王宇，張譯豐，沈玉棟，陳子鍵，劉佳，蔡偉誼，曾羲，徐振林

（1.廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510640）（2.廣州市食品檢驗(yàn)所，廣東廣州 511400）

殺螟硫磷是一種中等毒性的有機(jī)磷殺蟲劑，適用于多種作物的蟲害防治。殺螟硫磷會(huì)抑制乙酰膽堿酯酶活性，使得神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿無法正常分解，從而阻斷正常的神經(jīng)傳遞引起中毒反應(yīng)[1,2]。不合理施用有機(jī)磷農(nóng)藥會(huì)導(dǎo)致人體中毒，還會(huì)污染水體和土壤，對其他動(dòng)物也會(huì)產(chǎn)生一定的毒害作用[3,4]。目前我國對食品中殺螟硫磷最大殘留限量（MRL）規(guī)定與一些發(fā)達(dá)國家地區(qū)仍有較大差距。以蔬菜水果類為例，我國對果蔬中殺螟硫磷的MRL規(guī)定均為0.5 mg/kg（除結(jié)球甘藍(lán)為0.2 mg/kg外）；日本對不同果蔬中的殺螟硫磷MRL從0.01~10 mg/kg不等，對于未制定MRL的品種則采用0.01 mg/kg的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)；而歐盟對果蔬中的殺螟硫磷MRL規(guī)定則均為嚴(yán)格的0.01或0.02 mg/kg。雖然在一些果蔬中檢出殺螟硫磷的報(bào)導(dǎo)中未發(fā)現(xiàn)超標(biāo)情況[5,6]，但是與國際上一些更為嚴(yán)格的食品標(biāo)準(zhǔn)相比仍然容易出現(xiàn)超標(biāo)現(xiàn)象[7]。因此開發(fā)高靈敏度的殺螟硫磷檢測方法對于我國進(jìn)出口貿(mào)易以及相關(guān)食品標(biāo)準(zhǔn)的完善有重要意義。

目前檢測殺螟硫磷的方法有儀器分析法[8]、表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)[9,10]、電化學(xué)檢測法[11,12]、熒光檢測法[13]、免疫分析法等。其中免疫分析法是儀器分析分析方法的重要補(bǔ)充，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測時(shí)間短、易操作等優(yōu)點(diǎn)，更適用于樣品的大批量快速篩查[14,15]。目前已報(bào)道的殺螟硫磷免疫分析方法大多數(shù)是基于多克隆抗體或單克隆抗體[16-18]，其制備的周期較長，篩選過程也相對繁瑣，成本較高[19]。制備基因工程抗體只需一次成功的動(dòng)物免疫即可利用微生物對抗體基因進(jìn)行高通量的篩選和大規(guī)模的表達(dá)，其制備的時(shí)間及成本都將大大降低[20]。Luo等通過核糖體展示技術(shù)得到親和力在109~1010L/mol之間的三株抗殺螟硫磷的單鏈抗體（scFv），并應(yīng)用到大米、黃瓜樣品的檢測中[21]。

駱駝科動(dòng)物或鯊魚科動(dòng)物體內(nèi)含有天然缺失輕鏈的重鏈抗體亞型，通過基因工程手段制備的可變區(qū)重鏈抗體（VHH）即為納米抗體（Nbs）[22,23]。與傳統(tǒng)抗體衍生而來的基因工程抗體如 scFv和抗原結(jié)合片段（Fab）相比，Nbs由于無需重鏈和輕鏈的配對而更加容易可溶性表達(dá)且不易丟失活性[24,25]。本研究在實(shí)驗(yàn)室前期制備殺螟硫磷半抗原及人工抗原的基礎(chǔ)上[26]，用免疫后的羊駝淋巴細(xì)胞構(gòu)建了抗殺螟硫磷納米抗體基因文庫。采用噬菌體展示技術(shù)淘篩得到特異性識(shí)別殺螟硫磷的納米抗體，并通過生物素化后建立了基于生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法，用于對殺螟硫磷的快速靈敏檢測。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

殺螟硫磷免疫原和檢測抗原由本實(shí)驗(yàn)室前期工作制備；pINQ載體和攜帶生物素連接酶基因（BirA）的 PCY216載體，由烏拉圭共和國大學(xué) González-Sapienza Gualberto教授饋贈(zèng)；PCR引物，廣州睿博生物科技股份有限公司合成；殺螟硫磷標(biāo)準(zhǔn)品，壇墨質(zhì)檢科技股有限公司；淋巴胞分離液、生物素及辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記鏈霉親和素（SA-HRP），北京索萊寶科技有限公司；總RNA提取試劑盒，廣州捷倍斯生物科技有限公司；DNA回收試劑盒及質(zhì)粒小提試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及T4 DNA連接酶，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；SfiI限制性核酸內(nèi)切酶及M13KO7輔助噬菌體，NEB（北京）有限公司；rabbit-antiVHH-HRP（HRP標(biāo)記的抗駝科動(dòng)物VHH兔多抗），Genscript公司；牛血清白蛋白（BSA），美國Sigma公司；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），上海源葉生物科技有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

蛋白純化儀（AKTATM Pure），美國GE公司；自動(dòng)洗板機(jī)（DEM-3型），北京拓普分析儀器有限責(zé)任公司；PCR擴(kuò)增儀（DNA Engine），美國BIORAD公司；凝膠成像系統(tǒng)（GDS7500型），美國BIORAD公司；電轉(zhuǎn)儀（Gene Pulser Xcell），美國BIORAD公司；生化培養(yǎng)箱（LRH-150A），廣東省醫(yī)療器械廠；酶標(biāo)儀（Multiskan MK3），美國Thermo公司；超微量分光光度計(jì)（Nanodrop 2000C），美國Thermo公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物免疫

選用約3歲的健康雄性羊駝，在其頸背部皮下注射免疫。首次免疫用1 mg免疫原與弗氏完全佐劑混合注射；后續(xù)每兩周一次加強(qiáng)免疫，使用0.5 mg免疫原與弗氏非完全佐劑混合注射，一共進(jìn)行四次免疫。每次加強(qiáng)免疫一周后采集1 mL羊駝血清采用間接酶聯(lián)酶聯(lián)免疫分析（ic-ELISA）檢測血清免疫應(yīng)答情況。

1.3.2 硫磷納米抗體基因文庫制備

采集第三、四次免疫一周后的羊駝外周血，用商業(yè)試劑盒分離淋巴細(xì)胞、提取總RNA、合成cDNA。以cDNA為模板，用引物CALL001（GTCCTGGCTG CTCTTCTACAAGG）和CALL002（GGTACGTGCTG TTGAACTGTTCC）進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增羊駝免疫球蛋白G（IgGs）基因，切膠回收750 bp條帶作為第二次 PCR模板，用引物 F-SfiI（CATGCCATGACTGT GGCCCAGGCGGCCCAGKTGCAGCTCGTGGAGT C）和R1-Sfi（ICATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTG GCC ATGGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG）擴(kuò)增IgG2-VHH基因，用引物F-SfiI和R2-SfiI （CATGCCATGA CTCGCGGCCGGCCTGGCCG TCTTGTGGTTTTGGT GTCTTGGG）擴(kuò)增 IgG3-VHH基因。用限制性核酸內(nèi)切酶SfiI酶切pComb3Xss噬菌粒載體和VHH基因，T4連接酶連接VHH基因和pComb3X載體片段，將酶連產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化至E.coliTG1得到納米抗體基因文庫，經(jīng)輔助噬菌體M13KO7救援后得到噬菌體展示文庫，用于納米抗體文庫陽性克隆淘篩。

1.3.3 殺螟硫磷納米抗體淘篩

殺螟硫磷納米抗體基因文庫采取“同時(shí)競爭”策略[27]進(jìn)行四輪淘篩。殺螟硫磷抗原用碳酸緩沖液稀釋（1000、500、250、125 ng/mL），在酶標(biāo)板中（每孔0.1 mL）4 ℃包被過夜。用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗去游離抗原，用3% BSA-PBS封閉1 h。噬菌體展示庫中添加 1% BSA（W/V），轉(zhuǎn)移到固定化抗原的微孔中（每孔0.1 mL），37 ℃孵育1 h，用PBS-0.05%吐溫20（PBST）洗去游離的噬菌體。每孔加入0.1 mL甘氨酸-鹽酸（0.1 mol/L，pH 2.2），37 ℃孵育10 min后，收集洗脫液到離心管中，加入1 mol/L Tris溶液中和，添加殺螟硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液至目標(biāo)濃度（500、100、20、4 ng/mL）后重新分配到新的微孔中（每孔0.1 mL）競爭反應(yīng) 1 h，收集微孔中液體即為輸出噬菌體（output）。用一半的 output噬菌體侵染E.coliTG1擴(kuò)增噬菌體用于下一輪淘篩；另外一半output噬菌體取10 μL侵染E.coliTG1并涂布氨芐西林平板測滴度，剩余噬菌體保存在-20 ℃。從第三、四輪的output滴度平板中挑取單菌落用異丙基-β-d-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)，通過 ic-ELISA檢測菌液上清。選取藥物空白吸光值（OD450nm）大于0.5，且殺螟硫磷抑制率（100 ng/mL）超過 50%的候選克隆進(jìn)行基因測序。

1.3.4 殺螟硫磷納米抗體的制備及定向生物素化

從E.coliTG1中提取pComb3X-sm6表達(dá)載體作為模板，以F-SfiI和R1-SfiI為引物PCR擴(kuò)增sm6-SfiI基因。擴(kuò)增得到的sm6-SfiI基因和pINQ載體分別用SfiI限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，T4連接酶進(jìn)行連接，得到pINQ-sm6表達(dá)載體。將pComb3X-sm6表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到E.coliBL21內(nèi)，在氨芐西林培養(yǎng)基（LB-Amp）中培養(yǎng)至對數(shù)期，加入IPTG（1 mmol/L）誘導(dǎo)表達(dá)過夜；將pINQ-sm6表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到含有攜帶BirA基因的PCY216載體的E.coliBL21內(nèi)，在含有卡那霉素、氯霉素、阿拉伯糖和生物素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，加入IPTG（3 μmol/L）誘導(dǎo)表達(dá)過夜[27]。誘導(dǎo)表達(dá)后離心收集細(xì)胞，用PBS分散細(xì)胞后用高壓破碎儀破碎細(xì)胞。由 pComb3X表達(dá)的 Nbsm6可直接用Ni-NTA純化；由pINQ表達(dá)的抗體37 ℃震蕩2 h進(jìn)行生物素化后，用 Ni-NTA純化生物素化納米抗體（Nbsm6-bt）。

1.3.5 納米抗體生物素化前后 ic-ELISA靈敏度比較

將純化得到的殺螟硫磷納米抗體及生物素化納米抗體用于ELISA方法建立，具體步驟如下：將殺螟硫磷檢測抗原用碳酸緩沖液稀釋后加入酶標(biāo)板中（100 μL每孔），4 ℃孵育過夜，用PBST洗板后用蛋白封閉液封閉。將殺螟硫磷納米抗體和生物素化納米抗體用PBS稀釋至工作濃度，并將50 μL抗體工作溶液與50 μL不同濃度殺螟硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液在微孔中混合（n=3），室溫孵育30 min，然后洗板5次。用PBST稀釋rabbit-antiVHH-HRP二抗以及SA-HRP，分別加入孵育殺螟硫磷納米抗體及生物素化納米抗體的微孔中（100 μL每孔），37 ℃孵育30 min，洗板5次。加入四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色液，37 ℃孵育10 min，加入10%硫酸（V/V）終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測450 nm吸光值（OD450nm）?？乖贵w最佳工作濃度通過棋盤滴定法測定，在優(yōu)化的抗原、抗體濃度下比較兩種抗體ELISA的IC50。

1.3.6 方法特異性

采用 ic-ELISA分別繪制殺螟硫磷結(jié)構(gòu)類似物的標(biāo)準(zhǔn)曲線（甲基對硫磷,對硫磷，毒死蜱，喹硫磷，甲基嘧啶磷，馬拉硫磷，2-硝基甲苯，3-甲基-4-硝基苯酚），得到每種結(jié)構(gòu)類似物 IC50值，通過式（1）計(jì)算各結(jié)構(gòu)類似物與抗殺螟硫磷納米抗體的交叉反應(yīng)率，以評價(jià)其特異性。

1.3.7 實(shí)際樣品檢測

樣品前處理方法參考GB 23200.113-2018進(jìn)行：白菜、生菜去除根部，橘子去柄后，分別打成勻漿，準(zhǔn)確稱取10 g樣品于50 mL離心管，加入10 mL乙腈、4 g硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸氫二鈉以及1顆陶瓷均質(zhì)子，震蕩1 min后4200 r/min離心5 min。吸取6 mL上清液到15 mL塑料離心管中，加入885 mg硫酸鎂、150 mg乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（PSA）及15~45 mg石墨化炭黑（GCB），渦旋混勻1 min，4200 r/min離心5 min。凈化后的樣品用PBS稀釋后直接用于ic-ELISA檢測。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

免疫進(jìn)程中羊駝血清抑制率通過式（2）計(jì)算。殺螟硫磷抑制曲線通過origin軟件擬合：以藥物濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的值（B）與藥物空白吸光值（B0）的比值（B/B0）為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖，通過Logistics函數(shù)擬合抑制曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊駝免疫及納米抗體基因文庫構(gòu)建

如圖1所示，殺螟硫磷半抗原結(jié)構(gòu)由實(shí)驗(yàn)室前期工作合成[26]，其結(jié)構(gòu)如（a，左）所示。半抗原與EDC、NHS在N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中形成活潑酯（a，右），將活化后的半抗原與乳鐵蛋白（LF）在碳酸緩沖液（CB）體系中偶聯(lián)，合成免疫原（b）用于羊駝免疫。羊駝免疫的進(jìn)程中，隨著免疫次數(shù)的增加，血清效價(jià)的抑制率逐漸提高，第三、四次免疫效果基本穩(wěn)定，血清在1:8000倍稀釋，100 ng/mL殺螟硫磷下抑制率在 83%左右（c）。因此選擇第三第四次免疫的羊駝外周血進(jìn)行淋巴細(xì)胞分離和基因文庫構(gòu)建。用pComb3X-VHH表達(dá)載體分多次電擊轉(zhuǎn)化合計(jì)0.5 mL的E.coliTG1，通過平板計(jì)數(shù)算得基因文庫的庫容量為107cfu數(shù)量級；隨機(jī)挑選48個(gè)克隆測序，未發(fā)現(xiàn)重復(fù)序列，說明所得納米抗體基因文庫的多樣性良好。經(jīng)輔助噬菌體救援后，所得噬菌體文庫滴度為 1012pfu/mL。

圖1 人工抗原制備及羊駝免疫進(jìn)程中血清效價(jià)和抑制率變化Fig.1 Preparation of artificial antigen and changes of serum titer and inhibition rate during immunization in alpaca

2.2 殺螟硫磷納米抗體的淘選

采用固相吸附法對噬菌體文庫進(jìn)行4輪淘選。淘選原理為：噬菌體展示庫中具有抗原結(jié)合活性的克隆先與固定化抗原充分結(jié)合，然后洗滌微孔棄去非特異性的克隆或結(jié)合力較弱的克??；用酸性洗脫液使陽性克隆脫離固定化的抗原并及時(shí)中和洗脫液酸洗，以免噬菌體因衣殼蛋白過度變性而喪失侵染能力；然后往中和的洗脫液中添加殺螟硫磷，再重新投入固定化抗原微孔中，使游離的殺螟硫磷和固定化抗原同時(shí)競爭抗體結(jié)合位點(diǎn)，抑制率較低的克隆傾向于與固定化抗原結(jié)合，抑制率較高的克隆則主要在液相[27]。

每次投入的噬菌體滴度均為1012pfu/mL，第一、二輪淘篩得到的output噬菌體滴度為105pfu/mL，第三、四輪淘篩得到的噬菌體滴度為106pfu/mL，說明噬菌體文庫在第三、四輪發(fā)生了富集。通過ic-ELISA檢測96個(gè)隨機(jī)克隆表達(dá)的蛋白活性，結(jié)果有40個(gè)克隆符合1.33所述候選克隆條件。經(jīng)過基因測序40個(gè)陽性克隆可劃分為9種不同的納米抗體序列，分別編號(hào)為 Nbsm1~Nbsm9，將 9種陽性克隆轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中表達(dá)納米抗體，用ic-ELISA繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，Nbsm6的IC50值最?。▓D2），用于后續(xù)殺螟硫磷分析方法研究。

圖2 （a）納米抗體淘篩原理；（b）淘篩所得納米抗體靈敏度對比；（c）Nbsm6氨基酸序列（VHH部分）Fig.2 (a)Principle of Nbs panning; (b) Comparison of sensitivity of obtained Nbs; (c) Amino acid sequence of Nbsm6 (VHH fragment)

2.3 定向生物素化納米抗體制備及 ic-ELISA優(yōu)化及靈敏度對比

生物素-親和素系統(tǒng)是免疫分析法常用的信號(hào)放大技術(shù)。生物素與鏈霉親和素之間的特異性結(jié)合親和力可達(dá)到1015L/mol[28]，遠(yuǎn)高于酶標(biāo)二抗與抗體的親和力，利用SA-HRP代替酶標(biāo)二抗可以提高抗體效價(jià)、從而提高靈敏度。制備生物素化抗體的一般是通過NHS活化的生物素與抗體偶聯(lián)，這種化學(xué)偶聯(lián)方式具有一定的隨機(jī)性，批次差異較大，如果生物素化位點(diǎn)在抗原抗體結(jié)合區(qū)還可能會(huì)導(dǎo)致抗體的活性下降[29,30]。因此本研究利用pINQ載體在Nb中引入一種由15個(gè)氨基酸殘基組成的Avi短肽標(biāo)簽。在生物素連接酶的催化下，Avi標(biāo)簽的賴氨酸殘基能夠與生物素連接酶催化的生物素化反應(yīng)條件溫和、專一性高，且可以自主設(shè)計(jì)生物素化位點(diǎn)，能盡量降低對抗體天然構(gòu)像產(chǎn)生的影響[31]。

兩種載體表達(dá)的納米抗體經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證（圖3），Nbsm6分子量大小為18.6 ku，Nbsm6-bt分子量大小為19.5 ku。兩種納米抗體分子量的差異主要是由于兩種載體的融合標(biāo)簽片段不同。由于納米抗體表達(dá)后被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞周質(zhì)，而生物素連接酶在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，因此需要將細(xì)胞破碎，使納米抗體與生物素連接酶接觸，才能保證生物素化順利完成。

通過棋盤滴定法優(yōu)化Nbsm6和Nbsm6-bt的抗原抗體工作濃度。經(jīng)過優(yōu)化，兩種抗體均在500 ng/mL抗原濃度下半抑制濃度（IC50）值最小，其中 Nbsm6的工作濃度為 50 ng/mL，Nbsm6-bt工作濃度為 25 ng/mL，利用定點(diǎn)生物素化納米抗體與鏈霉親和素-HRP的信號(hào)放大策略后，在相同的抗原濃度條件下Nb工作濃度降低一倍。在優(yōu)化后的抗原抗體工作濃度下建立兩種抗體的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3），其中Nbsm6的IC50為4.0 ng/mL，與此前的表征結(jié)果基本吻合，在誤差范圍內(nèi)，檢出限（IC10）為0.8 ng/mL，線性范圍為1.5~10.9 ng/mL；Nbsm6-bt的IC50為2.1 ng/mL，檢出限為0.3 ng/mL線性范圍為0.6~6.9 ng/mL，運(yùn)用信號(hào)放大策略的ELISA方法靈敏度約提升為原來的2倍。

圖3 定向生物素化殺螟硫磷納米抗體制備及表征Fig.3 Preparation and characterization of oriented biotinylation anti-fenitrothion Nbs

本研究建立的基于定向生物素化納米抗體的ELISA方法與已有報(bào)導(dǎo)的基于單克隆抗體或多克隆的抗體ELISA方法相比具有更高的靈敏度[18,32,33]，與已報(bào)導(dǎo)的殺螟硫磷scFv靈敏度接近[21]。

2.4 方法特異性

用ic-ELISA鑒定Nbsm6-bt對幾種結(jié)構(gòu)類似物的IC50值，并計(jì)算與殺螟硫磷的交叉反應(yīng)率。如表1所示，可能由于殺螟硫磷與甲基對硫磷架構(gòu)極其相似，只有苯環(huán)上一個(gè)甲基的差別，因此甲基對硫磷有較高的交叉反應(yīng)率，為 19.7%；對硫磷的交叉反應(yīng)率為2.0%，其余結(jié)構(gòu)類似物幾乎沒有交叉反應(yīng)。已有報(bào)導(dǎo)的殺螟硫磷單克隆抗體多為廣譜抗體，且檢測殺螟硫磷靈敏度較低[17,18,34]?；诒狙芯恐苽涞臍⒚蛄准{米抗體所建立的免疫分析方法在特異性檢測殺螟硫磷方面更具有優(yōu)勢。

表1 icELISA檢測殺螟硫磷結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)Table 1 Cross reaction of analogue of fenitrothion detection using icELISA

2.5 樣品添加回收

大白菜、生菜、橘子樣品提取液經(jīng)過QuEChERS凈化后，為了簡化前處理步驟、縮短檢測時(shí)間，不經(jīng)過氮吹復(fù)溶，直接用PBS稀釋后進(jìn)行ELISA檢測。經(jīng)稀釋倍數(shù)優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，三種蔬菜水果樣品提取液稀釋20倍后標(biāo)準(zhǔn)曲線（◆）與PBS標(biāo)曲（■）基本重合，而稀釋2、5、10倍后的樣品稀釋液標(biāo)曲與PBS標(biāo)曲重合度差，會(huì)影響樣品中殺螟硫磷定量效果，因此確定20倍稀釋為消除基質(zhì)效應(yīng)的最小稀釋倍數(shù)。檢測線性范圍為12~138 μg/kg，既可通過增大樣品稀釋倍數(shù)來滿足國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763-2019中規(guī)定的500 μg/kg最大限量標(biāo)準(zhǔn)的檢測，也能滿足部分國家地區(qū)更嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)限量檢測要求。

在樣品中添加低中高三個(gè)水平的殺螟硫磷標(biāo)準(zhǔn)藥物，采用上述的前處理方法處理樣品，ic-ELISA檢測樣品中的殺螟硫磷，結(jié)果如表2所示，三種果蔬樣品的回收率在88.9%~117.4%之間，變異系數(shù)（CV）值在6.2%~16.3%之間，說明方法準(zhǔn)確性較高，誤差在可接受范圍。

表2 幾種蔬菜水果樣品添加回收實(shí)驗(yàn)Table 2 Additive recovery experiment of vegetable and fruit samples

圖4 基質(zhì)效應(yīng)的消除Fig.4 Elimination of matrix effect

3 結(jié)論

本研究報(bào)道了一種抗殺螟硫磷生物素化納米抗體的制備方法及其在免疫分析方法的應(yīng)用。相對于傳統(tǒng)單克隆或多克隆抗體，納米抗體在穩(wěn)定性及批量制備等方面具有較好的優(yōu)勢。通過定向生物素化，可以避免化學(xué)方法生物素化帶來的批間差異大、性能不均一等問題，解決后續(xù)應(yīng)用存在方法穩(wěn)定性較差等問題?；谏锼鼗{米抗體建立的殺螟硫磷間接競爭ELISA方法，靈敏度高，因此樣品前處理可以采用簡單的稀釋法來消除干擾，免去復(fù)雜的樣品凈化過程。綜上所述，本文建立的及與生物素化納米抗體的殺螟硫磷免疫分析方法具有靈敏度高、可靠性好、操作簡便等特點(diǎn)，可作為食品中殺螟硫磷殘留快速篩查的工具。