李佩洪, 曾攀, 龔霞, 唐偉, 陳政

四川省植物工程研究院，四川 資中 641200

長期以來，花椒栽培以清耕為主要的栽培方式，椒園物種單一，生態(tài)系統(tǒng)簡單，其生產(chǎn)特征是土壤肥力主要依賴于化肥的不斷投入，病蟲害防治完全依賴化學(xué)農(nóng)藥，這種生產(chǎn)方式導(dǎo)致椒園生態(tài)系統(tǒng)生物多樣性降低、病蟲害大規(guī)模集中爆發(fā)、土壤酸化、水土流失、環(huán)境污染等一系列生態(tài)環(huán)境問題，最終導(dǎo)致花椒園產(chǎn)量下降，花椒農(nóng)殘、重金屬含量超標(biāo)，市場競爭力降低。因此構(gòu)建生態(tài)化的生產(chǎn)體系，保障花椒園良好的生態(tài)環(huán)境，生產(chǎn)無公害、綠色、有機(jī)產(chǎn)品，促進(jìn)產(chǎn)業(yè)健康高效持續(xù)發(fā)展，已成為花椒生產(chǎn)中需要重點(diǎn)解決的問題之一。

生草栽培是一種現(xiàn)代化的果園管理模式，在發(fā)達(dá)國家應(yīng)用較多，我國在蘋果、梨樹、葡萄上進(jìn)行了廣泛的研究[1-3]，在花椒上的研究處于起步階段，研究發(fā)現(xiàn)，種植三葉草可以提高花椒林土壤含水量、林內(nèi)空氣溫度、蒸騰速率[4,5]，花椒林下種草可有效減輕雨水對地表的濺蝕作用，攔蓄地表徑流達(dá)30%以上[6]，但是也有研究表明花椒林中花椒在與白茅等雜草的競爭中處于劣勢，雜草與花椒樹爭肥嚴(yán)重[7]?；ń穼儆跍\根性樹種，其根系主要分布在0~40 cm土層，生草對土壤養(yǎng)分及土壤微生物組成的影響將直接影響花椒根系的生長和其對養(yǎng)分的吸收，因此本文就生草對花椒林土壤養(yǎng)分及土壤微生物組成的影響進(jìn)行了研究，以期為花椒林下生草模式提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計

試驗(yàn)地位于資中縣銀山鎮(zhèn)朱家場，建園已5年的青花椒園。選擇白三葉、自然生草[2,3,8]開展試驗(yàn)。2019年3月，選擇同一塊地，將試驗(yàn)分為3個區(qū)，分別為白三葉區(qū)，自然生草區(qū)（雜草），對照區(qū)（清耕區(qū)），各區(qū)域200 m2。采用行間生草模式，生草帶和樹基距離 0.5 m，每側(cè)保留 0.5 m 清耕保護(hù)帶（除草布覆蓋），生草帶寬2 m。播前要精細(xì)整地，除凈雜草，整地時不能深翻，以免對花椒根系造成嚴(yán)重影響。整地同時施稀釋后的沼液，白三葉萌發(fā)長出3~5片葉子后只進(jìn)行水分管理。其他青花椒樹正常施肥管理3個區(qū)域同時進(jìn)行，不再對白三葉區(qū)域額外進(jìn)行管理。

1.2 野外采樣

生草第 1年8月底在各標(biāo)準(zhǔn)地內(nèi)采用蛇形法布置15個采樣點(diǎn)，每個采樣點(diǎn)分層取 0~60 cm（20 cm為一層）土樣，每層混合后取樣裝入滅菌塑料袋。將帶回實(shí)驗(yàn)室的土樣分成兩份，一份進(jìn)行土壤養(yǎng)分的測定，一份進(jìn)行微生物的檢測。

1.3 土壤養(yǎng)分測定

總氮：NY/T53-1987土壤全氮測定法（半微量開氏法）；總磷：NY/T88-1988土壤全磷測定法；總鉀：NY/T87-1988土壤全鉀測定法；有效鐵：NY/T890-2004土壤中有效態(tài)鋅、錳、鐵、銅含量的測定 二乙三胺五乙酸（DTPA）浸提法；有效鈣：NY/T296-1995土壤全量鈣、鎂、鈉的測定；有效硼：NY/T149-1990 土壤有效硼測定方法。銨態(tài)氮、速效磷、速效鉀、有機(jī)質(zhì)按浙江托普云農(nóng)土壤養(yǎng)分測定使用說明書測定，說明書版本V11.2.4。

1.4 土壤微生物測定

主要包括以下步驟：微生物組總DNA提取—目標(biāo)片段PCR擴(kuò)增—擴(kuò)增產(chǎn)物磁珠純化回收—擴(kuò)增產(chǎn)物熒光定量—測序文庫制備—上機(jī)進(jìn)行高通量測序，由上海派森諾生物技術(shù)股份有限公司完成測定。儀器與設(shè)備包括pH計，酸式滴定管，紫外可見分光光度計TU-1901，原子吸收分光光度計TAS-990F，電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀 Optima 8000，土壤養(yǎng)分速測儀TPY-16A。

數(shù)據(jù)庫：細(xì)菌或古菌的16S rRNA基因默認(rèn)選用Greengenes數(shù)據(jù)庫)，也可選用Silva數(shù)據(jù)庫；真核微生物18S rRNA基因默認(rèn)選用Silva數(shù)據(jù)庫；真菌ITS序列的默認(rèn)選用UNITE數(shù)據(jù)庫；功能基因或其他需求使用本地化的nt數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋

測序：調(diào)用 qiime cutadapt trim-paired 切除序列的引物片段，棄去未匹配引物的序列；然后通過qiime dada2 denoise-paired 調(diào)用 DADA2進(jìn)行質(zhì)控、去噪、拼接、去嵌合體。以上步驟針對每個文庫分別進(jìn)行分析。完成對所有文庫的去噪后，合并ASVs特征序列和ASV表格，并去除singletons ASVs。

2 結(jié)果與分析

2.1 生草對土壤水分與養(yǎng)分的影響

生草降低了花椒園土壤的水分含量，以清耕為對照，白三葉種植區(qū)平均降低了20.17%，自然生草區(qū)平均降低了21.99%。并且土層越淺，降低的越多：在0~20 cm土層，白三葉種植區(qū)降低了39.22%，自然生草區(qū)降低了29.77%，在20~40 cm土層，白三葉種植區(qū)降低了18.67%，自然生草區(qū)降低了29.18%，在40~60 cm土層，差異不大（見表1）。

表1 土壤養(yǎng)分測定結(jié)果Tab.1 Result of soil nutrients

生草增加了花椒園土壤的有機(jī)質(zhì)含量，白三葉種植區(qū)0~60 cm土層有機(jī)質(zhì)平均含量為清耕區(qū)的1.89倍，自然生草區(qū)為清耕區(qū)的2.27倍。白三葉種植區(qū)土壤有機(jī)質(zhì)增加主要在0~20 cm土層，自然生草區(qū)在各土層均明顯增加。

2.2 生草對土壤營養(yǎng)元素的影響

生草對花椒園土壤營養(yǎng)元素的含量影響較大，主要對土壤中的全氮、磷、鉀，速效氮、磷、鉀，以及花椒生殖生長過程中需求較多的鈣、硼進(jìn)行了測定（見表1）。各土層平均值顯示，種植白三葉增加了土壤中全鉀、有效鉀、有效硼的含量，降低了土壤中總氮、總磷、銨態(tài)氮、有效磷、鈣的含量，其中銨態(tài)氮、有效磷下降明顯，分別較清耕區(qū)減少28.61%和15.69%。自然生草增加了土壤中總磷、全鉀、有效鉀、有效硼的含量，降低了土壤中總氮、銨態(tài)氮、有效磷、鈣的含量，其中總磷較清耕區(qū)增加了29.57%，有效鉀增加了16.59%。在0~20 cm土層，白三葉種植區(qū)總氮、總磷、全鉀、銨態(tài)氮、有效磷、有效鉀、鈣、硼均低于清耕區(qū)，自然生草區(qū)土壤總氮、銨態(tài)氮、鈣、有效硼含量低于清耕區(qū)，而總磷、全鉀、有效磷、有效鉀含量高于清耕區(qū)。在20~40 cm土層，白三葉種植區(qū)土壤總磷、全鉀、有效鉀、鈣、有效硼含量高于清耕區(qū)，土壤銨態(tài)氮、有效磷含量低于清耕區(qū)，自然生草區(qū)土壤中總氮、銨態(tài)氮、有效磷含量低于清耕區(qū)，而總磷、全鉀、有效鉀、鈣、有效硼含量高于清耕區(qū)。在40~60 cm土層，白三葉種植區(qū)土壤總磷、全鉀、銨態(tài)氮、有效鉀、有效硼含量高于清耕區(qū)，總氮、有效磷、鈣含量低于清耕區(qū)，自然生草區(qū)土壤中總氮、總磷、銨態(tài)氮、有效鉀、有效硼含量高于清耕區(qū)，而全鉀、有效磷、鈣含量低于清耕區(qū)。

2.3 土壤微生物測定結(jié)果

對每個樣本的測序量進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果如表2所示。圖1表示每個樣本中的微生物群落在各分類水平的具體組成。由圖可知，clover10和weeds10在0—20 cm土層的土壤微生物的分類單元數(shù)明顯高于CK10，其他各個試驗(yàn)區(qū)不同土層厚度微生物分類單元數(shù)差異不大，說明生草明顯提高了表層土壤微生物的種類。其主要原因與生草增加了土壤中有機(jī)殘體的量有關(guān)，土壤微生物的主要營養(yǎng)來源是植物有機(jī)殘體，其數(shù)量很大程度上與有機(jī)殘體含量成正相關(guān)。

圖1 各水平微生物分類單元數(shù)統(tǒng)計圖Fig.1 Statistical diagram of the number of microbial classification unit at each level

表2 每樣本測序量統(tǒng)計表Tab.2 Statistical result of sequencing quantity per sample (tag)

由圖2可知，在屬這個水平上，生草區(qū)域包括白三葉區(qū)域（clover），自然生草區(qū)域（weeds）其微生物豐度都顯著高于清耕區(qū)域。以清耕為對照，生草區(qū)域微生物的種群結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化：白三葉區(qū)域其Fusarium、Mortierella、lentinula的相對豐度顯著減少，Talaromyces、Acremonium和pseudorobillarda的相對豐度顯著增加；自然生草區(qū)域penicillium、Fusarium的相對豐度顯著增加，Mortierella、lentinula的相對豐度顯著減少。

圖2 屬水平物種的相對豐度圖Fig.2 Relative abundance diagram of species composition at genus level

3 討論

根據(jù)測定結(jié)果，以清耕為對照，生草對土壤水分的消耗較大，并且土層越淺，消耗的越多。生草對土壤養(yǎng)分的影響主要集中土壤表層：在0~20 cm土層，白三葉試驗(yàn)區(qū)土壤測定指標(biāo)中的水分、總氮、總磷、全鉀、銨態(tài)氮、有效磷、有效鉀、鈣、有效硼的含量均低于清耕，說明種植白三葉對土壤養(yǎng)分有一定的消耗，與花椒樹根系存在養(yǎng)分競爭。自然生草區(qū)水分、總氮、銨態(tài)氮、鈣、有效硼的含量低于清耕區(qū)，但是總磷、全鉀、有效鉀、有效磷含量高于清耕區(qū)，自然生草區(qū)中雜草與花椒樹主要在水分和氮肥之間存在養(yǎng)分競爭，雜草對土壤磷、鉀含量有提高作用。白三葉試驗(yàn)區(qū)有機(jī)質(zhì)含量是清耕區(qū)的1.89倍，自然生草試驗(yàn)區(qū)有機(jī)質(zhì)區(qū)含量是清耕區(qū)的2.27倍，說明生草顯著提高了土壤有機(jī)質(zhì)的含量，這對改善土壤微生態(tài)有積極作用。李尚瑋[9]研究生草6年后蘋果園土壤肥力變化，結(jié)果表明相比于對照，白三葉能顯著（P<0.05）提高土壤全氮、速效氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮和有機(jī)質(zhì)的含量，自然生草對提高速效磷含量的效果最好。李承想[10]研究了種植白三葉2年的棗園土壤水分及土壤養(yǎng)分含量各指標(biāo)均高于清耕；吳佳[4]，曾艷瓊[11]研究得出林間生草可以提高土壤的水分含量，起到涵養(yǎng)水源的作用。這與本文的研究結(jié)果不一致，原因可能是本文生草時間較短（3月—8月），草種從萌芽到前期生長對土壤水肥的需求較高，且為了盡快實(shí)現(xiàn)對土壤的全覆蓋，生長過程中沒有進(jìn)行刈割處理（綠肥還田）。因此，花椒林下種草，前期可能存在與花椒根系爭肥、爭水的效應(yīng)，可采取定期刈割等方式抑制草根系功能，降低其對水肥的吸收，減小其對花椒根系的影響，同時可以增加土壤有機(jī)質(zhì)含量。

生草對土壤微生物的種類和豐度的影響也主要集中在土壤表層（0~20 cm），這與生草對土壤養(yǎng)分的影響一致。生草明顯提高了表層土壤微生物的種類，也改變了土壤微生物的種群結(jié)構(gòu)，花椒林下種植白三葉顯著降低Fusarium的豐度，說明種植白三葉對土壤中Fusarium有一定的抑制作。Fusarium是人類發(fā)現(xiàn)的最重要的植物病原菌之一，它通過浸染青花椒根系，使青花椒根系腐爛，造成青花椒整株死亡，在高溫高濕的夏季高發(fā)。白三葉區(qū)域Talaromyces在10~20 cm土層相對豐度很高，Talaromyces可以將土壤中的難溶性或不溶性磷轉(zhuǎn)化成可溶性磷，蘇輝蘭、莫雪雪[12]以廣西鐘山縣貢柑果園的土壤為試材，從貢柑果園土壤中篩選出可以將難溶性或不溶性磷轉(zhuǎn)化成可溶性磷的高效解磷菌；根據(jù)菌落形態(tài)特征、18S rDNA同源性分析，NCBI數(shù)據(jù)庫對比分析等研究，初步鑒定為黃絲曲霉。在40~60 cm土層，白三葉區(qū)域Acremonium相對豐度顯著高于清耕和自然生草區(qū)域，Acremonium對土壤中的有害菌有抑制作用，中國科學(xué)院華南植物園姚磊，徐良雄[13]等對枝頂孢屬真菌的抑菌活性及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究，研究表明枝頂孢屬真菌其固體發(fā)酵物乙醇提取物對金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑制作用。陳麗維，敖敬群[14]等從深海海底泥中分離出一株抗致病真菌的菌株，經(jīng)鑒定為Acremonium真菌。在自然生草區(qū)域，penicillium、Fusarium的相對豐度較高，penicillium為腐生菌，常見于腐爛的有機(jī)體上，也可造成柑橘、蘋果等的青霉病，對花椒樹及果實(shí)未見有害報道。因此，花椒園區(qū)生草管理中可以考慮種植白三葉。