崔麗娜 劉吉強(qiáng) 王立靜 王明友 董樹亭

(德州學(xué)院1，德州 253000)(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，泰安 271018)

玉米是我國主要糧食作物之一，是制造淀粉的重要原料之一[1]。淀粉占玉米籽粒干質(zhì)量的70%左右，主要以淀粉粒的形式存在于籽粒胚乳中[2-4]。淀粉是玉米籽粒的主要成分，其數(shù)量直接影響玉米的產(chǎn)量[5-8]。淀粉粒的形態(tài)、分布及積累是決定玉米產(chǎn)量與品質(zhì)的重要因素之一[9,10]。種植密度是影響玉米籽粒淀粉含量的重要因素之一[11-12]。前人對玉米籽粒淀粉粒的研究多集中在胚乳淀粉粒的分布、發(fā)育及肥料對玉米籽粒淀粉粒的影響等方面[13-16]，而對于種植密度對籽粒淀粉粒的影響研究較少[11]。本實(shí)驗(yàn)以鄭單958為實(shí)驗(yàn)材料，利用激光衍射粒度分析儀、透射電子顯微鏡等儀器，通過直觀的方式來研究不同種植密度對夏玉米胚乳細(xì)胞淀粉粒分布及形態(tài)的影響。

1 材料與方法

1.1 供試原材料及設(shè)備

供試玉米品種為鄭單958。河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所用“鄭58”作母本，“昌7-2”作父本配組育成的雜交玉米品種。

供試土壤類型為簡育濕潤淋溶土。

實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備為：3K30高速冷凍離心機(jī)，UV-2450紫外分光光度計(jì)，JEM-1200EX透射電子顯微鏡，JSM-660LV掃描電鏡，JEM-1200EX型透射電鏡，LSl3320激光衍射粒度分析儀，LKB-7800型超薄切片機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)于2017、2018年在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)基地玉米科技園進(jìn)行，為玉米連作區(qū)。該地位于東經(jīng)117°9′，北緯36°9′，屬暖溫帶大陸性半濕潤季風(fēng)氣候區(qū)。田間實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：每年的6月17號播種，分為三個種植密度：低密度45 000株/公頃(D1)、中密度75 000株/公頃(D2)、高密度105 000株/公頃(D3)。采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。重復(fù)3次，小區(qū)面積為6 m×10 m=60 m2。實(shí)驗(yàn)地土壤質(zhì)地為壤土，0～20 cm土壤基本理化性狀：土壤pH 7.60，全碳12.39 g/kg，全氮1.02 g/kg，堿解氮79.32 mg/kg，速效磷74.21 mg/kg，速效鉀92.36 mg/kg?；适?fù)合肥(N-P-K：16%-16%-16%)300 kg/hm2，大喇叭口期追施尿素675 kg / hm2，田間管理同高產(chǎn)田。實(shí)驗(yàn)期間玉米生長發(fā)育正常。

1.3 方法

1.3.1 籽粒淀粉粒提取及測定

參照Peng等[17]、Ji等[18, 19]及Malouf等[20]的方法提取淀粉粒。取成熟期人工授粉的玉米籽粒15粒(穗中部)在40 mL濃度為0.5 mol/L的NaCI溶液中浸泡16 h后，剝?nèi)シN皮，去掉胚，在研缽中研成勻漿，再用200 μm篩布過濾，固體部分繼續(xù)研磨過濾，重復(fù)3次。將淀粉勻漿在4 000 r/min離心5 min，去上清液，加25 mL濃度為2 mol/L的NaCl，旋渦混合，在4 000 r/min再離心，去上清液，然后分別加2%SDS、2%NaOH溶液及蒸餾水，勻漿后再離心，重復(fù)4次，再用丙酮清洗1次，然后風(fēng)干，貯存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

參照Massaux等[21]方法測定淀粉粒分布，用激光衍射粒度分析儀分析淀粉粒。準(zhǔn)確稱取50 mg淀粉放入離心管，加10 mL蒸餾水懸浮，旋渦混勻后置4 ℃下1 h，每10 min振蕩1次，然后轉(zhuǎn)移至激光衍射粒度分析儀的分散盒中，測量其分布狀況。

1.3.2 淀粉粒透射電鏡觀測

取人工授粉的玉米(授粉后20 d)穗中部籽粒15粒，切取籽粒頂部，橫切面用4%戊二醛前固定，磷酸緩沖液沖洗。再用1%鋨酸固定，乙醇梯度脫水。Epon-812(環(huán)氧樹脂)浸透與包埋。瑞典LKB-7800 型超薄切片機(jī)切片，切片厚0.6 μm。部分材料重新建斷層后噴金屬粉，利用JSM-660LV掃描電鏡觀察照相。部分材料在定位后用醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙重染色，在JEM-1200EX 型透射電鏡下觀察照相，研究淀粉粒超微結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)處理和分析

采用EXCEL2000及DPS9.50數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米籽粒淀粉粒分布特征

由圖1可知，不同種植密度玉米籽粒淀粉粒的體積分布及表面積分布均為三峰曲線，數(shù)目分布為雙峰曲線。根據(jù)體積分布、表面積分布及數(shù)目分布的峰值將粒徑分界點(diǎn)設(shè)置為2、15 μm。

圖1 不同種植密度玉米籽粒淀粉粒體積、表面積及數(shù)目分布圖

由表1可知，粒徑大于15 μm淀粉粒所占體積最大，其次為2～15 μm，最小為小于2 μm；粒徑小于2 μm淀粉粒所占表面積及數(shù)目最大，其次為2～15 μm，最小為大于15 μm。

表1 玉米籽粒淀粉粒體積、表面積及數(shù)目占比/%

由表2可知，淀粉粒的粒徑下限一致，均為0.38 μm，上限D(zhuǎn)1>D2>D3；體積、表面積及數(shù)目均值：D2>D3>D1。

表2 玉米籽粒淀粉粒分布特征/μm

2.2 玉米籽粒淀粉粒掃描圖

將籽粒胚乳深層細(xì)胞掃描觀察并照相，對比不同種植密度籽粒淀粉粒的差異(圖2)。處理D1淀粉粒大多為球體，大小均勻，排列整齊緊密，其他物質(zhì)含量較少；處理D2淀粉粒大多為球體，大小不均勻，排列整齊緊密，其他物質(zhì)含量多；處理D3淀粉粒大多為多面體或球體，凹陷淀粉粒較多，大小不均勻，排列較緊密，其他物質(zhì)含量豐富。

圖2 不同種植密度處理玉米籽粒淀粉粒掃描圖(O∶×600；I∶×1 500)

2.3 玉米籽粒淀粉粒透射圖

由圖3可知不同種植密度對玉米籽粒胚乳淀粉粒發(fā)育的影響。

注：1-胚乳由外而內(nèi)的第一層細(xì)胞即糊粉層細(xì)胞；2-第二層細(xì)胞；3-第三層細(xì)胞。圖3 玉米淀粉粒透射圖(×2 500)

低密度處理的胚乳第一層細(xì)胞中的質(zhì)體多數(shù)已發(fā)育完好，液泡中大多數(shù)含有一個蛋白質(zhì)體或者一至三個淀粉粒，淀粉粒幾乎充滿整個質(zhì)體，形狀較規(guī)則，多呈圓形或橢圓形，第一層細(xì)胞中除脂體的數(shù)量更為豐富外，其細(xì)胞淀粉粒的發(fā)育狀況均優(yōu)于中、高密度。高密度下，蛋白質(zhì)體大且多，其發(fā)育遲于中低密度。中密度下，脂體含量較多，蛋白質(zhì)體含量較少，液泡少。三個密度第一層細(xì)胞均為方形或者是長方形，形狀規(guī)則。

第二層細(xì)胞淀粉粒發(fā)育早于第一層細(xì)胞。這主要體現(xiàn)在以下方面：第一，第二層細(xì)胞已不見蛋白質(zhì)體；第二，脂體的數(shù)量變多，體積變小，淀粉粒質(zhì)體已發(fā)育完全至淀粉粒，體積比第一層淀粉粒大。

第三層細(xì)胞淀粉粒發(fā)育早于第二層細(xì)胞。這主要體現(xiàn)在淀粉粒比第二層的淀粉粒更大，淀粉粒出現(xiàn)更多的褶皺；脂體變得更小，更分散。淀粉粒均集中在細(xì)胞核附近。第三層細(xì)胞多為細(xì)長形。

更深層的細(xì)胞的發(fā)育早于第三層細(xì)胞。這主要體現(xiàn)在淀粉粒出現(xiàn)了不同的褶皺花紋。褶皺花紋的數(shù)量中密度最多，低密度與高密度相似。中低密度淀粉粒剖面多為圓形或者橢圓形，形狀規(guī)則，而高密度下，胚乳深層淀粉粒剖面多為橢圓形或者多邊形，少數(shù)為圓形，形狀不規(guī)則。脂體的排列均在淀粉粒周圍及沿細(xì)胞壁排列。

3 結(jié)論

不同種植密度玉米籽粒淀粉粒的體積分布及表面積分布均為三峰曲線，數(shù)目分布為雙峰曲線。粒徑大于15 μm淀粉粒所占體積最大，其次為2～15 μm，最小為小于2 μm；粒徑小于2 μm淀粉粒所占表面積及數(shù)目最大，其次為2～15 μm，最小為于15 μm。不同種植密度淀粉粒的粒徑下限一致，上限不同；不同種植密度籽粒淀粉粒體積、表面積及數(shù)目均值存在差異。中、低密度籽粒淀粉粒大多為球體，低密度籽粒淀粉粒大多為多面體，凹陷淀粉粒較多，其他物質(zhì)含量豐富。不同種植密度籽粒淀粉粒的發(fā)育、外形、排列以及其他質(zhì)體的形態(tài)都存在較大差異，這也是不同種植密度籽粒淀粉含量差異的重要原因之一，而通過不同層次細(xì)胞淀粉粒發(fā)育來看胚乳淀粉粒發(fā)育是由內(nèi)至外。