劉憲，張燕茹,2，陳茜，馮倩,2，王海燕，崔南

0 引言

在全球范圍內(nèi)，宮頸癌是僅次于乳腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌的女性第四種常見腫瘤類型，嚴(yán)重威脅女性的健康和生命[1]。Slug又稱為Snai2（snail family transcriptional repressor 2,Snail家族轉(zhuǎn)錄抑制因子2）,是Snail鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，在細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換（EMT）過程中發(fā)揮重要作用。目前的研究表明Slug可以促進(jìn)多種類型腫瘤細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換過程，并兼具促進(jìn)或抑制腫瘤細(xì)胞增殖的雙重作用[2]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌細(xì)胞中，Slug可以降低Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性，顯著下調(diào)CDH3在宮頸癌細(xì)胞系SiHa中的表達(dá)[3]。CDH3又稱為P-cadherin（cadherin 3,鈣黏蛋白3），是鈣黏蛋白家族的一員。CDH3通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性，參與腫瘤細(xì)胞的增殖及腫瘤的生長[4]。但在宮頸癌中，關(guān)于Slug能否調(diào)節(jié)CDH3表達(dá)及Slug通過CDH3如何調(diào)節(jié)wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性的研究仍不多見。本研究通過檢測Slug對CDH3啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，探討Slug通過轉(zhuǎn)錄抑制CDH3表達(dá)下調(diào)β-catenin和C-myc在SiHa細(xì)胞中的表達(dá)從而抑制細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

宮頸癌細(xì)胞系SiHa和HeLa購自美國ATCC公司。CDH3表達(dá)載體3FLAG-SV40-EGFP-IRER購于上海吉?jiǎng)P基因公司，質(zhì)粒表達(dá)載體pCAG-IRES2-AcVEC-neo由本實(shí)驗(yàn)室保存。DMEM培養(yǎng)基購于上海源培生物科技有限公司，胎牛血清購于以色列Biological Industries公司，Slug蛋白抗體購于美國Cell Signaling Technology公司，CDH3、β-catenin、C-myc和GAPDH蛋白抗體均購于美國Santa Cruz公司，染色質(zhì)免疫共沉淀試劑盒購于美國Millipore公司，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購于美國Promega公司，其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人宮頸癌細(xì)胞SiHa和HeLa培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。穩(wěn)定表達(dá)Slug蛋白的SiHa細(xì)胞系SiHa-Slug（SiHa-Slug-2和SiHa-Slug-3）及其對照細(xì)胞SiHa-Vec（SiHa-Vec-2和SiHa-Vec-3）通過G418壓力篩選獲取，保存于本實(shí)驗(yàn)室[3]。在HeLa和SiHa-Slug細(xì)胞中通過脂質(zhì)體瞬轉(zhuǎn)CDH3表達(dá)載體3FLAG-SV40-EGFP-IRER，分別獲得HeLa-NC、HeLa-CDH3和SiHa-Slug-CDH3細(xì)胞。

1.2.2 RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測序 使用TRIzol試劑盒（美國Invitrogen公司）提取SiHa-Vec（Vec2、Vec3和Vec5）和SiHa-Slug（Slug2、Slug3和Slug5）兩組細(xì)胞的總RNA，之后將樣本交于華大基因公司通過BGISEQ-500平臺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，隨后的數(shù)據(jù)通過華大基因公司的Dr.Tom在線系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.2.3 Real-time PCR檢測細(xì)胞mRNA表達(dá) 通過Cancer Cell Line Encyclopedia數(shù)據(jù)庫分析CDH3在HeLa和SiHa細(xì)胞中mRNA的表達(dá)。使用TRIzol試劑提取細(xì)胞的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以NCBI Gene bank提供的人基因序列為模板設(shè)計(jì)特異性Real-time PCR引物，見表1。Real-time PCR按照SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ說明書進(jìn)行。將各管混勻離心后，置于Bio-Rad iQ5熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。每個(gè)樣品準(zhǔn)備3個(gè)復(fù)管，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3遍。

表1 Real-time PCR引物Table 1 Primer sequences for real-time PCR

1.2.4 免疫細(xì)胞化學(xué) 對數(shù)生長期的細(xì)胞胰酶消化后制備成細(xì)胞懸液，接種于0.5 cm×0.5 cm的爬片上。細(xì)胞融合度達(dá)到70%左右后，依次進(jìn)行下述步驟：PBS洗滌5min×3次，4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS洗滌5 min×3次，加入0.2%TritonX-100，室溫放置10 min，PBS洗滌5 min×3次，將細(xì)胞爬片粘在載玻片上滴加一抗，4℃濕盒過夜。次日，取出濕盒，室溫放置30 min，PBS洗滌5 min×3次，滴加二抗，室溫放置30 min，PBS洗滌5 min×3次，DAB顯色，蘇木素染色2 min，鹽酸酒精分化15 s，氨水反藍(lán)15 s，梯度酒精脫水各5 min，二甲苯透明2 min，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 將細(xì)胞胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，以1000個(gè)/孔細(xì)胞濃度接種于96孔培養(yǎng)板中。接種后1、2、3、4、5 d，采用CCK-8法檢測各組OD值。步驟如下：每孔加入10 μl CCK-8，5%CO2培養(yǎng)箱孵育2 h，吸棄上清液，于酶標(biāo)儀上測定450 nm波長吸光度值，根據(jù)吸光度值繪制生長曲線，各實(shí)驗(yàn)組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測細(xì)胞增殖 將細(xì)胞胰酶消化后制備成單細(xì)胞懸液，按照4×104個(gè)/皿細(xì)胞的濃度接種于6孔板。接種后1、2、3、4、5 d，分別進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果繪制細(xì)胞生長曲線，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 Western blot實(shí)驗(yàn) 收集處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液收集細(xì)胞蛋白，并測定各組細(xì)胞的蛋白濃度，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將膜于5%的脫脂奶粉（TBST緩沖液配置）中室溫封閉1 h后加入一抗，4℃孵育過夜。次日，TBST洗膜（10 min×4次），二抗室溫孵育1 h后TBST洗膜（10 min×4次），然后用化學(xué)發(fā)光檢測液進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，通過Western blot化學(xué)發(fā)光成像一體機(jī)（陜西鑫來博生物工程有限公司）拍照分析。

1.2.8 CDH3啟動(dòng)子區(qū)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn) 通過使用UCSC在線數(shù)據(jù)庫分析CDH3基因啟動(dòng)子區(qū)后，在其啟動(dòng)子區(qū)427 bp到-1483 bp的序列中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)E-box（CANNTG）的特異序列。選擇Promega公司的pGL3 Luciferase Reporter Vectors構(gòu)建CDH3雙熒光素酶報(bào)告載體，以MluⅠ和BglⅡ作為酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性引物，引物見表2。構(gòu)建包含CDH3啟動(dòng)子區(qū)不同E-box作用元件的雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。之后取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，0.25%胰酶消化重懸為單細(xì)胞懸液，以5×104個(gè)/孔細(xì)胞濃度接種于24孔板。將CDH3啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基因質(zhì)粒與內(nèi)參載體海參（pRL-TK）報(bào)告基因質(zhì)粒按照LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染系統(tǒng)操作說明分別共轉(zhuǎn)染于SiHa-Vec和SiHa-Slug細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒操作說明檢測熒光素酶活性：棄去24孔板中的培養(yǎng)基，加入PBS，輕輕洗滌細(xì)胞后棄去洗滌液，加入100 μl的1×PLB細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，將細(xì)胞懸液移入1.5 ml EP管，待測。取待測樣品20 μl加入EP管中，然后加入100 μl熒光素酶測試試劑LAR Ⅱ吹打混合后，放入發(fā)光檢測儀中檢測螢火蟲熒光素酶活性，記錄第一次發(fā)光值（FLU）。加入等體積的1×Stop &GloTM試劑，輕輕混勻，發(fā)光檢測儀中檢測Renilla熒光素酶活性，記錄第二次發(fā)光值（RLU）。以FLU/RLU比值評估TOP/FOP-Flash報(bào)告基因的相對表達(dá)量。

表2 雙熒光素酶報(bào)告載體引物Table 2 Primer sequences for luciferase reporter vectors

1.2.9 染色質(zhì)免疫共沉淀 按照染色質(zhì)免疫共沉淀試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：在培養(yǎng)的細(xì)胞中加入37%甲醛，37℃孵育10 min，進(jìn)行細(xì)胞的甲醛交聯(lián)。后加入2 ml 10×甘氨酸終止交聯(lián)。將細(xì)胞收集于1.5 ml離心管中，重懸于SDS 裂解緩沖液中。將細(xì)胞裂解液在冰上進(jìn)行超聲破碎DNA，12 000g，4℃離心10 min收集上清液，-80℃保存待用。在100 μl的超聲破碎產(chǎn)物中，加入900 μl ChIP稀釋緩沖液和20 μl的50×蛋白酶抑制劑Ⅱ，再加入60 μl G蛋白瓊脂糖。4℃顛轉(zhuǎn)混勻1 h，3000～5000g離心1 min。收集上清液，留取20 μl做為陽性對照。分別加入5.0 μg Slug抗體、1.0 μg陰性對照和1.0 μg陽性對照，4℃搖床顛轉(zhuǎn)過夜。過夜孵育后，按說明書步驟洗脫回收DNA樣品。設(shè)計(jì)特異性引物，見表1。以回收的DNA樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：94℃，10 min；94℃，20 s，60℃，60 s，50循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組樣本間的均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組樣本間的均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Slug抑制CDH3在SiHa細(xì)胞中的表達(dá)

轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果顯示，同對照組（SiHa-Vec）相比，在SiHa-Slug細(xì)胞中，共檢測到500個(gè)上調(diào)基因和294個(gè)下調(diào)基因，見圖1A。其中，CDH3表達(dá)在SiHa-Slug組中顯著降低，見圖1B。Real-time PCR、Western blot和細(xì)胞免疫化學(xué)的結(jié)果顯示，在SiHa細(xì)胞中過表達(dá)Slug可以下調(diào)CDH3的表達(dá)，見圖1C～E。

圖1 Slug抑制CDH3在SiHa細(xì)胞中的表達(dá)Figure 1 Slug inhibited CDH3 expression in SiHa cells

2.2 CDH3通過上調(diào)β-catenin和C-myc蛋白表達(dá)促進(jìn)HeLa細(xì)胞的增殖

Cancer Cell Line Encyclopedia數(shù)據(jù)庫的結(jié)果顯示CDH3在HeLa細(xì)胞中低表達(dá)，見圖2A。Western blot和細(xì)胞免疫化學(xué)的結(jié)果顯示，CDH3在HeLa細(xì)胞中低表達(dá)，在SiHa細(xì)胞中的表達(dá)高于HeLa細(xì)胞，見圖2B～C。在HeLa細(xì)胞中瞬轉(zhuǎn)CDH3后，可以上調(diào)CDH3、β-catenin和C-myc在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)（P＜0.05），見圖2D。細(xì)胞計(jì)數(shù)和CCK-8實(shí)驗(yàn)表明，在HeLa細(xì)胞中上調(diào)CDH3表達(dá)后可以促進(jìn)HeLa細(xì)胞的增殖（P=0.0337,P=0.0010），見圖2E～F。

圖2 CDH3促進(jìn)HeLa細(xì)胞的增殖Figure 2 CDH3 promoted proliferation of HeLa cells

2.3 Slug通過轉(zhuǎn)錄抑制CDH3表達(dá)下調(diào)β-catenin/C-myc蛋白表達(dá)

在SiHa-Slug細(xì)胞中挽救CDH3表達(dá)后，可以顯著上調(diào)CDH3、β-catenin和C-myc蛋白的表達(dá)（P＜0.05），見圖3A。細(xì)胞計(jì)數(shù)和CCK-8實(shí)驗(yàn)表明，挽救CDH3表達(dá)可以恢復(fù)SiHa-Slug細(xì)胞的增殖活力（P=0.0024,P=0.0032），見圖3B～C。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)和染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Slug可以識別并結(jié)合于CDH3啟動(dòng)子區(qū)的E-box，從而轉(zhuǎn)錄抑制CDH3表達(dá)，見圖3D～E。

圖3 Slug在SiHa細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄抑制CDH3表達(dá)Figure 3 Slug transcription inhibited CDH3 expression in SiHa cells

3 討論

Slug被認(rèn)為參與多種腫瘤細(xì)胞的生理過程，促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，增加腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[5]。Slug可以促進(jìn)肺癌及成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的增殖，但也可以抑制前列腺癌細(xì)胞和人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖[6]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，Slug通過抑制Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性可以抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和腫瘤生長[6]。在本研究中，RNA-sequence測序的結(jié)果提示Slug表達(dá)可以顯著抑制CDH3在SiHa細(xì)胞中的表達(dá)。CDH3（P-cadherin）最早于1986年在發(fā)育中的小鼠胚胎中發(fā)現(xiàn)[7]。與鈣黏蛋白家族的其他成員類似，CDH3在細(xì)胞的生長和遷移過程中發(fā)揮重要作用。但是CDH3在不同類型腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中呈現(xiàn)不同的作用[4]。有研究表明CDH3可以促進(jìn)胃癌、胰腺癌及乳腺癌等腫瘤的發(fā)生，相反的，在肝細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌和黑色素瘤中，CDH3抑制腫瘤的發(fā)生[8-10]。通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性，CDH3可以參與調(diào)節(jié)多種腫瘤細(xì)胞的增殖及腫瘤的生長[11]。本研究證實(shí)了在SiHa細(xì)胞中過表達(dá)Slug可以顯著抑制CDH3的表達(dá)。因此，我們推測在宮頸癌中，Slug是否可以通過CDH3調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性。

Cancer Cell Line Encyclopedia數(shù)據(jù)庫的結(jié)果顯示，CDH3 mRNA水平在HeLa細(xì)胞中低于SiHa細(xì)胞。Western blot和細(xì)胞免疫化學(xué)的結(jié)果也證實(shí)CDH3的表達(dá)在SiHa細(xì)胞中高于HeLa細(xì)胞。因此，為了進(jìn)一步研究CDH3在宮頸癌細(xì)胞中的作用，在HeLa細(xì)胞中通過瞬轉(zhuǎn)CDH3表達(dá)載體上調(diào)了CDH3蛋白水平，細(xì)胞計(jì)數(shù)和CCK-8的結(jié)果顯示CDH3可以促進(jìn)HeLa細(xì)胞的增殖。Western blot的結(jié)果證實(shí)，在HeLa細(xì)胞中瞬轉(zhuǎn)CDH3表達(dá)載體后可以上調(diào)β-catenin 及其下游分子C-myc的表達(dá)。此外，在Slug過表達(dá)的SiHa細(xì)胞中通過瞬轉(zhuǎn)CDH3表達(dá)載體挽救CDH3表達(dá)后，也可以上調(diào)β-catenin 及其下游分子C-myc的表達(dá)，并恢復(fù)細(xì)胞的增殖能力。目前的研究也證實(shí)，C-myc可以促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞的增殖[12]。因此，我們推測，Slug通過抑制CDH3的轉(zhuǎn)錄，可以下調(diào)β-catenin 及其下游分子C-myc的表達(dá)，從而抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖。

Slug通過識別并結(jié)合于目的基因啟動(dòng)子區(qū)的E-box（CANNTG）作用元件轉(zhuǎn)錄抑制目的基因的表達(dá)[5]。通過UCSC在線數(shù)據(jù)庫分析CDH3基因啟動(dòng)子區(qū)，發(fā)現(xiàn)在其啟動(dòng)子區(qū)427 bp到-1483 bp的序列中包含多個(gè)E-box（CANNTG）特異序列。包括有：CACCTG（P7,P6),CAGATG（P5）,CACTTG（P2,P4）,CAGGTG（P3,P1）。本研究結(jié)果表明，和SiHa-Vec相比，熒光素酶報(bào)告載體P5和P3的酶活性都出現(xiàn)了不同程度的下降。此外，染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）的結(jié)果顯示，在SiHa-Slug細(xì)胞中，Slug同P3和P5位的E-box（CANNTG）有不同程度的結(jié)合。以上結(jié)果表明Slug可以特異性的識別并且結(jié)合于CDH3啟動(dòng)子區(qū)的E-box，轉(zhuǎn)錄抑制CDH3的表達(dá)。綜上所述，Slug通過轉(zhuǎn)錄抑制CDH3的表達(dá)，可以下調(diào)β-catenin及其下游分子C-myc的表達(dá)，從而抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖。