郭萍，陳建，王化強，葛凱杰

0 引言

2018年全球范圍內(nèi)新增胃癌患者100余萬例，死亡約78萬例，胃癌已為常見的高致死率的癌癥之一[1]。手術(shù)是胃癌的主要治療方法，但大多數(shù)患者在確診時已處于晚期，失去了手術(shù)機會。而接受化療的晚期患者，客觀緩解率僅為20%～40%，中位總生存期為6～11月，另外化療引起的不良反應(yīng)也不容忽視[2]。目前對腫瘤的治療以晚期癌癥的分子靶向治療研究為熱點，分子靶向抑制劑可有效調(diào)節(jié)與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的信號途徑，從而調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生物學(xué)行為[3]。蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5（PRMT5）是Ⅱ型精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，可催化精氨酸殘基處底物蛋白質(zhì)的對稱二甲基化。最近研究顯示，PRMT5通過阻斷不同的信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)影響蛋白和基因表達的修飾、細胞周期進程、細胞代謝和侵襲等過程[4]。另外PRMT5在調(diào)節(jié)癌細胞的生長和轉(zhuǎn)化中也起著關(guān)鍵作用，有研究顯示下調(diào)PRMT5的表達，可通過PI3K/Akt信號通路抑制癌細胞增殖和細胞周期轉(zhuǎn)變[5]。本研究通過檢測PRMT5在胃癌細胞中的表達水平，利用轉(zhuǎn)染技術(shù)敲低PRMT5的表達水平后，進一步分析PRMT5對胃癌細胞生物學(xué)活性的影響及可能的作用機制，為胃癌的靶向治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

胃癌細胞系MGC803、SGC7901、MKN45和人胃黏膜上皮細胞GES-1購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心，胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、RPMI 1640培養(yǎng)基、MTT粉末、結(jié)晶紫粉末購于北京索萊寶有限公司；BCA蛋白定量試劑盒、凋亡檢測試劑盒購于江蘇碧云天技術(shù)有限公司。陰性對照質(zhì)粒：上游引物序列5'-GTCAGTGCATGCTGGTGAC-3'，下游引物序列5'-CCGTGTAGGTTCGCGTGA-3'；siRNA1：上游引物序列5'-TTAGTCTGATCCTGTAACCTG-3'，下游引物序列5'-TGTCGCTAGTCGGTGCTAGC-3'和siRNA2質(zhì)粒：上游引物序列5'-TATCATCGTTGTACGCTCGTG-3'，下游引物序列5'-GCCGTCGCAACGCGGGTGCA-3'由豐暉生物有限公司構(gòu)建?？?PRMT5（貨號：7998）、抗-β-catenin（貨號：8480）、抗-Cyclin D1（貨號：55506）、抗-Bax的蛋白質(zhì)（貨號：89477）、抗-β-actin（貨號：4970）和辣根過氧化物酶標記的抗兔（貨號：7074）或抗鼠（貨號：4976）抗體購于美國Cell Signal Technology有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染實驗

胃癌細胞系和人胃黏膜上皮細胞用含有10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于5%CO2的恒溫箱中孵育，待細胞融合至80%左右，進行傳代處理。將傳代處理的細胞以每孔4×106個/孔的密度接種至6孔板中，分別標記為對照組（僅含無血清、無雙抗培養(yǎng)基）、陰性對照組（脂質(zhì)體Lipofectamine 2000和質(zhì)粒載體）、siRNA1組（脂質(zhì)體Lipofectamine 2000和siRNA1質(zhì)粒）和siRNA2組（脂質(zhì)體Lipofectamine 2000和siRNA2質(zhì)粒），將質(zhì)粒與脂質(zhì)體Lipofectamine 2000（美國賽默飛公司，貨號：12566014）混合，滴加至對應(yīng)的6孔板中，培養(yǎng)6 h后，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)孵育48 h，Western blot檢測PRMT5蛋白表達情況。

1.3 Western blot實驗

收集MGC803、SGC7901、MKN45、GES-1細胞和經(jīng)過轉(zhuǎn)染處理的對照組、陰性對照組、siRNA1組和siRNA2組細胞，3000 r/min離心10 min，棄去上清液，保留沉淀的細胞。加入細胞裂解液，在冰塊上裂解30 min，至于4℃離心機中，1 200 r/min離心15 min，收集上清液。采用BCA蛋白定量試劑盒檢測PRMT5蛋白濃度，與Loading buffer混勻后在沸水中煮5 min，用于凝膠電泳。制備15%的分離膠和5%的濃縮膠，加入蛋白樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將膠上的PRMT5蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上。根據(jù)目的蛋白分子量和Marker切取所需檢測的條帶，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，在所需檢測的目的蛋白條帶上分別滴加抗-PRMT5、抗-β-catenin、抗-Cyclin D1、抗-Bax、抗-β-actin抗體（1:1000），在4℃冰箱中過夜。TBST溶液清洗，滴加二抗（1:4000）室溫孵育1 h，再次TBST溶液清洗。配制一定量的顯影液，拍照顯色。

1.4 MTT實驗

收集對照組、陰性對照組和siRNA2組細胞，以3 000個/孔的密度接種至96孔板中，鋪種4塊板分別在24、48、72和96 h時檢測細胞OD值，至檢測時間點時，在檢測孔中滴加20 μl MTT溶液，放置恒溫箱中再孵育4 h，棄上清液，滴加150 μl二甲基亞砜溶液，在震蕩器上震蕩5 min，使細胞充分裂解，在酶標儀上檢測570 nm處細胞的OD值。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡率

對照組、陰性對照組和siRNA2組細胞以每孔4×105個細胞的密度接種至6孔板中，恒溫箱中孵育48 h，收集細胞。加入500 μl的Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細胞，再加入5 μl的Annexin V-FITC和10 μl的碘化丙啶（Propidium Iodide,PI），輕輕混勻，室溫避光孵育10 min，用流式細胞儀檢測。右下象限為早期凋亡細胞，右上象限為晚期凋亡細胞，凋亡率=（早期凋亡細胞+晚期凋亡細胞）/總細胞數(shù)×100%。

1.6 Transwell實驗

收集對照組、陰性對照組和siRNA2組細胞，以5 000個/孔的密度接種至小室中，置于恒溫箱中孵育48 h。取出小室，用棉簽擦掉小室中未穿過的細胞，然后放入1 ml多聚甲醛溶液中浸泡，室溫固定10 min。再放入0.1%結(jié)晶紫的染色液中 30 min，PBS清洗3次，置于顯微鏡下拍照，每個處理組選擇5個視野拍照。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用多因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PRMT5在胃癌細胞和人胃黏膜上皮細胞中的表達水平

Western blot結(jié)果顯示，PRMT5在胃癌細胞系MGC803、SGC7901和MKN45中的表達水平均高于人胃黏膜上皮細胞GES-1，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001），見圖1。

2.2 敲低SGC7901細胞中PRMT5的表達水平

敲低SGC7901細胞中PRMT5的表達后，陰性對照組與對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.152），排除載體對PRMT5表達的影響，siRNA1、siRNA2組中PRMT5的表達均低于對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001）。siRNA2組中PRMT5的表達水平雖低于siRNA1組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.095），因此選用siRNA2組進行后續(xù)實驗，見圖2。

圖2 敲低SGC7901細胞中PRMT5的表達水平Figure 2 Expression level of PRMT5 in SGC7901 cells after transfection

2.3 不同組間細胞增殖情況

48 h時siRNA2組細胞的OD值（0.32±0.06）低于對照組（0.48±0.06）和陰性對照組（0.42±0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.024、0.035）；72 h時siRNA2組細胞的OD值（0.62±0.08）低于對照組（0.96±0.12）和陰性對照組（0.92±0.10），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.012、0.017）；96 h時siRNA2組細胞的OD值（0.94±0.09）低于對照組（1.42±0.14）和陰性對照組（1.35±0.09），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.006、0.008），見圖3。

圖3 不同組間細胞增殖情況Figure 3 Cell proliferation among different groups

2.4 不同組間細胞凋亡率的比較

培養(yǎng)48 h后siRNA2組細胞的凋亡率（43.5±4.6）%，高于對照組（8.4±2.1）%、陰性對照組（8.5±1.9）%，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001），見圖4。

圖4 培養(yǎng)48h時不同組間細胞凋亡率的比較Figure 4 Comparison of cell apoptosis after cultured 48h among different groups

2.5 不同組間發(fā)生侵襲細胞數(shù)的比較

細胞培養(yǎng)48 h后，siRNA2組發(fā)生侵襲的細胞數(shù)（18.6±3.5）個，低于對照組（48.2±3.8）個、陰性對照組（49.3±3.1）個，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見圖5。

圖5 培養(yǎng)48h后不同組間發(fā)生侵襲細胞數(shù)的比較Figure 5 Comparison of invaded cells number after cultured 48h among different groups

2.6 PRMT5對Wnt/β-catenin信號通路的影響

對照組、陰性對照組和siRNA2組細胞培養(yǎng)48 h后，siRNA2組細胞β-catenin和Cyclin D1蛋白的表達明顯低于對照組和陰性對照組，Bax蛋白的表達明顯高于對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001），見圖6。

圖6 PRMT5對Wnt/β-catenin信號通路中關(guān)鍵蛋白和Bax蛋白表達的影響Figure 6 Effect of PRMT5 on the expression of key proteins and Bax protein in the Wnt/β-catenin signaling pathway

3 討論

PRMT5對細胞增殖的調(diào)節(jié)及其在癌癥中被錯誤調(diào)節(jié)或與突變蛋白質(zhì)的相互作用，使PRMT5在癌癥中扮演致癌角色[6-7]。有多項研究顯示PRMT5是一種癌基因，在癌癥進展中發(fā)揮舉足輕重的作用[8-10]。PRMT5的過度表達似乎是其致瘤性的重要因素，并在許多癌癥中均有研究，包括卵巢癌[6]、肺癌[11]、淋巴瘤[12]和結(jié)腸癌[13]等。在上皮性卵巢癌中，PRMT5表達水平的增加與患者生存率降低相關(guān)[6]。細胞核中PRMT5的表達水平增加與口咽鱗狀細胞癌患者預(yù)后不良有關(guān)[14]。PRMT5的高表達與不良預(yù)后直接相關(guān)，可能是通過影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和組蛋白甲基化造成的[15-16]。以上研究表明，PRMT5在多種癌癥中發(fā)揮致瘤作用，并闡述一些作用機制，但對PRMT5在癌癥中靶向治療研究較少，本研究主要檢測PRMT5在胃癌中的表達，通過轉(zhuǎn)染技術(shù)敲低其表達水平后，觀察PRMT5對胃癌細胞的影響及作用機制，為胃癌的靶向治療提供理論基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果顯示，PRMT5在胃癌中的表達水平增加，提示PRMT5在胃癌中發(fā)揮促癌作用。另外通過轉(zhuǎn)染技術(shù)，敲低PRMT5的表達水平后，胃癌細胞的增殖和侵襲能力明顯減弱，發(fā)生凋亡的細胞數(shù)增加，以上結(jié)果表明PRMT5有可能是治療胃癌的有效靶點。在調(diào)控細胞增殖、分化的關(guān)鍵信號途徑中Wnt/β-catenin信號通路在胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移等多個過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Chung等[17]研究顯示，PRMT5通過激活Wnt/β-catenin信號通路，促進淋巴瘤細胞的存活，因此減弱PRMT5的表達水平，抑制Wnt/β-catenin信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)具有一定的抗腫瘤作用。Song等[18]研究顯示，Wnt/β-catenin信號通路的異常激活與胃癌的進展相關(guān)，并通過控制組蛋白乙酰化促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。因此尋找抑制此信號通路激活的作用靶點是目前研究的熱點之一。Wnt信號通路被激活可抑制β-catenin的磷酸化，未發(fā)生磷酸化的β-catenin轉(zhuǎn)位入核，激活Cyclin D1、Bax等下游靶基因表達，從而在腫瘤形成及發(fā)展中發(fā)揮作用[19]。Cyclin D1是細胞從G1期到S期的細胞周期調(diào)節(jié)器，降低其表達水平可抑制細胞周期的進展，PRMT5可通過直接調(diào)節(jié)Cyclin D1的表達抑制B-淋巴細胞的增殖[20]。多項研究顯示，抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活可抑制胃癌細胞增殖，Gao等[21]研究顯示，Cyclin G2通過抑制Wnt/β-catenin信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制胃癌細胞的生長和遷移。Hu等[22]研究顯示，番石榴苷C通過減弱人胃癌細胞中的Wnt/β-catenin/c-Myc信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制細胞增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，敲低PRMT5的表達后可抑制β-catenin和Cyclin D1蛋白的表達，上調(diào)凋亡蛋白Bax的表達，提示敲低PRMT5可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路影響胃癌細胞生長。

綜上所述，PRMT5在胃癌細胞中表達水平上調(diào)，通過敲低其表達水平后可抑制胃癌細胞的增殖、侵襲并誘導(dǎo)細胞凋亡，其機制可能與減弱Wnt/β-catenin信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，提示PRMT5可能是治療胃癌的有效靶點。