孫曉飛，萬(wàn)超，宋大賀，賈赟

（1.大連海關(guān)技術(shù)中心，遼寧大連 116001）（2.大連海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心，遼寧大連 116001）

鱈魚(yú)屬脊椎動(dòng)物門(mén)（Vertebrata）、脊椎動(dòng)物亞門(mén)（Vertebrata）、真骨魚(yú)綱（Teleostei）、鱈形目（Gadiformes）。鱈魚(yú)多是生活在海洋底層和深海中下層的冷水性魚(yú)類，廣泛分布于世界的各大洋，是價(jià)值極高的世界級(jí)重要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，其肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富；胰腺含有大量的胰島素，可以從 1 kg胰腺中提取12000 IU胰島素；鱈魚(yú)的肝臟可用于提取魚(yú)肝油（含油量 20%~40%）[1,2]。因鱈魚(yú)具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)不斷出現(xiàn)以假亂真、以次充好事件，原質(zhì)檢總局曾通報(bào)不法企業(yè)以鯰魚(yú)內(nèi)臟冒充鱈魚(yú)內(nèi)臟出口。針對(duì)這類摻假造假的判斷，傳統(tǒng)的形態(tài)特征鑒別方法已經(jīng)不能滿足，必須基于更精準(zhǔn)的物種鑒定技術(shù)[3,4]。由此可見(jiàn)，為了更加有效地確保出口鱈魚(yú)產(chǎn)品質(zhì)量，防止欺詐，建立一種可以對(duì)鱈魚(yú)DNA進(jìn)行特異性檢測(cè)的準(zhǔn)確性高、實(shí)用性強(qiáng)的方法，從分子水平上對(duì)鱈魚(yú)樣品進(jìn)行特異性檢測(cè)鑒定，都是十分亟需和必要的。目前的鱈魚(yú)PCR檢測(cè)文章是針對(duì)鱈屬與其他魚(yú)類目、屬的區(qū)別，并未區(qū)分鱈形目?jī)?nèi)不同屬、科的魚(yú)類，在鱈科中不同的鱈魚(yú)也存在著差異。本文中太平洋鱈魚(yú)以及大西洋鱈魚(yú)無(wú)論從經(jīng)濟(jì)價(jià)值還是營(yíng)養(yǎng)價(jià)值都要高于黑線鱈魚(yú)和藍(lán)鱈魚(yú)，按照常規(guī)鱈魚(yú)的檢測(cè)方法是無(wú)法進(jìn)行區(qū)分的，為了避免了一些不法分子混淆概念，用價(jià)格低廉的鱈魚(yú)替代價(jià)格昂貴的真鱈，特選取4種經(jīng)濟(jì)鱈魚(yú)，太平洋鱈、大西洋鱈、狹鱈、綠青鱈進(jìn)行檢測(cè)，為保障食品安全提供技術(shù)保障。

多重PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上改進(jìn)并發(fā)展起來(lái)的一種新型PCR擴(kuò)增技術(shù)，是在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增多條目的DNA片段的方法，采用這一技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)物種[5-8]。突觸素樣蛋白pantophysin（Pan I）是公認(rèn)相對(duì)保守的DNA序列，動(dòng)物分類學(xué)和生態(tài)學(xué)中得到了廣泛應(yīng)用[9-12]。由于多重PCR同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的基因，具有節(jié)省時(shí)間、降低成本、提高效率的優(yōu)點(diǎn)，特別是節(jié)省珍貴的實(shí)驗(yàn)樣品，所以一經(jīng)提出，即得到眾多研究者的青睞，并且發(fā)展迅速，在生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域得以應(yīng)用。本文選取 4種經(jīng)濟(jì)鱈魚(yú)，太平洋鱈、大西洋鱈、狹鱈、綠青鱈，通過(guò)設(shè)計(jì)的特異性引物，可對(duì)鱈魚(yú)種內(nèi)、種間進(jìn)行分析，為鱈魚(yú)的物種鑒定提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 原料

1.1.1 試劑及耗材

海洋動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒（DP324）：天根生物公司；Premix Ex Taq：TaKaRa公司；瓊脂糖：北京沃比森科技有限公司；引物：上海生工生物公司；廣泛收集魚(yú)類樣品：太平洋鱈魚(yú)、大西洋鱈魚(yú)、狹鱈魚(yú)、綠青鱈魚(yú)、黑線鱈魚(yú)、南藍(lán)鱈魚(yú)、藍(lán)鱈魚(yú)、紅魚(yú)、六線魚(yú)、黃花魚(yú)、鱸魚(yú)、藍(lán)鰭紅娘魚(yú)、大西洋藍(lán)金槍、牙鲆、多寶魚(yú)、龍利魚(yú)、大馬哈魚(yú)、大西洋鮭魚(yú)、太平洋鯡魚(yú)、小體鱘魚(yú)以及歐鰉等來(lái)自大連各水產(chǎn)市場(chǎng)及中國(guó)水產(chǎn)研究院。

1.1.2 儀器設(shè)備

熒光定量PCR儀：美國(guó)Bio-Rad公司，凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)Bio-Rad公司，超微量分光光度計(jì)：Nano Drop 2000；梯度PCR儀：德國(guó)eppendorf公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取

采用海洋動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取100 mg肉中的總DNA，保存于-20 ℃冰箱備用。并測(cè)定OD260 nm值，計(jì)算DNA質(zhì)量濃度。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光PCR引物設(shè)計(jì)

通過(guò)大西洋鱈、綠青鱈、太平洋鱈和狹鱈比對(duì)分析，在序列的差異處設(shè)計(jì)特異性引物，序列見(jiàn)表1。將設(shè)計(jì)好的引物在NCBI進(jìn)行序列分析，利用primer blast程序選擇nr數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行特異性分析：結(jié)果表明，只有大西洋鱈、綠青鱈、太平洋鱈和狹鱈的物種能和所設(shè)計(jì)的引物完全互補(bǔ)結(jié)合，沒(méi)有檢驗(yàn)到完全匹配的其它物種，證明引物的特異性較好。

表1 特異性引物序列Table 1 Specific primer sequence

1.2.3 引物的特異性

為檢測(cè)大西洋鱈、綠青鱈、太平洋鱈和狹鱈PCR法的單項(xiàng)引物的特異性，利用上述引物對(duì)四種鱈魚(yú)及其他魚(yú)類樣品 DNA分別進(jìn)行實(shí)時(shí) PCR擴(kuò)增。熒光PCR反應(yīng)體系為50 μL，反應(yīng)體系見(jiàn)表2。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s、60 ℃退火延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠110 V電泳，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。

表2 PCR反應(yīng)體系Table 2 PCR reaction system

1.2.4 多重PCR方法

1.2.4.1 二重PCR

將不同鱈魚(yú)模板兩兩混合（太平洋鱈+綠青鱈；太平洋鱈+大西洋鱈；太平洋鱈+狹鱈；綠青鱈+大西洋鱈；綠青鱈+狹鱈；狹鱈+大西洋鱈），PCR產(chǎn)物為兩種鱈魚(yú)Pan I基因片段的特異性引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系及條件見(jiàn)3.2.2。

1.2.4.2 三重PCR

將不同鱈魚(yú)模板三種混合（大西洋鱈+綠青鱈+太平洋鱈、大西洋鱈+太平洋鱈+狹鱈、太平洋鱈+狹鱈+綠青鱈），PCR產(chǎn)物為三種鱈魚(yú)Pan I基因片段的特異性引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系及條件見(jiàn)3.2.2。

1.2.4.3 四重PCR

將四種鱈魚(yú)模版進(jìn)行混合，PCR產(chǎn)物為四種鱈魚(yú)Pan I基因片段的特異性引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系及條件見(jiàn)3.2.2。

1.2.5 靈敏度的檢測(cè)

為檢測(cè)鱈魚(yú)多重 PCR法的靈敏度，將四種鱈魚(yú)DNA梯度稀釋，進(jìn)行DNA濃度靈敏度實(shí)驗(yàn)，制備成100 ng/μL、20 ng/μL、4 ng/μL、0.8 ng/μL 4 個(gè)濃度梯度的混合樣品（起始濃度100 ng/μL含每種鱈魚(yú)樣品25 ng/μL），進(jìn)行靈敏度實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1~4。

圖1 大西洋鱈單對(duì)引物PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The PCR amplification results of a single pair of primers for Atlantic cod

圖2 綠青鱈單對(duì)引物PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of a single pair of primers for Alaska pollock

圖3 太平洋鱈單對(duì)引物PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplification results of a single pair of primers for Pacific hake

圖4 狹鱈單對(duì)引物PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Alaska pollack single-pair primer PCR amplification results

結(jié)果顯示，四種不同鱈魚(yú)PCR均擴(kuò)增出相應(yīng)特異性條帶。即對(duì)應(yīng)的大西洋鱈、綠青鱈、太平洋鱈和狹鱈四種鱈魚(yú)分別出現(xiàn)597、392、266、527 bp大小的清晰條帶。說(shuō)明4對(duì)引物設(shè)計(jì)滿足檢測(cè)需求。一般認(rèn)為，在一定范圍內(nèi)，引物序列越長(zhǎng)，PCR反應(yīng)的特異性越高、靈敏度越低。因此，在方法設(shè)計(jì)中，選擇合適長(zhǎng)度的多重PCR引物序列，從而獲得最優(yōu)化的檢測(cè)靈敏度、特異性及各目標(biāo)片段擴(kuò)增均一性將尤為關(guān)鍵。對(duì)此，本研究基于相同的特異性位點(diǎn)設(shè)計(jì)了長(zhǎng)度不同的兩套引物，試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)把引物片段長(zhǎng)度降低到18~24 bp時(shí)，在優(yōu)化的反應(yīng)條件下，對(duì)綠青鱈DNA及其兩兩混合物的檢測(cè)表現(xiàn)出良好的特異性與靈敏度。使用長(zhǎng)度為28 bp的引物，對(duì)目標(biāo)綠青鱈的檢測(cè)表現(xiàn)出擴(kuò)增效率的差異，綠青鱈成分難以被檢出。

2.2 特異性檢測(cè)結(jié)果

以四對(duì)引物混合為PCR引物，四種不同鱈魚(yú)PCR均擴(kuò)增出相應(yīng)特異性條帶，并且只有該物種對(duì)應(yīng)的一條條帶。即對(duì)應(yīng)的大西洋鱈、綠青鱈、太平洋鱈和狹鱈四種鱈魚(yú)分別出現(xiàn)597、392、266、527 bp大小的清晰條帶，以其他魚(yú)類為模板作為陰性對(duì)照無(wú)條帶，見(jiàn)圖5。

圖5 大西洋鱈、綠青鱈、太平洋鱈和狹鱈引物的特異性Fig.5 The specificity of primers for Atlantic cod, Alaska Pollock,Pacific Hake and Alaska pollack

影響多重PCR反應(yīng)效果的因素很多，其中引物設(shè)計(jì)直接影響PCR擴(kuò)增的特異性與靈敏度；另外，PCR體系的優(yōu)化可以使多重PCR得到最佳效果。通過(guò)檢測(cè)結(jié)果可以看出說(shuō)明4種引物之間相互不干擾，具有顯著特異性。

2.3 PCR檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 雙重PCR檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)多次調(diào)整反應(yīng)條件，優(yōu)化反應(yīng)體系，以2對(duì)引物混合為PCR引物，對(duì)應(yīng)的2種不同鱈魚(yú)DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。均擴(kuò)增出相應(yīng)特異性條帶，陰性無(wú)條帶。見(jiàn)圖6。

圖6 兩重PCR結(jié)果Fig.6 Results of double PCR

2.3.2 三重PCR結(jié)果

經(jīng)多次調(diào)整反應(yīng)條件，優(yōu)化反應(yīng)體系，以3對(duì)引物混合為PCR引物，對(duì)應(yīng)的3種不同鱈魚(yú)DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。均擴(kuò)增出相應(yīng)特異性條帶，陰性無(wú)條帶。見(jiàn)圖7。

圖7 三重PCR結(jié)果Fig.7 Triple PCR results

2.3.3 四重PCR結(jié)果

經(jīng)多次調(diào)整反應(yīng)條件，優(yōu)化反應(yīng)體系，以四對(duì)引物混合為PCR引物，對(duì)應(yīng)的4種不同鱈魚(yú)DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。均擴(kuò)增出相應(yīng)特異性條帶，陰性無(wú)條帶。見(jiàn)圖8。

圖8 四重PCR結(jié)果Fig.8 Quadruple PCR results

多重PCR的原理是在同一PCR反應(yīng)體系里加上兩對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出2個(gè)以上核酸片段的PCR反應(yīng)。以多重PCR為基礎(chǔ)的成分鑒別技術(shù)具有儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、檢測(cè)通量高、操作方便且檢測(cè)費(fèi)用低的優(yōu)點(diǎn)，但由于需要在同一PCR體系里加入多對(duì)特異性物，復(fù)雜的PCR體系易造成引物之間相互干擾、靈敏度降低以及對(duì)序列擴(kuò)增效率差異，從而使得相關(guān)方法的使用和標(biāo)準(zhǔn)化受到極大限制。有研究報(bào)道，多重PCR多采用了正向引物通用、反向引物特異的UP-M-PCR設(shè)計(jì)策略，即應(yīng)用包含1條上游或下游引物通用引物，其他3~4條差異引物的原則，最大限度地避免引物數(shù)量過(guò)多造成的交叉干擾[13-15]。目前，通用引物多重PCR方法對(duì)食品中大腸桿菌、單增李斯特菌、耶爾森氏菌、沙門(mén)氏菌及水中脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇B組病毒和?？刹《镜饶c道病毒的檢測(cè)已有報(bào)道[16-20]。但由于鱈魚(yú)種屬之間基因序列差異較小，差異位點(diǎn)挑選困難，梯度差異合適的序列更少，以通用引物法很難找到合適的多重引物，因此本文設(shè)計(jì)多條配對(duì)引物法進(jìn)行多重PCR檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，引物之間干擾較小，基本不影響PCR擴(kuò)增效率。

2.3.4 四重PCR靈敏度結(jié)果

四種鱈魚(yú)DNA梯度稀釋，以100 ng/μL、20 ng/μL、4 ng/μL、0.8 ng/μL，4個(gè)濃度梯度的混合樣品 DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，100 ng/μL、20 ng/μL濃度有明顯特異性條帶出現(xiàn)，4 ng/μL濃度出現(xiàn)條帶丟失現(xiàn)象，0.8 ng/μL無(wú)明顯條帶出現(xiàn)，見(jiàn)圖9。

圖9 四重PCR靈敏度結(jié)果Fig.9 Four-fold PCR sensitivity results

多重PCR檢測(cè)結(jié)果表明，大西洋鱈、綠青鱈、太平洋鱈和狹鱈四種鱈魚(yú)分別出現(xiàn)597、392、266、527 bp大小的清晰條帶。該方法具有較高靈敏度，低至4 ng/μL混合樣品仍可檢出。

本研究主要針對(duì)鱈魚(yú)市場(chǎng)以次充好現(xiàn)狀進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，具有較顯著的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價(jià)值；萬(wàn)超建立的TaqMan熒光PCR方法可以快速檢測(cè)太平洋鱈魚(yú)源性成分，但該方法僅是針對(duì)一種鱈魚(yú)的鑒定[21]；林霖等研究設(shè)計(jì)了可用于細(xì)鱗壯鱈DNA成分檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光PCR法[22]；李富威等建立了鱈魚(yú)成分的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，該方法可作為鱈魚(yú)成分鑒定的檢測(cè)方法，但不能具體分析鱈魚(yú)的種[23]。本研究中可針對(duì)四種鱈魚(yú)進(jìn)行成分鑒定，相比于中國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫標(biāo)準(zhǔn)《SN/T 3589.7-2013》并不能對(duì)不同鱈魚(yú)成分進(jìn)行鑒別[24]，本研究具有多重成分檢測(cè)、檢測(cè)成本節(jié)省、檢測(cè)通量較高等優(yōu)點(diǎn)，更適合于對(duì)進(jìn)出口鱈魚(yú)中以次充好、低價(jià)鱈魚(yú)冒充高價(jià)鱈魚(yú)銷售的鑒別篩選。

3 結(jié)論

考慮到鱈魚(yú)以次充好銷售，往往是以價(jià)格較為低廉的藍(lán)鱈、青鱈冒充價(jià)格相對(duì)較高的真鱈，大西洋鱈和太平洋鱈出售，因此在同一多重PCR反應(yīng)體系中針對(duì)多種鱈魚(yú)同時(shí)鑒定方面，本研究重點(diǎn)考察了目標(biāo)鱈魚(yú)兩兩混合時(shí)的檢測(cè)特異性。進(jìn)一步的試驗(yàn)表明，本文建立的多重PCR技術(shù)對(duì)于同時(shí)鑒定目標(biāo)鱈魚(yú)中的3或4種也具備良好的效果，且具有顯著特異性及較高靈敏度，低至4 ng/μL混合樣品仍可檢出。