嚴庭發(fā) 蘭淑惠 丁野 徐林

(1定安龍湖南科食用菌有限公司海南定安 571200;2中國檢驗認證集團廣西有限公司廣西南寧 530000;3中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物研究所海南海口 571101;4海南省熱帶生態(tài)循環(huán)農(nóng)業(yè)重點實驗室海南?？?571101)

靈芝是擔子菌門（Hymenomyeetes）傘菌綱（Agaricomycetes）多孔菌目（Polyporace）、靈芝 科（Ganodermataceae）靈芝屬（Ganoderma）真菌［1］。在中國傳統(tǒng)文化中，靈芝自古以來就被視為一種珍貴藥材，俗稱“瑞草”“靈芝草”“萬年蕈”等。在中國最古老的藥典《神農(nóng)本草經(jīng)》中，靈芝被列為上等藥品，有“帝王之藥”之稱［2］。靈芝之所以備受推崇經(jīng)久不衰，得益于其可食可補可藥的強大功效。臨床試驗證明，靈芝具有提高機體免疫力、抗腫瘤、保肝護肝、降血糖、改善人體睡眠質(zhì)量等功能［3-6］。靈芝的有效成分有數(shù)十種之多，包括多糖類、三萜類、腺苷類、生物堿類、多肽氨基酸類等［7］，其中多糖類和三萜類化合物與其藥理活性密切相關(guān)，是靈芝的主要活性成分［8-10］，且靈芝的三萜含量及種類已成為評價靈芝品質(zhì)的重要指標。

海南省位于中國南部，屬熱帶季風氣候區(qū)，整個島嶼全年氣候溫和，雨量充沛，得天獨厚的自然條件極為適合靈芝生長。靈芝在中國分布范圍廣泛，多分布于南方，以海南的種類最為豐富，其中不乏海南特色靈芝，如喜熱靈芝［11］等。近年來，靈芝的藥用價值在民間受到越來越多的重視，彎柄靈芝（Ganoderma flexipes）、黑靈芝（Ganoderma atrum）、無柄紫靈芝（Ganoderma mastoporum）等品種在海南民間都可作為靈芝（Ganoderma lingzhi）的代替品種使用，且售價頗高，導(dǎo)致海南地區(qū)靈芝的野生資源急劇減少［12］。由此可見，海南靈芝市場需求及其特有野生資源的保護都不能忽視。本研究對收集到的12個靈芝菌株進行引種及生理特性和三萜成分分析，以期為海南靈芝栽培及選育和特有野生靈芝資源的保育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試靈芝菌株共12個，具體信息見表1。

1.2 方法

1.2.1 靈芝菌株菌絲體生理特性分析

靈芝菌絲體的復(fù)壯及擴繁使用馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂粉20 g/L、自然pH，以121℃滅菌20 min后備用。

溫度試驗培養(yǎng)基（CPDA）：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂粉20 g/L、硫酸鎂1.5 g/L、磷酸二氫鉀3 g/L、自然pH，121℃滅菌20 min后備用。

碳源試驗培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L、供試碳源（葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、D-果糖、糊精）20 g/L、瓊脂粉20 g/L、硫酸鎂1.5 g/L、磷酸二氫鉀3 g/L、自然pH，121℃滅菌20 min后備用。

氮源試驗培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、供試氮源（蛋白胨、麥麩、尿素、牛肉膏）3 g/L、瓊脂粉20 g/L、硫酸鎂1.5 g/L、磷酸二氫鉀3 g/L、自然pH，121℃滅菌20 min后備用。

表1 參試靈芝菌株信息

pH試驗培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖分別為200、20 g/L、瓊脂粉20 g/L、硫酸鎂1.5 g/L、磷酸二氫鉀3 g/L，H2SO4（1 mol/L）、NaOH（1 mol/L），分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH 5、6、7、8、9，以121℃滅菌20 min后備用。

采用平板劃線法，每隔24 h標記一次菌落直徑，觀察菌落顏色和氣生菌絲密度，至任一菌株長滿平板后測量菌落直徑，計算菌絲生長速度（平均菌落直徑/菌絲生長天數(shù)）。每處理3個重復(fù)，除不同溫度梯度實驗外均以25℃培養(yǎng)。

1.2.2 靈芝菌株出菇情況測試

母種培養(yǎng)基為CPDA培養(yǎng)基，以121℃滅菌20 min后備用。

原種培養(yǎng)基配方為：棉籽殼84%，麩皮15%，石膏1%。栽培料配方為：棉籽殼40%，麥麩10%，木屑47%，3%熟石灰。上述培養(yǎng)基在121℃滅菌150 min后備用。

將接種后的菌包置于海南省定安縣的大棚內(nèi)進行培養(yǎng)，發(fā)菌期間環(huán)境溫度控制在25℃左右，出菇時溫度自然，環(huán)境濕度控制在65%～85%，觀察是否可以正常出菇及出菇形態(tài)。

1.2.3 不同靈芝菌株品種鑒定

采用ITS序列分析法對不同靈芝菌株進行品種鑒定［13］。方法如下：使用百泰克真菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）提取靈芝基因組DNA，選用2條特異引物ITS1（5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG）、ITS4（5’TCCTCCGCTTATTGATATGC）對各靈芝菌株基因組DNA進行聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）；通過瓊脂糖凝膠電泳檢測到目的擴增片段后，將PCR擴增產(chǎn)物送往華大基因測序；得到各靈芝菌株ITS序列后，用BLAST工具進行同源序列比對，使用統(tǒng)計軟件MegaX構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 不同靈芝菌株子實體總?cè)坪繙y定分析

1.2.4.1 標準曲線繪制

精密稱取適量齊墩果酸對照品粉末，用甲醇溶解，制成0.2 mg/mL的對照品溶液；分別精密量取對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL置于15 mL具塞試管；將試管置于真空冷凍干燥機內(nèi)并將液體抽干；精密加入新配制的香草醛冰醋酸溶液（精密稱取香草醛0.5 g，用冰醋酸溶解成10 mL的溶液即得）0.2 mL，高氯酸0.8 mL，充分搖勻；于70℃水浴15 min；取出后立即冰浴5 min，精密加入乙酸乙酯4 mL；各試管臨測定前搖勻，以相應(yīng)試劑為空白對照，在546 nm波長處測定吸光度；以吸光度為縱坐標、濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.2.4.2 總?cè)铺崛〖皺z測

（1）提取將真空冷凍干燥后的子實體研磨成粉末，精密稱取1 g粉末置于50 mL離心管中，加入25 mL乙醇，以超聲功率100 W處理55 min；過濾，濾液置于50 mL容量瓶中，共提取2次；用乙醇分次洗滌濾器和濾渣，將洗液放入同一容量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，備用。

（2）檢測精密量取上述總?cè)迫芤?.2 mL，置于15 mL具塞試管中，將試管置于真空冷凍干燥機內(nèi)并抽干液體，精密加入新配制的香草醛冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，充分搖勻，以70℃水浴15 min；取出后立即冰浴5 min，精密加入乙酸乙酯4 mL，各試管臨測定前搖勻；以相應(yīng)試劑為空白對照，在546 nm波長處測定吸光度，從標準曲線上讀出三萜溶液中齊墩果酸的含量，計算即得樣品中三萜含量。

1.2.5 不同靈芝菌株子實體三萜類化合物指紋圖譜分析

總?cè)铺崛〖皽y定方法參考專利“一種靈芝中17種三萜化合物含量的檢測方法”（專利號：CN 108181396 A）所描述的方法進行［14］，具體方案如下：將靈芝子實體研磨成粉末狀，加入乙酸乙酯（料液比為1∶20，m∶V），以60℃加熱超聲提取30 min后離心收集上清，將上清抽濾凍干后獲得濃縮物；使用色譜級甲醇將濃縮物復(fù)溶（料液比為1∶1，m∶V），用0.22μm孔徑有機相微孔濾膜將復(fù)溶液過濾；采用高效液相色譜法測定靈芝三萜類化合物指紋圖譜，流速為1.0 mL/min，檢測波長為252 nm，進樣量為10μL，柱溫為25℃，流動相系統(tǒng)為乙腈-水（含有0.01%冰醋酸），梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝菌株品種鑒定結(jié)果

將獲得的ITS序列與NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）核酸數(shù)據(jù)庫進行比對（圖1），其中供試菌株A、B、K、C、I、H、F與Gano‐derma lingzhi聚為一支；供試菌株E、G與無柄靈芝屬（Ganoderma sessile）聚為一支；供試菌株D與紫芝（Ganoderma sinense）聚為一支；供試菌株J與新日本靈芝（Ganoderma neojaponicum）聚為一支；供試菌株L與有柄樹舌（Ganodermagibbosum）聚為一支。

圖1 基于ITS序列的菌株間系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 不同靈芝菌株菌絲體生理特性

綜合評估菌絲體在平板上的生長速度、菌落形態(tài)及菌絲體疏密程度，篩選得到各靈芝菌株的最適碳源、最適氮源及最適pH值，如表3所示（p＜0.05）。

表3 各靈芝菌株的最適碳氮源和pH值

由表3可知，不同靈芝菌株的生長條件略有不同，蔗糖為供試靈芝菌株生長的最適碳源；麥麩或牛肉膏均可作為供試靈芝菌株生長的氮源，其中麥麩較為普試；供試靈芝菌株為中高溫型菌株，25～30℃較適合靈芝菌絲體生長；pH 5～7時，供試靈芝菌株菌絲體長勢較好，表明中性偏酸性的環(huán)境較適合供試靈芝菌絲體的生長。

2.3 不同靈芝菌株出菇測試結(jié)果

共栽培12個不同靈芝菌株，其中6個菌株可在海南省定安縣正常出菇，出菇形態(tài)如圖2所示。菌株K形狀圓潤，菌蓋表層集聚了噴射的孢子粉，去除孢子粉后表面光滑；菌株F可形成層狀菌蓋；菌株I分支較多，菌柄細長，無菌蓋，狀如珊瑚；菌株H菌蓋為圓形，較圓潤；菌株J菌柄細長，菌蓋偏生且較小。

圖2 供試品種子實體情況

2.4 不同靈芝菌株子實體總?cè)票壤治鼋Y(jié)果

6種待測樣品的總?cè)票壤几哂谥袊幍洌?020版）要求的0.5%，其中菌株F子實體總?cè)票壤罡?，達到1.44%（圖3）；菌株G與菌株J總?cè)票壤^低，分別為0.99%和0.92%。

圖3 供試品種子實體總?cè)票壤?/p>

2.5 不同靈芝菌株子實體三萜類化合物色譜圖譜分析結(jié)果

采用高效液相色譜法分析靈芝菌株F、G、H、I、J、K子實體三萜類化合物，得到各靈芝子實體色譜指紋圖譜，如圖4所示。除菌株J基線不穩(wěn)、后期較高外，其余各靈芝三萜類化合物液相色譜圖基線較好。各色譜峰分離也較好，滿足后續(xù)分析要求。由三萜化合物指紋圖譜（表4）相似度可知，菌株H、K、G所含有的三萜化合物相似度較高，菌株J、F所含有的三萜化合物相似度較高，菌株I所含有的三萜類化合物與其它菌株均有較大差異。

表4 各供試靈芝菌株間三萜化合物指紋圖譜相似度

圖4 靈芝子實體指紋圖譜

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

海南獨特的熱區(qū)生境適宜開展靈芝生產(chǎn)栽培。適宜海南栽培的品種對海南靈芝產(chǎn)業(yè)發(fā)展起關(guān)鍵作用。根據(jù)靈芝產(chǎn)品用途主要分為觀賞和藥用兩大類型。觀賞靈芝主要關(guān)注子實體性狀，通常造型奇特的子實體更具觀賞性。由于審美的差異性，人們對靈芝造型的喜好各有不同，本研究篩選到的珊瑚靈芝（I）形態(tài)與其他靈芝具有較大差異，且無需高二氧化碳環(huán)境誘導(dǎo)，具有一定的便捷特點。此外，觀賞靈芝可采用基于加定型模具的生長期控制法和彎曲、分割、固定、嫁接、插接、靠接等后期造型控制措施［15］來實現(xiàn)。藥用是靈芝的主要用途。隨著國家食藥監(jiān)局對靈芝既是食品又是藥品試點工作的推進，靈芝產(chǎn)業(yè)將進一步擴大，對栽培靈芝的需求將越來越大。靈芝三萜類化合物作為靈芝的主要活性物質(zhì)［16］，因具有保肝護肝、抗高血壓、抗HIV-1活性、抗氧化、抗腫瘤等作用［8，17］而一直備受關(guān)注。目前從靈芝中分離得到的三萜類化合物已達300多種［18］。有研究表明，不同品種靈芝的三萜種類和含量存在差異，而黑芝幾乎不含三萜類有效成分［19］。作為一種藥用原料，當開發(fā)生產(chǎn)傾向于保肝護肝作用的藥物或保健品等時，應(yīng)選擇三萜類含量較高的靈芝菌株［20］。本研究顯示，盆景靈芝（F）三萜類化合物達到1.44%、南韓靈芝（H）達到1.41%，可作為海南靈芝栽培的優(yōu)質(zhì)菌株。

此外，以彎柄靈芝為代表的特色靈芝資源是海南優(yōu)勢資源，應(yīng)加強該類靈芝資源的保護利用。彎柄靈芝是一類主要分布于熱帶區(qū)域、子實體菌柄細長、菌蓋較小的靈芝，因其藥用價值高，深受消費者喜愛，市場售價逐年增高。目前，該類靈芝的民間名稱還不統(tǒng)一，有待進一步規(guī)范。本研究中彎柄靈芝菌株（J）分離于竹子根部，根據(jù)形態(tài)特征和生境特點，民間命名為竹靈芝；但ITS序列比對分析表明，其與Ganoderma neojaponi‐cum序列的相似度為100%；而Cao等［1］利用形態(tài)學及分子生物學方法證實黑芝（Ganoderma atrumJ.D.Zhao 1979）、喜熱靈芝（Ganoderma cali‐dophilumJ.D.Zhao 1979）、海南靈芝（Gano‐derma hainanenseJ.D.Zhao 1979）、小馬蹄靈芝（Ganoderma parviungulatumJ.D.Zhao & X.Q.Zhang 1986）是Ganoderma flexipes的 同 物 異名［1］，因此菌株J實際上應(yīng)為Ganoderma flexi‐pes，中文名為彎柄靈芝。

3.2 結(jié)論

靈芝（K）、盆景靈芝（F）、盆景靈芝3號（G）、珊瑚靈芝（I）、南韓靈芝（H）、彎柄靈芝（J）可根據(jù)需求在海南地區(qū)栽培。盆景靈芝（F）、南韓靈芝（H）更適合于對總?cè)坪恳蟾叩撵`芝生產(chǎn)，而珊瑚靈芝（I）更適合用于制作盆景靈芝。開展栽培時，種植戶可根據(jù)各品種最適的培養(yǎng)條件，培養(yǎng)平板菌種或液體菌種。蔗糖、麥麩或牛肉膏可作為通用性菌種培養(yǎng)基配方。