成正相關(guān)關(guān)系；活化的CD4記憶性T細胞與其呈負(fù)相關(guān)。在肝癌高和低FOXO1表達組中，具有免疫調(diào)控作用的調(diào)節(jié)性T細胞無表達差異，且與FOXO1表達水平無相關(guān)性。Rohr-Udilova等[26]發(fā)現(xiàn)與正常肝組織比較，肝細胞肝癌中幼稚B細胞及靜息CD4記憶性T細胞增加，但并未進一步研究其與預(yù)后的關(guān)系。靜息CD4 T細胞是HIV-1感染的重要早期靶標(biāo)，Trinité等[27]推測HIV-1抑制FOXO1活性可能促進靜息CD4 T細胞復(fù)制。該研究證實靜息CD4 T細胞與FOXO1相關(guān)。Cafri等[28]的研究表明在上皮源性癌癥患者外周血中可檢測到靶向KRASG12D突變的CD4記憶性T細胞。上述研究雖未明確揭示CD4 T細胞在腫瘤發(fā)展機制中的作用，但提示CD4 T細胞確實跟FOXO1活性有關(guān)，CD4記憶性T細胞存在于腫瘤微環(huán)境中。為了進一步探索FOXO1與肝癌微環(huán)境的關(guān)系，本研究分析了18條最顯著富集在FOXO1高表達組及8條最顯著富集在FOXO1低表達組的KEGG信號通路，發(fā)現(xiàn)10條腫瘤相關(guān)通路，但未發(fā)現(xiàn)重要的免疫相關(guān)通路。

綜上所述，本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫，挖掘肝癌組織中FOXO1mRNA表達水平的信息，發(fā)現(xiàn)FOXO1基因在肝癌中低表達，且與肝癌總體生存期有關(guān)。FOXO1高表達的肝癌患者較低表達者總體生存期延長，進一步就肝癌組織病理類型進行亞組分析發(fā)現(xiàn)，與FOXO1基因低表達組相比，F(xiàn)OXO1高表達的肝細胞肝癌的總生存期延長。本研究為深入研究肝癌的發(fā)生發(fā)展機制、診斷標(biāo)志物及治療靶點提供了理論依據(jù)。本研究存在一定的缺陷和局限性在于單純地利用TCGA數(shù)據(jù)庫，未來需要進一步的體內(nèi)外實驗證明FOXO1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用機制。