湯良君，孫艷，張曉紅，盛少琴

0 引言

宮頸癌是全球常見的婦科惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率逐漸升高，且呈年輕化趨勢發(fā)展[1]。目前，手術(shù)前后輔助化療被認為是治療宮頸癌有效的治療方法之一，順鉑作為化療的常用藥物，在宮頸癌新輔助化療方案中作為基礎藥物被廣泛應用，然而，順鉑具有的腎、耳、血液、胃腸道等不良反應限制了化療效果[2-3]。因此，尋找可增強宮頸癌順鉑敏感度的基因靶點藥物，對降低順鉑用量、減輕不良反應具有重要的應用價值。微小RNA（microRNA,miRNA）是一類小分子非編碼單鏈RNA，通過從轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達，廣泛參與細胞的生長、分化、增殖、凋亡等過程[4]。研究發(fā)現(xiàn)，腎癌、乳腺癌等多種類型癌細胞的化療敏感度均與miR-148a表達相關(guān)[5-6]，但miR-148a與宮頸癌順鉑耐藥的關(guān)系尚不明確。信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，抑制STAT3通路可提高宮頸癌順鉑敏感度[7]。miRTarBase數(shù)據(jù)庫預測發(fā)現(xiàn)，STAT3是miR-148a的潛在靶點，其靶向關(guān)系在非小細胞肺癌中已有研究，但在宮頸癌中尚無定論[8]。HeLa細胞是宮頸癌細胞中最為穩(wěn)定且增殖迅速的細胞系，故本研究將通過調(diào)控miR-148a表達，探討miR-148a靶向STAT3對宮頸癌HeLa細胞順鉑化療敏感度的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人HeLa細胞（貨號：HZ-H496）購自美國ATCC細胞庫；胎牛血清（貨號：0025）購自美國ScienCell公司；順鉑（貨號：D8810）購自北京索萊寶科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基（貨號：KL-P0032）購自德國Merck/Sigma公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑（貨號：11668019）購自美國Invitrogen公司；實時熒光定量PCR（qRTPCR）試劑盒（貨號：K1002S）、pGL3-basic vector（貨號：E1751）購自美國Promega公司；miR-control、miR-148a mimic、nonsense inhibitor、miR-148a inhibitor及miR-148a、STAT3、U6、β-actin引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司設計合成；MTT溶液（貨號：N/A-896）購自美國AMEKO公司；AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（貨號：S0185）購自哈爾濱新?；驒z測有限公司；p-STAT3抗體、STAT3抗體、CyclinD1抗體、Bcl-2抗體、Bax抗體、Cleaved caspase-3抗體、GAPDH抗體、羊抗兔lgG（貨號：ab76315、ab119352、ab226977、ab194583、ab81083、ab2302、ab59164、ab6717）均購自美國Abcam公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（貨號：SLDL-100）購自美國BioAssay Systems公司。培養(yǎng)箱（型號：MIR-162-PC/MIR-262-PC）購自日本松下公司；熒光定量PCR儀（型號：ABI 7500）購自美國Applied Biosystems公司；酶標儀（型號：Stat Fax-2100）購自美國Awareness公司；流式細胞儀（型號：Guauasoft 6L）購自美國Millipor公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HeLa細胞，并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，細胞融合至80%左右時消化、傳代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

分為對照組（細胞不進行轉(zhuǎn)染）、mimic對照組、miR-148a mimic組、inhibitor對照組和miR-148a inhibitor組。除對照組外，其他組均使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染miR-control、miR-148a mimic、nonsense inhibitor和miR-148a inhibitor。轉(zhuǎn)染步驟：細胞在轉(zhuǎn)染前一天消化、計數(shù)鋪24孔板，用含血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，使之在轉(zhuǎn)染日密度達90%，并替換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；分別取0.8～1.0 μg轉(zhuǎn)染物miR-control、miR-148a mimic、nonsense inhibitor和miR-148a inhibitor并用50 μl DMEM培養(yǎng)基稀釋；取2 μl轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000并用DMEM培養(yǎng)基稀釋，5 min內(nèi)與轉(zhuǎn)染物稀釋液混合，室溫保溫20 min后加入每孔中輕輕搖勻，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.2 qRT-PCR法檢測HeLa細胞中miR-148a和STAT3的表達 將轉(zhuǎn)染后的各組HeLa細胞以1×105個/毫升接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl，培養(yǎng)48 h后收集細胞，使用TRIzol試劑提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，qRT-PCR試劑盒檢測細胞中miR-148a、STAT3 mRNA表達水平，U6、β-actin為內(nèi)參基因。反應條件：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火35 s，循環(huán)40次。miR-148a上游引物：5'-TCTGAGACACTCCGACTCTGA-3'，下游引物：5'-CTGGCGTCTGGAGCACTG-3'；STAT3上游引物：5'-ACTCCATCGCTGACAAAA-3'，下游引物：5'-CAGTGACCAGGCAGAAGA-3'；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；β-actin上游引物：5′-TCCCATCACCATCTTCCAG -3′，下游引物：5′-GGTATCCATCGCCATGCTC-3′。結(jié)果分析采用2-ΔΔCt法表示。

1.2.3 MTT法檢測HeLa細胞增殖 將未轉(zhuǎn)染的HeLa細胞及轉(zhuǎn)染后的各組HeLa細胞以1×105個/毫升接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl，未轉(zhuǎn)染的HeLa細胞用不同濃度的順鉑（0、1、2、4、8、16、32、64、128 μmol/L）處理48 h，轉(zhuǎn)染后的各組HeLa細胞用4 μmol/L順鉑處理48 h，每孔加50 μl 5 mg/ml的MTT溶液，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO，充分溶解后終止反應，根據(jù)酶標儀450 nm處測定的各孔吸光度OD值，計算細胞增殖抑制率，增殖抑制率=（OD對照組-OD實驗組）/OD對照組×100%。

1.2.4 流式細胞儀檢測HeLa細胞凋亡情況 將轉(zhuǎn)染后的各組HeLa細胞以1×105個/毫升接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl，4 μmol/L順鉑處理48 h后收集細胞，胰酶消化后再次收集，加入400 μl Binding Buffer將細胞重懸，依次加入Annexin V-FITC、PI各5 μl，混勻，避光孵育15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.5 流式細胞儀檢測HeLa細胞周期分布 將轉(zhuǎn)染后的各組HeLa細胞以1×105個/毫升接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl，4 μmol/L順鉑處理48 h后收集細胞，PBS洗滌，每孔加900 μl 75%乙醇固定過夜，離心收集細胞，PBS洗滌后每孔加500 μl RNase A/PI（50 μg/ml RNase A，50 μg/ml PI）重懸，避光放置20 min，流式細胞儀檢測細胞周期分布情況。

1.2.6 Western blot法檢測HeLa細胞中STAT3通路相關(guān)蛋白表達 將轉(zhuǎn)染后的各組HeLa細胞以1×105個/毫升接種于24孔培養(yǎng)板，每孔300 μl，4 μmol/L順鉑處理48 h后收集細胞，加裂解液置于冰上裂解30 min，1200 r/min離心10 min后加200 μl Loading Buffer，100℃煮沸10 min，用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。10%SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，半干法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1.5 h，加入一抗（p-STAT3抗體、STAT3抗體、Cyclin D1抗體、Bcl-2抗體、Bax抗體、Cleaved caspase-3抗體、GAPDH抗體，1:1000）孵育過夜，TBST洗滌3遍，加二抗（羊抗兔，辣根過氧化物酶標記，1:2000）孵育1 h，TBST洗膜3遍，曝光顯影，BandScan圖像分析系統(tǒng)掃描圖像并分析條帶灰度，計算目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-148a與STAT3的靶向作用關(guān)系 利用miRTarBase網(wǎng)站預測miR-148a與STAT3的靶向關(guān)系及潛在結(jié)合位點。構(gòu)建STAT3的野生型、突變型3'UTR-熒光素酶表達載體（STAT3-WT和STAT3-MUT），利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將其分別與miR-control、miR-148a mimic共同轉(zhuǎn)入HeLa細胞中，48 h后用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定熒光素酶活性，以螢火蟲與海腎熒光素酶活性比值表示熒光素酶相對活性。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0版統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后各組HeLa細胞中miR-148a和STAT3的表達

轉(zhuǎn)染后，與對照組相比，mimic對照組、inhibitor對照組HeLa細胞中miR-148a、STAT3 表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P=0.980、0.999，P=0.999、0.999）；與mimic對照組相比，miR-148a mimic組HeLa細胞中miR-148a表達水平顯著升高（P=0.000），STAT3表達水平顯著降低（P=0.000）；與inhibitor對照組相比，miR-148a inhibitor組HeLa細胞中miR-148a表達水平顯著降低（P=0.000），STAT3表達水平顯著升高（P=0.000），見圖1。

圖1 轉(zhuǎn)染后各組HeLa細胞中miR-148a、STAT3的表達水平Figure 1 Expression level of miR-148a and STAT3 in HeLa cells after transfection

2.2 不同濃度的順鉑對HeLa細胞增殖的影響

隨著順鉑濃度的升高，HeLa細胞增殖抑制率逐漸升高；HeLa細胞的順鉑IC20約為4 μmol/L，見圖2。后續(xù)實驗將以4 μmol/L為順鉑處理濃度。

圖2 不同濃度順鉑作用下HeLa細胞增殖抑制率 (x±s,n=6)Figure 2 Proliferation inhibition rate of HeLa cells under different concentrations of cisplatin treatment (x±s,n=6)

2.3 miR-148a對HeLa細胞增殖的影響

與對照組相比，mimic對照組、inhibitor對照組HeLa細胞OD值差異無統(tǒng)計學意義（P=0.969、0.969）；與mimic對照組相比，miR-148a mimic組HeLa細胞OD值顯著降低（P=0.000）；與inhibitor對照組相比，miR-148a inhibitor組HeLa細胞OD值顯著升高（P=0.000），見圖3。

圖3 各組HeLa細胞OD值Figure 3 OD values of HeLa cells in each group

2.4 miR-148a對HeLa細胞凋亡的影響

與對照組相比，mimic對照組、inhibitor對照組HeLa細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義（P=0.952、0.981）；與mimic對照組相比，miR-148a mimic組HeLa細胞凋亡率顯著升高（P=0.000）；與inhibitor對照組相比，miR-148a inhibitor組HeLa細胞凋亡率顯著降低（P=0.000），見圖4。

圖4 各組HeLa細胞凋亡情況Figure 4 Apoptosis of HeLa cells in each group

2.5 miR-148a對HeLa細胞周期分布的影響

與對照組相比，mimic對照組、inhibitor對照組HeLa細胞G0/G1、S、G2/M期比例差異無統(tǒng)計學意義（P=0.999、0.828,P=0.980、0.998,P=0.437、0.999）；與mimic對照組相比，miR-148a mimic組HeLa細胞G0/G1期比例顯著升高（P=0.000），S、G2/M期細胞比例顯著降低（P=0.000,P=0.000）；與inhibitor對照組相比，miR-148a inhibitor組HeLa細胞G0/G1期比例顯著降低（P=0.000），S、G2/M期細胞比例顯著升高（P=0.005,P=0.002），見圖5。

圖5 各組HeLa細胞周期分布情況Figure 5 Distribution of HeLa cells cycle in each group

2.6 miR-148a對HeLa細胞中STAT3通路相關(guān)蛋白的表達

與對照組相比，mimic對照組、inhibitor對照組HeLa細胞中p-STAT3/STAT3、Cyclin D1、Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P=0.952、0.996,P=0.999、0.981，P=0.820、0.996,P=0.999、0.992,P=0.990、0.990）；與mimic對照組相比，miR-148a mimic組HeLa細胞中p-STAT3/STAT3、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達水平顯著降低（P=0.000,P=0.000,P=0.000），Bax、Cleaved caspase-3蛋白表達水平顯著升高（P=0.000,P=0.000）；與inhibitor對照組相比，miR-148a inhibitor組HeLa細胞中p-STAT3/STAT3、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達水平顯著升高（P=0.000,P=0.000,P=0.000），Bax、Cleaved caspase-3蛋白表達水平顯著降低（P=0.007,P=0.000），見圖6。

圖6 各組HeLa細胞中STAT3通路相關(guān)蛋白表達Figure 6 Expression level of STAT3 pathway-related protein in HeLa cells of each group

2.7 HeLa細胞中miR-148a與STAT3的靶向作用關(guān)系

miRTarBase網(wǎng)站預測發(fā)現(xiàn)STAT3可能為miR-148a的下游靶基因。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，miR-148a對轉(zhuǎn)染突變型STAT3 3'UTR-熒光素酶表達載體細胞的熒光素酶活性無明顯影響（P=0.134），但可抑制轉(zhuǎn)染野生型STAT3 3'UTR-熒光素酶表達載體細胞的熒光素酶活性（P=0.000），見圖7～8。

圖7 miRTarBase預測miR-148a與STAT3的靶向關(guān)系Figure 7 Targeting relation between miR-148a and STAT3 predicted by miRTarBase

圖8 各組HeLa細胞相對熒光素酶活性Figure 8 Relative luciferase activity of HeLa cells in each group

3 討論

宮頸癌是女性常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率、死亡率較高，嚴重威脅女性健康及生命安全。目前，已有包括手術(shù)切除、化療、放療、激素治療在內(nèi)的多種治療措施被引入并應用于宮頸癌，但腫瘤復發(fā)仍是導致宮頸癌患者死亡的主要原因[9]。輔助化療是減少腫瘤復發(fā)的傳統(tǒng)治療策略，可明顯提高腫瘤局控率及改善患者生存率[10]。順鉑是化療的基礎藥物，但患者在治療過程中出現(xiàn)各種不良反應，不利于患者的治療效果及身心健康[11]。臨床上常通過聯(lián)合治療，在保證癌細胞敏感度不降低的前提下，降低順鉑用藥劑量及頻次，減輕不良反應[12]。因此，尋找在順鉑低劑量下，提高宮頸癌細胞順鉑化療敏感度的方法具有重要意義。本研究通過設置順鉑濃度梯度，發(fā)現(xiàn)4 μmol/L順鉑最接近HeLa細胞的IC20，故后續(xù)實驗均以4 μmol/L為順鉑處理濃度。

miRNA是一種非編碼小RNA分子，通過與靶基因mRNA的3’未翻譯區(qū)序列特異性結(jié)合，在腫瘤細胞的增殖、凋亡及放化療敏感度等生物學行為方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用[13-14]。李航等[15]研究表明，人為過表達miR-148a能降低肺癌A549、H1299細胞的增殖能力，并增強其放射敏感度。陳元元等[6]研究中亦發(fā)現(xiàn)，miR-148a-3p與乳腺癌的紫杉醇耐藥性有關(guān)，可用于判斷患者的紫杉醇耐藥情況。Li等[16]研究認為，miR-148a-3p下調(diào)是胃癌患者化療過程中產(chǎn)生順鉑耐藥性的關(guān)鍵步驟，miR-148a-3p可能是克服胃癌順鉑耐藥性的預后標志物或治療候選物。Kim等[5]研究發(fā)現(xiàn)，miR-148a能通過靶向Rab14誘導腎癌細胞凋亡，降低腎癌細胞克隆形成性并增加順鉑敏感度。本研究顯示，在4 μmol/L順鉑處理過程中，過表達miR-148a后，HeLa細胞OD值及S、G2/M期細胞比例顯著降低，凋亡率及G0/G1期細胞比例顯著升高；抑制miR-148a表達后，HeLa細胞OD值及S、G2/M期細胞比例顯著升高，凋亡率及G0/G1期細胞比例顯著降低，提示在順鉑誘導基礎上，miR-148a可進一步誘導HeLa細胞，將細胞周期阻滯于G0/G1期，進而抑制HeLa細胞增殖并促進細胞凋亡，增強HeLa細胞的順鉑敏感度。

STAT3是轉(zhuǎn)錄信號轉(zhuǎn)導子與激活子家族的重要成員，其持續(xù)激活會導致癌細胞中抗凋亡蛋白及細胞周期調(diào)控因子上調(diào)，促進腫瘤異常增殖及惡性轉(zhuǎn)化[17]。Bcl-2和Bax為Bcl-2家族的重要成員，對細胞凋亡分別具有抑制和促進作用[18]。Caspase-3是各種細胞凋亡途徑的共同執(zhí)行蛋白，Cleaved caspase-3是其活性形式[19]。Cyclin D1是重要的細胞周期調(diào)控因子，在細胞從G0期進入G1期過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[20]。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示，在HeLa細胞中，STAT3為miR-148a的下游靶基因。進一步通過蛋白檢測顯示，在4 μmol/L順鉑處理過程中，過表達miR-148a后，HeLa細胞中STAT3 mRNA及蛋白磷酸化水平、Cyclin D1、Bcl-2蛋白水平顯著降低，Bax、Cleaved caspase-3蛋白水平顯著升高；反之，抑制miR-148a表達后，HeLa細胞中STAT3 mRNA及蛋白磷酸化水平、Cyclin D1、Bcl-2蛋白水平顯著升高，Bax、Cleaved caspase-3蛋白水平顯著降低，提示在順鉑誘導基礎上，miR-148a可能通過靶向抑制STAT3的表達與活化，影響Cyclin D1、Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3蛋白水平，進而調(diào)控HeLa細胞的增殖、凋亡、細胞周期進程，增強HeLa細胞的順鉑敏感度。

綜上所述，miR-148a可靶向抑制STAT3，在順鉑處理宮頸癌HeLa細胞基礎上，抑制HeLa細胞增殖、誘導細胞周期阻滯及細胞凋亡，對HeLa細胞順鉑化療敏感度具有增強作用，在臨床化療中順鉑小劑量用藥方向具有一定前景。