彭契六，韋尚謀，張磊 ，甘麗英，謝珍，陳巧佩，韋邦寧，張智

0 引言

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是我國常見的惡性腫瘤，其惡性程度和病死率極高[1]。目前，手術切除仍然是肝癌患者獲得長期生存最有效的方法，但大部分肝癌患者就診時已屬中晚期，且多伴有嚴重的肝硬化，最終能夠接受手術治療的肝癌患者不到15%[2]。因此，探索肝癌侵襲轉移的機制，尋找治療肝癌的新靶點具有重要臨床意義。

微小RNA（micro ribonucleic acid,miRNA）是真核生物中一類長約20～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，可通過堿基互補配對原則與靶基因mRNA的3’端非編碼區(qū)結合，抑制mRNA的翻譯或直接降解目標mRNA，在轉錄后和翻譯水平對下游靶基因的表達進行調(diào)控[3]，從而參與細胞增殖、分化、凋亡、代謝和胚胎發(fā)育等重要生命過程[4]。miRNA與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系已經(jīng)引起廣泛關注[5]。miR-152是一種重要的miRNA，已被證實在多種惡性腫瘤中異常表達[6-8]，但其在肝癌組織中的表達和功能至今鮮見報道。本研究旨在檢測肝癌組織中miR-152的表達水平，分析miR-152異常表達與肝癌患者臨床病理參數(shù)和預后的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年6月—2019年6月在廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院肝膽外科和南寧市第一人民醫(yī)院肝膽外科行手術切除的肝癌患者共56例，切除后收集肝癌組織和癌旁組織（距離切緣至少3 cm），組織標本置于液氮中，轉于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。全部病例均?jīng)病理確診為肝細胞肝癌。所有入選的患者均為原發(fā)病灶的首次手術切除，術前均未進行放療、化療或者激素治療。其中男37例，女19例；年齡32～71歲，中位年齡46歲；臨床病理按TNM分期（美國腫瘤聯(lián)合委員會（AJCC）2018）：Ⅰ期10例、Ⅱ期7例、Ⅲ期37例、Ⅳ期2例；乙肝表面抗原（HBsAg）陽性為乙型肝炎病毒陽性；乙型肝炎病毒DNA（HBV-DNA）＞103拷貝/毫升為HBV-DNAb陽性；血管侵犯是指微血管侵犯（MVI）。本研究經(jīng)本單位倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。本研究所使用的TRIzol RNA提取試劑盒（貨號：9108-1）、Prime-Script miRNA cDNA Synthesis反轉錄試劑盒（貨號：D350A）、SYBR Green Real-time PCR Master Mix試劑盒（貨號：RR420L）均購自日本TaKaRa公司，病理切片機（RM2245型）購自德國Leica公司，熒光定量PCR儀（ABI 7500型）購自美國ABI公司。

1.2 組織總RNA提取

取200 mg組織剪成小塊，置于研缽內(nèi)，加入液氮研磨成粉末。研磨好的粉末加入1 ml RNAiso并立即混勻，然后加入200 ml三氯甲烷，充分混勻后4℃ 12 000g離心15 min。取上清液350 μl，加500 μl異丙醇，混勻后靜置10 min，4℃ 12 000g離心15 min，再加入750 μl無水乙醇，渦旋混勻后4℃12 000g離心10 min。棄上清液，靜置風干。加入30 μl的DEPC水溶解RNA沉淀，采用Nanodrop檢測RNA純度，反轉錄合成cDNA。

1.3 Real-time PCR檢測組織miR-152的表達

采用U6 snRNA作為內(nèi)參。根據(jù)GenBank中miR-152基因序列號（MIMAT0000438），用PrimerPremier5.0軟件設計引物，并送北京博奧生物有限公司合成。U6上游引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；miR-152上游引物：5'-ACGGTACCGTAAGGGACTCGGGAAGGAG-3'，下游引物：5'-TCAAGCTTGCCTCCTTCTTCCAGCTGAT-3'。熒光定量PCR反應總體積25 μl：SYBR Green MIX 12.5 μl、ddH2O 9.5 μl，上下游引物各0.5μl，cDNA模板2.0 μl。PCR反應條件：95℃預變性15 min，95℃變性15 s，60℃退火60 s，進行40個循環(huán)。實驗重復3次，采用2-ΔΔCt法計算miR-152的相對表達量。

1.4 miR-152表達水平與肝癌患者病理參數(shù)的相關分析

根據(jù)miR-152在肝癌組織中相對表達水平的中位數(shù)（0.561），將56例肝癌患者分為miR-152高表達組和低表達組，并將每例患者肝癌組織miR-152的表達水平與癌旁組織進行比較，采用χ2檢驗分析肝癌患者的臨床病理參數(shù)如年齡、性別、AFP水平、腫瘤大小、病理分化、TNM分期、遠處轉移、手術方式等與其miR-152的表達進行相關分析，并通過隨訪的方式分析患者癌組織中miR-152的表達水平及其預后的關系。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示。兩組間比較采用t檢驗?；颊吲R床病理參數(shù)分析采用χ2檢驗，患者生存率分析采用Kaplan-Meier曲線，組間的生存率和復發(fā)率的比較采用Log rank檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。采用單因素Cox回歸對所有臨床病理指標進行分析，再取P＜0.05的因素進行多因素回歸分析。

2 結果

2.1 miR-152在肝癌組織和癌旁組織中的表達

Real-time PCR檢測結果顯示，肝癌（0.616±0.041）與癌旁組織（0.768±0.042）中miR-152的相對表達水平差異有統(tǒng)計學意義（t=2.595,P=0.011），表明miR-152在肝癌組織中的相對表達水平顯著下降，見圖1。

圖1 肝癌和癌旁組織中miR-152相對表達水平Figure 1 Relative miR-152 expressions in cancerous tissues and non-cancerous tissues

2.2 miR-152在肝癌組織中的相對表達水平與患者臨床病理參數(shù)的關系

結果顯示，miR-152低表達組中，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期患者人數(shù)明顯多于Ⅰ～Ⅱ期（P=0.042）、低分化患者人數(shù)明顯多于中高分化組（P=0.035）、有轉移患者人數(shù)明顯多于無轉移（P=0.048），有血管侵犯患者人數(shù)明顯多于無血管侵犯（P=0.042）。而與患者的性別（P=0.397）、年齡（P=0.752）、AFP水平（P=0.365）、腫瘤數(shù)量（P=0.584）、腫瘤直徑（P=0.397）、手術方式（P=0.274）和乙型肝炎病毒攜帶狀態(tài)（P=0.554）等無顯著相關，見表1。提示肝癌組織中miR-152的相對表達水平與肝癌患者腫瘤TNM分期、病理分化、腫瘤轉移及血管侵犯相關。

表1 miR-152表達水平與肝癌患者臨床病理特征的關系Table 1 Relation between miR-52 expression and clinicopathologic features of HCC patients

2.3 Kaplan-Meier生存分析

通過分析56例肝癌患者術后生存資料，結果顯示miR-152低表達組中位生存時間為18.5月，miR-152高表達組中位生存時間為36.0月，miR-152低表達組生存時間低于miR-152高表達組（P=0.035）；miR-152低表達組無進展中位生存時間為13.0月，miR-152高表達組無進展中位生存時間為25.0月，miR-152低表達組無進展中位生存時間低于miR-152高表達組（P=0.012），見圖2。

圖2 miR-152表達水平與肝癌患者預后的關系Figure 2 Relation between miR-52 expression and prognosis of HCC patients

2.4 Cox回歸分析

單因素Cox回歸分析結果顯示：AFP水平、TNM分期、病理分化、腫瘤轉移、復發(fā)、血管侵犯及miR-152低表達均是影響肝癌患者總體生存的風險因素，見表2。多因素Cox回歸分析結果顯示：miR-152表達、腫瘤復發(fā)、病理分化可以作為預測HCC患者不良預后的獨立風險因素，見表3。

表2 單因素分析miR-152表達與HCC患者預后的關系Table 2 Univariate analysis of relation between miR-152 expression and prognosis of HCC patients

表3 多因素分析miR-152表達與HCC患者預后的關系Table 3 Multivariate analysis of relation between miR-152 expression and prognosis of HCC patients

3 討論

miRNA已被證實與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，并且能夠作為惡性腫瘤早期診斷和預后預測的標志物，以及腫瘤靶向治療的靶點[9]。miR-152是miRNA中miR-148/miR-152家族的成員，位于17號染色體長臂21區(qū)32帶[10]。有研究表明，miR-152在結直腸癌、宮頸癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中異常表達[11-13]。汪毅等[14]對結直腸癌組織和癌旁組織中miR-152的表達量進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)miR-152在結直腸癌組織中的表達水平低于相應癌旁組織，且miR-152表達水平與結直腸癌患者的淋巴結轉移和TNM分期有關，miR-152表達越低的結直腸癌患者預后越差，miR-152可以作為結直腸癌患者預后的標志物；張紅森等[15]研究也發(fā)現(xiàn)miR-152在膀胱癌組織中的表達水平低于相應癌旁組織，miR-152可能通過調(diào)節(jié)ERBB3/AKT2信號通路發(fā)揮抑制膀胱癌發(fā)生發(fā)展和侵襲轉移的功能。

在肝細胞癌中，miR-152表達水平與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系亦有少量報道。Wang等[16]利用RT-PCR檢測肝癌患者和對照組血清miR-152表達水平，發(fā)現(xiàn)miR-152表達水平在肝癌患者血清中明顯下調(diào)，血清miR-152水平可以作為肝癌的診斷標志物。Dang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，miR-152在肝癌細胞中表達下調(diào)，miR-152主要通過靶向TNFRSF6B調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡在肝癌中發(fā)揮抑癌功能。Yin等[18]研究發(fā)現(xiàn)，miR-152在肝癌組織中表達下調(diào)，miR-152主要通過靶向CDK8發(fā)揮抑制腫瘤的作用，miR-152可能是治療肝癌的潛在靶標。但miR-152表達與肝癌預后的關系如何未見報道。

本研究結果顯示，miR-152在肝癌組織中的相對表達量顯著低于癌旁組織，提示miR-152在肝癌中表達下調(diào)，在生物體內(nèi)可能發(fā)揮抑癌基因的功能。本研究對miR-152高表達組和miR-152低表達組與患者相關臨床病理特征進行分析，結果顯示，miR-152表達與患者的性別、年齡、AFP水平、腫瘤數(shù)量、腫瘤直徑、手術方式和乙型肝炎病毒攜帶狀態(tài)無顯著相關，而與患者的腫瘤TNM分期、病理分化、腫瘤轉移及血管侵犯明顯相關，miR-152低表達組肝癌TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、病理分化低分化、有腫瘤轉移及有血管侵犯人數(shù)明顯高于miR-152高表達組，提示miR-152表達水平與肝癌的惡性程度和預后相關。為進一步探討miR-152在肝癌患者預后判斷中的臨床應用價值，我們采用Kaplan-Meier生存曲線法分析肝癌患者的預后與miR-152表達水平之間關系，結果顯示，miR-152低表達組的生存時間和無進展生存時間均顯著低于miR-152高表達組，差異有統(tǒng)計學意義，表明miR-152表達水平越低的肝癌患者，生存周期越短，存活率越低。多因素Cox回歸分析結果顯示，肝癌組織miR-152低表達是肝癌患者的獨立危險因素。以上結果表明，miR-152在肝癌中異常表達，且參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展，miR-152的表達水平還與肝癌患者的腫瘤進展嚴重程度呈負相關。

綜上所述，本研究結果表明，miR-152在肝癌組織中低表達，且其異常表達與肝癌患者TNM分期、病理分化、腫瘤轉移、血管侵犯及預后相關，miR-152在肝癌的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉移中起抑制作用，但miR-152在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的表達變化及其潛在的分子機制尚需進一步研究闡明。